土壤中微生物

土壤中微生物的纯化与分离

一、前言

土壤是微生物的良好生境，土壤中有多种类群的微生物，它们对自然界物质的转化和循环起着极为重要的作用，对农业生产和环境保护有着不可忽视的影响。根际微生物与植物的关系特别密切，不同的土壤和植物对根际微生物产生显著影响，而不同的根际微生物由于其生理活性和代谢产物的不同，也将对土壤肥力和植物营养产生积极或消极的作用。土壤微生物不仅对土壤的肥力和土壤营养元素的转化起着重要作用，而且对于进入土壤中的农药及其他有机污染物的自净、有毒金属及其化合物在土壤环境中的迁移转化等都起着极为重要的作用。

二、实验方法

（1）实验器材 1.培养基

①牛肉膏蛋白胨培养基配方：牛肉膏2.0g，蛋白胨4.0g，NaCl 2g，琼脂8g，水400mL。 ②高氏一号培养基配方：可溶性淀粉8g，硝酸钾0.4g，磷酸氢二钾0.2g，硫酸镁0.2g，氯 化钠0.2g，硫酸亚铁0.004g，琼脂8g，水400mL。

③酵母浸出粉胨葡萄糖培养基：酵母浸出粉4g，蛋白胨8g，葡萄糖8g，琼脂8g。 ④酵母浸出粉胨蔗糖培养基：酵母浸出粉4g，蛋白胨8g，蔗糖8g，琼脂8g。 2.仪器以及其他用品

高压灭菌锅，纯净工作台，无菌培养皿，移液器，电子天平，250mL三角锥形瓶，250mL烧杯，药勺，试管，玻璃珠，接种环，酒精灯，称量纸。

（2）实验原理

1 微生物的分离纯化原理

自然条件下的微生物往往是不同种类微生物的混合体。为了研究某种微生物的特性或者要大量培养和使用某种微生物，必须从这些混杂的微生物群落中获得纯培养，这种获得纯培养的方法称为微生物的分离与纯化。 在自然界中，上壤是微生物生活的良好环境，其中生活的微生物数量和种类都是极其丰富的。土壤中的微生物数量与种类非常多,在通气良好的花园土中，好气性微生物占有绝对优势。本实验以花园土为材料分离土壤中的好气性细菌.

分离微生物常用的方法有稀释平板分离法和划线分离法，根据不同的材料，可以采用不同方法，其最终目的是要在培养基上出现欲分离微生物的单个菌落，必要时再对单菌落进一步分离纯化。在用稀释平板法分离微生物时，还可以同时测定待分离的微生物的数量。 2 微生物的培养特征原理 ①微生物的菌落特征

在固体平板培养基上，单个微生物细胞或孢子生长繁殖可以形成一个具有特定形状的菌落。在一定的培养基上和一定培养条件下，微生物的菌落特征是稳定的，因此通过菌落的观察可以识别细菌、放线菌、酵母菌和霉菌等几大类微生物。菌落的基本特征包括菌落形状、大小、边缘、隆起度和颜色等。

②微生物的培养特征是指微生物培养在培养基上所表现出来的群体形态和生长情况。一般可用斜面，液体和半固体培养基来检验不同微生物的培养特征。它们培养在斜面培养基上，可以呈丝线状，刺毛状， 串珠状，舒展状，树枝状或假根状。生长在液体培养基内，可以呈浑浊,絮状，黏液状，形成菌膜。上层清晰而底部显沉淀状，穿刺接种在半固体培养基中，可以沿穿刺线向四周蔓延；或仅沿穿刺线生长，也可上层生长得好，甚至连成一片，底部很少生长；或底部长的好,上层甚至不生长。

（3）实验流程

土壤取样→培养基的制备→灭菌→微生物的分离

（4）实验步骤 1.土壤的取样

在校门旁的小山上随机选点取样，把采到的土壤装进取样袋后直接带回实验室待用。 2.培养基的制备

分4个小组分别按配方配置牛肉膏蛋白胨培养基、高氏一号培养基、酵母浸出粉胨葡萄糖培养基、酵母浸出粉胨蔗糖培养基。每种培养基配置400mL，在分装至两个250mL的三角锥瓶中。 3.灭菌

将配置好的培养基，用报纸包扎好的培养皿，用橡胶塞封好的盛有9mL无菌水的试管和装有45mL水与20粒玻璃珠的三角锥瓶，玻璃珠放到高压灭菌锅进行高温蒸汽灭菌。 4.微生物的分离

①倒平板 取出灭菌后的牛肉膏蛋白胨培养基、高氏一号培养基、酵母浸出粉胨葡萄糖培养基以及酵母浸出粉胨蔗糖培养基，待冷却至不烫手的温度时进行倒平板。每种培养基倒10个培养基。

②制备土壤稀释液 称取土样5g，放入盛45mL无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶中，震荡约

-1

20min，使土样与水充分混合，将菌分散，配置乘10土壤溶液。用 lmL移液器，吸取10-1稀释液lmL，移入装有9mL无菌水的试管中，振荡，让菌液混合均匀，即成10-2稀释液；再换一支无菌吸头吸取10-2稀释液lmL，移入装有9mL无菌水的试管中，振荡，即成10-3稀释液；以此类推，连续稀释，制成 10-2、10-3、10-4、10-5、10-6等一系列稀释菌液。 ③接种 用两只1mL无菌吸管分别由10-5和10-6两管土壤稀释液中个吸取200μL放入牛肉膏蛋白胨两个平板，加入八个灭菌的玻璃珠，轻轻晃动，涂布均匀，然后将玻璃珠倒出。重复上述操作，取10-4、10-5土壤稀释液到两个酵母浸出粉胨蔗糖培养基，取10-3、10-4土壤稀释液到两个高氏一号培养基中，取酵母培养液到酵母浸出粉胨葡萄糖培养基中。将倒好的平板倒置于恒温箱中培养1~3d。

④挑菌 使用接种环从待纯化的菌落中蘸取少量菌种，细菌接种在牛肉膏蛋白胨培养基上、霉菌接种在酵母浸出粉胨蔗糖培养基上、酵母菌接种在酵母浸出粉胨葡萄糖培养基中、放线菌接种在高氏一号培养基上进行划线分离。

连续划线分离：在近火焰处啊，左手拿皿底，右手拿接种环，挑使用接种环，从待纯化的菌落或待分离的斜面菌种中挑取少量菌样，在相应培养基平板划线分离（如图），划线的方法多样，目的是获得单个菌落。

⑤显微观察

三、实验结果

(1) 各培养基上菌的生长情况

接种后的各种菌菌落

①牛肉膏蛋白胨培养基——细菌

②酵母浸出粉胨葡萄糖培养基——酵母菌

③酵母浸出粉胨蔗糖培养基——霉菌

④高氏一号培养基——放线菌（放线菌的生长速度比较慢，这是接种后三天所拍摄的照片）

划线分离后各种菌菌落图

①牛肉膏蛋白胨培养基——细菌

②酵母浸出粉胨葡萄糖培养基——酵母菌

③酵母浸出粉胨蔗糖培养基——霉菌

④高氏一号培养基——放线菌

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