环境工程微生物实验 - 图文

第一章 微生物学实验常识 第一节 微生物实验操作常识

环境工程微生物学实验课的目的是：训练学生掌握微生物学最基本的操作技能；了解微生物学的基本知识；加深理解课堂讲授的某些微生物学理论。同时，通过实验，培养学生观察、思考、分析问题和解决问题的能力以及实事求是、严肃认真的科学态度以及勤俭节约、爱护公物的良好作风。

一、实验过程中注意事项

1．每次实验前必须对实验内容进行充分预习，以了解实验的目的、原理和方法，做到心中有数，思路清楚。

2．认真及时做好实验记录，对于当时不能得到结果而需要连续观察的实验，则需记下每次观察的现象和结果，以便分析。

3．实验室内应保持整洁，勿高声谈话和随便走动，保持室内安静。

4．实验时细心仔细，全部操作应严格按操作规程进行，万一遇有盛菌液试管或瓶不慎打破、皮肤破伤或菌液吸入口中等意外情况发生时，应立即报告指导教师，及时处理，切勿隐瞒。

5．实验过程中，切勿使酒精、乙醚、丙酮等易燃药品接近火焰。如遇火险，先关掉火源，再用湿布或砂土掩盖灭火，必要时用灭火器。

6．使用显微镜或其他贵重仪器时，要求细心操作，特别爱护。对消耗材料和药品等要力求节约，用毕后仍放会原处。

7．每次实验完毕后，必须把所用仪器抹净放妥，将实验室收拾整齐，擦净桌面，如有菌液污染桌面或其他地方时，可用3%来苏尔液或5%石炭酸液覆盖其上半小时后擦去，如系芽孢杆菌，应适当延长消毒时间。凡带菌之工具（吸管、玻璃刮棒等）在洗涤前须先消毒（浸泡在3%来苏尔液中）。

8．每次实验须进行培养的材料，应标明自己的组别及处理方法，放于教师指定的地点进行培养。实验室中的菌种和物品等，未经教师许可，不得携出室外。

9．每次实验的结果，应以实事求是的科学态度填入报告内容中，力求简明准确，及时汇交教师批阅。

10．离实验室前应将手洗净，注意关闭门窗，灯、火、煤气等。

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二、接种室

在微生物工作中，菌种的接种移植是一项主要操作，这项操作的特点就是要保证菌种纯，防止杂菌的污染。在一般环境的空气中，由于许多尘埃和杂菌，对接种工作干扰很大，很易污染。因此，接种工作要在空气经过灭菌的环境里进行，小规模的可利用接种箱，大规模的则在接种室里操作，也可在超净工作台中操作。

（一）接种室内设备和用具

接种室内的工作台，不论是什么台面，都要求表面光滑和水平。光滑是便于用消毒药剂擦洗；水平是在倒琼脂平板时可以保证培养皿内平板的厚度一致。

在接种室（或超净工作台）安装一个紫光灯。接种室内的紫光灯，可吊在经常工作的座位的正上方。

缓冲室内应有专用的工作服、鞋、口罩、盛有来苏儿水的瓷瓶和毛巾、手持喷雾器和5％石炭酸溶液等。

接种室内有酒精灯、常用接种工具、不锈钢制的刀、剪、镊子、70％的酒精棉球、工业酒精、载玻片、记录本、标签纸、废物筐等。

（二）接种室的灭菌消毒

1．熏蒸灭菌：接种室使用时间较长，污染比较严重，应进行熏蒸灭菌。可用甲醛、乳酸或硫磺熏蒸。熏蒸前应将接种室清扫干净，打开通气窗通风干燥。这是接种室彻底灭菌的措施。

2．石炭酸喷雾：在每次接种前，用5％石炭酸喷雾，可促使空气中微粒及杂菌沉降，防止桌面、地面上微尘飞场，并有杀菌作用。

3．紫外线照射：有条件时在每次接种前，应开启紫外线灯，照射半小时以上（一般不必超过一小时），有较好的杀菌效果。

（三）接种室工作程序

1．每次使用前半小时，接种室和缓冲室内用5％石炭酸喷雾。有紫外线灯时可照射半小时。

2．用肥皂洗手。把所需器材搬入缓冲室。换上经常灭菌的工作服、工作帽和工作鞋（旧的衣帽鞋洗干净后灭菌即可），戴好口罩，然后用2％煤酚皂液将手浸洗2min。

3．将各种需用物品般进接种室，按一定位置放好。检查是否齐备。用5％石炭酸重点在工作台面上方和附近地面上喷雾，然后退回隔离室，稍停几分钟，再进接种室工作。

4．接种操作前用70%酒精棉球擦手，进行无菌操作时，要严格认真，动作要轻

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缓，尽量减少空气波动，如二人操作，要相互配合好。工作时用完的火柴、废纸等，不要仍在地上，应丢道废物桶内。

5．工作结束后，立即将台面收拾干净，将不应在接种室存放的物品和废弃物全部拿出接种室，然后用5%石炭酸全面喷射，开紫外线灯照射半小时。

6．工作中应主要安全。如遇棉塞着火，用手紧握即可熄火，如来不及时，应用湿布扑灭，切勿用嘴吹，以免扩大燃烧；如遇有菌培养物洒落或打碎有菌容器时，应用抹布沾5％石炭酸收拾到废物桶内并擦拭台面或地面，用酒精棉球擦手后再继续操作。

（四）接种室空气污染情况的检验

接种室应定期进行空气污染情况的检验，其目的是了解接种室灭菌效果，另外是了解在操作过程中操作行动对空气的污染影响，以便有的放矢地及时改进灭菌措施和操作方法。

1．检验方法

（1）平板检验法：用培养微生物主要类群的常规培养基，如肉汤琼脂、淀粉琼脂、土豆琼脂，分别倒成平板，每种两个，都放入接种室内。检验时，按无菌操作各将其中一个平板的盖子打开，经过预定时间后再行盖好，另外一个不开盖子的作为对照，一起放入30℃环境培养，48h后检验有无菌落生长。

（2）斜面培养法

将常用的琼脂斜面（与上相同）各取2管，放入接种室。按无菌操作各将其中的一管打开棉塞，将棉塞放入灭菌的培养皿内。经过预定时间后，再将棉塞通过火焰塞好试管。连同对照一起培养，48h后检验有无杂菌生长。

2．检验方法

（1）空气灭菌后的检验：接种室用甲醛或其它药剂熏蒸后，在开始使用前半小时或一小时打开培养皿盖子，至使用接种室时盖好。其目的是为了检验接种室内空气灭菌的效果。

（2）操作过程中空气污染情况的检验：为了检验在使用接种室的过程中，由于人员的进出、器材的搬放、接种操作的动作等原因造成的空气污染的情况，可在淮备工作结束后接种操作开始时打开盖子，经5分钟、30分钟或直到工作结束时再盖好，以检验在不同的使用时间内空气污染的程度。

（3）紫外线灭菌效果的检验：接种室用紫外线灯照射后，可在不同高度和不同位置用琼脂平板检验空气中的杂菌，以判断紫外线的灭菌效果。必要时应调整照射时间或紫外线灯的高度。

3．检验结果分析：检验用的平板或斜面，在30℃培养48h后，检验是否长有菌落、菌落数量、并由菌落形态判断杂菌的种类。一般要求平板开盖5分钟者应不超过3个菌落；

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斜面开塞30分钟者应不长菌落为合格。从空气中杂菌的种类可以考虑采取有效措施，增进灭菌效果。如霉菌较多，可先用5％石炭酸灭菌后，再用甲醛熏蒸；如细菌较多时，可采用乳酸与甲醛交替熏蒸的办法。

第二节 实验室常用显微镜

自从17世纪荷兰人列文虎克发明了显微镜后，人类才第一次看见了细菌。本世纪30年代，电子显微镜的问世，人类才真正地揭示了微观世界的奥妙，不但看到了细胞的亚显微结构，而且也弄清了超微生物－病毒的真正面目。40年代层析技术的分离和电泳技术的出现和兴起，大大地推动了分子生物学的研究，诸如核酸、酶、蛋白质分子的分离、分析和分子的结构的测定。近几十年来，红外光谱、紫外光谱和质谱、核磁共振波谱等技术的应用和发展，弄清了许多有机分子的结构。随着激光、超导等技术的不断涌现，将把微生物学实验技术推向一个崭新的水平。

一、显微镜

人眼观察物体的能力是有限的。一般情况下，在25cm的明视距离内，人眼只能分辨相距0.1～0.2mm的两个物体。也就是说，当两个物体相距不到0.1mm时，人眼也就把它们看成是一个物体了。这个极限称为人眼的分辨力。由此可知，人眼对小到一定距离的物体，如普通的细菌，就只能是“视而不见”。自从显微镜发明后，变产生了微生物学，它大大地推动了生物科学的发展，使人类从宏观世界走向微观世界。

（一）光学显微镜 1、普通光学显微镜

普通光学显微镜由机械部分和光学系统两大部分所组成。机构部分包括：镜座、镜臂、镜筒、物镜转换器、载物台等；光学部分包括：目镜、物镜、聚光器、反光镜和光源等。

普通光学显微镜的特点：结构简单、操作方便、成像清晰、价格低廉、种类繁多、用途十分广泛。

2、暗视野显微镜

若将普通光学显微镜的聚光器换成暗视野聚光器，就可变为一架暗视野显微镜。从暗视野显微镜目镜中观察，视野全是黑暗的，只有被检物体（细菌）才是明亮的。由于所见到的菌体仅仅是个轮廓，而看不清其内部结构，故只能在观察菌体时使用。

3、荧光显微镜

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荧光显微镜与暗视野显微镜的结构是相同的，只是把普通光源换成一个激发荧光的紫外光源，紫外光光源通常采用高压汞灯。荧光显微镜主要用于科研、教学、医药和微生物等研究工作中。

4、相差显微镜

如果要观察透明的活体微生物，由于光线透过它时光的波长和振幅不发生变化，所以整个视野的亮度是均匀的，因而一般的显微镜不能分辨出微生物细胞的细微结构。若采用相差显微镜即可弥补上述不足。

相差显微镜的结构除了与普通显微镜一样外，所不同的是在聚光器下方插入了一个环状光栏，另有几个安装相板的相差物镜及合轴调整望远镜三个特殊部分。国内常用的有：XSX-1型与XSX-2型相差显微镜（南京江南光学仪器厂产品）。相差显微镜主要用于科研、教学、医疗等部门作细菌学、病理学的研究观察。

5、偏光显微镜

在生物体中，某些组织成分由于光学性质不同，可不经染色，利用偏光来加以区别。偏光显微镜就是利用它的特殊装置－偏光器、检偏器和补偿器等，使在镜检时产生偏光以鉴别细微结构，同时还可以辨别组织中的化学成分，因此可用于组织化学的研究中。

6、紫外光显微镜

该镜是以紫外光为光源。由于被检物体内各种组分对紫外光吸收能力不同，因此，在以紫外光显微镜镜检时，可使未染色的标本容易辨别。同时，又因紫外光的波长比可见光要短一半，从而使它的分辨力增加了两倍，所以能看到用染色方法所看不到的结构。该镜对核酸的研究尤为重要。

（二）电子显微镜

电子显微镜的一切性能都是光学显微镜不能比拟的。光学显微镜的放大倍数只有两千倍，而电子显微镜的放电倍数则为一百多万倍。目前，电子显微镜技术（electron microscopy)已成为研究机体微细结构的重要手段。

常用的有透射电镜（transmission electron microscope，TEM）和扫描电子显微镜（scanning electron microscope，SEM）。与光镜相比电镜用电子束代替了可见光，用电磁透镜代替了光学透镜并使用荧光屏将肉眼不可见电子束成像。

电子显微镜不但放大能力强，而且分辨率高，光学显微镜的分辨率为0.2μm，而电子显微镜的分辨率已达到0.3nm。一般原子的间距大约为0.1nm，因此电子显微镜可以观察到原子世界。这个分辨率比光学显微镜提高了3000多倍。

电子显微镜主要由电子发射源（又称电子枪）、会聚透镜、接物透镜、投射透镜、记录系统、高压电源与低压电源、真空系统等七大部分组成。

1、扫描电镜

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来提高分辨率。

五、显微镜的操作步骤 （一）观察前的准备

1．置显微镜于平稳的实验台上，镜座距实验台边沿约为一寸左右。镜检者姿势端正，一般用左眼观察，右眼便于绘图或记录，两眼必须同时睁开，以减少疲劳，亦可练习左右眼均能观察。

2．调节光源，对光时应避免直射光源，因直射光源影响物像的清晰，损坏光源装置和镜头，并刺激眼睛。如室内光线不足或阴暗天气，可用日光灯或显微镜灯照明。

调节光源时，先将光圈完全开放，升高聚光器至载物台同样高，否则使用油镜时光线较暗。然后转下低倍镜观察光源强弱，调节反光镜，反光镜有凹平面，光线较强的天然光源，宜用平面镜；光线较弱的天然光源或人工光源宜用凹面镜。在对光时，要使全视野内为均匀的明亮度。凡检查染色标本时，光线应强；检查未染色标本时，光线不宜太强。可通过扩大或缩小光圈、升降聚光器、旋转反光镜调节光线。

（二）低倍镜观察

检查的标本须先用低倍镜观察，因为低倍镜视野较大，易发现目标和确定检查的位置。

1．旋转转换器，将低倍镜移到镜筒正下方，和镜筒对直。

2．转动反光镜向着光源处，同时用眼对准目镜仔细观察，使视野亮度均匀。 3．将标本片放在载物台上，用标本夹夹住，移动移动器使观察的目的物置于圆孔的正中央。

4．将粗调节器向下旋转，眼睛注视物镜，以防物镜和载玻片相碰。当物镜的尖端距载玻片约0.5cm处时停止旋转。

5．左眼向目镜里观察，此时可适当的缩小光圈，否则只见光亮一片，难见到目的物。同时将粗调节器慢慢向上旋转，如果见到目的物，但不十分清楚，可用细调节器调节，至目的物清晰为止。

6．如果粗调节器旋得太快，超过焦点，必须从第4步重调，不应正视目镜情况下调粗调节器，以防没把握的旋转使物镜与载玻片相碰撞坏。

7．观察时两眼同时睁开。单筒显微镜应习惯用左眼观察，以便绘图。 （三）高倍镜的观察

1．先用低倍镜观察，发现目的物后再将高倍镜移至视野正中处。

2．旋转转换器换高倍镜，眼睛要在侧面观察，如果高倍镜触及载玻片立即停止旋

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动，说明原来低倍镜就没有调准焦距，目的物并没有找到，要用低倍镜重调。如果调对了，换高倍镜时基本可以看到目的物。若有点模糊，用细调节器调就清晰可见。若视野较暗可适当调节光圈。

3．在视野中找到最适宜于观察的部位，将此部位移至视野中心，准备用油镜观察。 （四）油镜观察

1．如果用高倍镜目的物未能看清，可用油镜。在用油镜观察前，必须先用低倍镜和高倍镜检查标本片，将目的物移到视野正中。

2．将高倍镜移至一侧，在载玻片上标本的镜检部位滴一滴香柏油（或液体石蜡），侧面观察，将油镜移至正中使油镜头浸没在油中，刚好贴近载玻片。应特别注意不能压在标片上，更不能用力过猛，否则不仅压碎玻片，还会损坏镜头。

3．从目镜观察，进一步调节光线，使光线明亮，再用细调节器将镜筒徐徐上升，直至出现清晰物像为止。如油镜已离开油面而仍未见物像，必须再从侧面观察，将油镜降下刚好贴近载玻片，重复操作至物像看清为止。

4．观察细菌的示范片，用铅笔绘出其形态图。

5．观察完毕，上旋镜筒。先用擦镜纸擦去镜头上的油，然后再蘸取少许二甲苯（香柏油溶于二甲苯）擦去镜头上残留油迹，最后再用擦镜纸擦去残留的二甲苯。切忌用手或其它纸擦镜头，以免损坏镜头。用绸布擦净显微镜的金属部件。

6．将各部分还原，反光镜垂直于镜座，将物镜转成八字形，再向下旋。同时把聚光镜降下，以免物镜与聚光镜发生碰撞危险。

六、微生物形态观察 （一）细菌的观察

取细菌观察片，依次用低倍镜、高倍镜，确定适宜的观察视野。然后用油镜观察，并在油镜状态下观察细菌具体形态，并绘制生物图。

（二）酵母菌的观察

酵母菌是多形的、不运动的单细胞微生物，细胞核与细胞质已有明显分化，菌体比细菌较大。繁殖方式也比较复杂：无性繁殖主要是出芽生殖，仅裂殖酵母菌是以分裂方式繁殖；有性繁殖是通过结合产生子囊孢子。用美蓝染色制成水浸片，不仅可观察其外形，而且可以区分死活细胞。

取酵母菌观察片，先用低倍镜，观察酵母菌的基本形态，然后用高倍镜观察细胞内部细微结构。并绘制酵母菌形态图。

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（三）霉菌的观察

霉菌属真核微生物，是丝状真菌的通称，菌丝较粗，分为营养菌丝及气生菌丝。营养菌丝伸入培养基内或匍匐生长在营养基的表面；气生菌丝生长在培养基上方的空气中，长出分生孢子梗和分生孢子。霉菌的菌丝直径约3～10μm，在显微镜下放大100倍清晰可见，放大400倍则细胞内部结构也能看见。多数霉菌的菌丝有隔膜，将菌丝分隔成多细胞。

取霉菌观察片，先用低倍镜，观察霉的基本形态和特点，然后用高倍镜观察细胞内部细微结构。并绘制霉菌形态图。

七、实验结果

分别绘出观察到的标本片的形态，同时注明物镜放大倍数和总放大率。

实验记录表：

微生物形态 细菌的观察 酵母菌的观察 霉菌的观察

观察倍数 微生物形态图 八、思考题

用油镜观察时应特别注意些什么？在载玻片和镜头之间加滴什么油？起什么作

用?

附录 显微镜的保养

显微镜的光学系统是显微镜的主要部分，尤其是物镜和目镜。一架显微镜的机械装置虽好，但光学系统不好，这架显微镜是不会起好作用的。因此，对显微镜要妥善保管。

1．避免直接在阳光下曝晒，因为透镜与透镜之间，透镜与金属之间都是用树脂或亚麻仁油粘合起来的。金属与透镜膨胀系数，受高热因膨胀不均，透镜可能脱离或破

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裂，树脂受高热溶化，透镜也会脱落。

2．避免和挥发性药品或腐蚀性酸类一起存放，碘片、酒精、醋酸、盐酸和硫酸等对显微镜金属质机械装置和光学系统都是有害的。

3．透镜要用擦镜纸擦拭，若仅用擦镜纸擦不净，可用擦镜纸蘸二甲苯擦拭，但用量不宜过多，擦拭时间也不宜过长，以免粘合透镜的树脂被溶化，而使透镜脱落。

4．不能随意拆卸显微镜，尤其使物镜、目镜、镜筒不能随意拆卸，因拆卸后空气中灰尘落入里面引起生霉。机械装置经常加润滑油，以减少因摩擦而受损。

5．避免用手指沾抹镜面，否则会影响观察，沾有有机物的镜片，时间长了会生霉，因此，每使用一次，所有的目镜和物镜都得用擦镜纸擦净。

6．显微镜放在干燥处，镜箱内要放硅胶吸收潮气。目镜、物镜放在盒内并存于干燥器内，以免受潮生霉。

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实验 2 培养基制备与灭菌

一、实验目的

1．熟悉玻璃器皿的洗涤和灭菌前的准备工作。 2．掌握配置和分装培养基的方法 3．掌握高压蒸汽灭菌技术。

二、仪器与材料

1．培养皿（d=90mm）10套；试管（20mm×200mm）10支；移液管（10mL）2支，（1mL）4支；锥形瓶(250mL)2个，（500mL）1个；烧杯（300mL）1个，电炉（800w）1个；玻璃珠30粒；天平；量筒等。

2．纱布、棉花、牛皮纸（或报纸）

3．精密pH试纸6.4～8.4；10％盐酸；10％NaOH； 4．牛肉膏；蛋白胨；氯化钠；琼脂；蒸馏水； 5．高压蒸汽灭菌锅；烘箱；酒精灯；

吸管 图8-1吸管的包扎 牛皮纸或报纸 三、实验原理

培养基是按照微生物生长繁殖所需要的各种营养物质，用人工方法配制而成的营养基质。其中含有碳源、氮源、无机盐、生长因素以及水份等。微生物在培养基上生长繁殖还必须在最适酸碱度范围内才能表现它们最大生命活力，因此对不同种类的微生物应将培养基调节到一定的pH值范围。培养基的种类很多，不同的微生物所需要的培养基不同，就它们的物理性状来分，可分为液体的、固体的和半固体的三种。固体培养基是在液体培养基中加入1.5～2％的琼脂，半固体培养基是加入0.2～0.5％的琼脂。

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四、操作步骤

(一)玻璃器皿的洗涤和包装 1．洗涤

玻璃器皿在使用前必须洗涤干净。培养皿、试管、锥形瓶等可用洗衣粉加去污粉洗刷并用自来水冲净。移液管先用洗液浸泡，再用水冲洗干净。洗刷干净的玻璃器皿自然晾干或放人烘箱中烘干、备用。

2．包装

（1）将移液管放在4-5 cm宽的长纸条的一端，移液管与纸条约成30°夹角，折叠包装纸包住移液管的尖端(如图8-1)，用左手将移液管压紧，在桌面上向前搓转，纸条螺旋式地包在移液管外面，余下纸头折叠打结。按实验需要，可单支包装或多支包装，待灭菌。

（2）用棉塞将试管管口和锥形瓶瓶口部塞住

棉塞可过滤空气，防止杂菌侵入并可减缓培养基水分的蒸发，故在微生物工作中一直普遍使用。

棉塞的制作（见图8-2和图8-3）：按试管口或锥形瓶口大小估计用棉量，将棉花铺成中心厚，周围逐渐变薄的圆形或方形，对折后卷成卷，一手握粗端，将细端塞入试管或锥形瓶的口内，棉塞不宜过松或过紧，用手提棉塞，以管、瓶不掉下为准。棉塞四周应紧贴管壁和瓶壁，不能有皱折，以防空气微生物沿棉塞皱折侵入。棉塞插入2/3，1/3留在管口(或瓶口)外，便于拔塞。试管、锥形瓶塞好棉塞后，用牛皮纸包并用

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图8-2 棉塞 （a）正确 （b）、（c）不正确 细绳或橡皮筋捆扎好放在铁丝或铜丝篓内待灭菌。

（3）培养皿由一底一盖组成一套，用牛皮纸或报纸将10套培养皿(皿底朝里，皿

图8-3 棉塞制作过程 盖朝外，5套、5套相对)包好。

（二）培养基的配置过程

1．称量：按照培养基配方，准确称取各成份放于烧杯中。

2．熔化：向上述烧杯中加入所需要的水量，搅匀，然后加热使其熔解，如是配制固体培养基，在琼脂熔化的过程中，需不断搅拌，并控制火力不要使培养基溢出或烧焦。待完全熔化后，补足所失水份。如果配方中含有淀粉，则需先将淀粉用少量冷水调成糊状并在火上加热搅拌然后加足水份及其

图8-4 培养基的分装 他药品，待完全熔化后，补足所失水份。

3．调pH值：初制备好的培养基往往不能符

合所要求的pH值，故需用pH试纸或酸度计矫正．用10%NaOH或10%HCl调pH至所需范围。

4．过滤：用滤纸或多层纱布过滤，一般无特殊要求的情况下，这一步可以省去。 5．分装：根据不同的需要，可将制好的培养基分装入试管内或三角瓶内，管(瓶)口塞上棉塞。分装装置如图8-4。注意不要，使培养基沾染在管（瓶）口上以免浸湿棉塞，引起污染。（注：本实验固体培养基采用灭菌后分装）

（1）液体：分装高度以试管高度的1/4左右为宜。

（2）固体：分装试管，其装量为管高的1/5，灭菌后制成斜面（图8-5）。分装

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三角瓶的容量以不超过三角瓶容积之一半为宜。

（3）半固体：分装试管一般以试管高度的1/3为宜，灭菌后，垂直待凝成半固体深层琼脂。

6．灭菌：培养基分装好了以后，塞上棉塞，外面再包一层牛皮纸，便可进行灭菌。培养基的灭菌时间和温度，需按照各种培养基的规定进行，以保证灭菌效果和不损培养基的必要

图8-5 摆斜面 温室培养24小时，无菌生长者方可使用。

（三）无菌水或稀释水的制备

取500mL锥形瓶盛有200mL自来水或蒸馏水，瓶口用棉塞塞好，并用牛皮纸包扎紧。高压蒸汽灭菌即可。使用时用灭菌的吸管吸取。

（四）、配制培养基的配方

根据实验需要选择下列配方，其它培养基的配方参看附录。 1．肉汤蛋白胨培养基

牛肉膏 3g；蛋白胨 10g；NaCl 5g；琼脂 20g；蒸馏水1000mL；pH 7.0～7.2； 灭菌：1.05kg/cm2；温度121℃；维持20min。

2．查氏培养基

NaNO3 2g；MgSO4 0.5g；琼脂 20g； K2HPO4 1g；FeSO4 0.01g；蒸馏水 1000mL；KCl 0.5g；蔗糖 30g；pH 自然 灭菌：0.7kg/cm2；时间：20min。

3．淀粉琼脂培养基（高氏一号）

可溶性淀粉 20g；FeSO4 0.5g；KNO3 1g；琼脂 20g；NaCl 0.5g；K2HPO4 0.5g； MgSO4 0.5g；蒸馏水 1000Ml； pH 7.0~7.2 灭菌：1.05kg/cm2；时间：20min。 （五）灭菌

灭菌与消毒二者含意不同，前者是指杀死或消灭一定环境中的所有微生物；后者是指消灭病源菌或有害微生物而言。灭菌与消毒的方法很多，但总的可以分为物理法和化学法两大类。物理的方法包括加热灭菌(湿热灭菌、干热灭菌)，过滤除菌、紫外线灭菌等。化学的方法主要是利用有机或无机的化学药品对实验室用具和其他物体表

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成份。培养基经灭菌后，必须放37℃

面进行灭菌与消毒。下面分述各灭菌消毒方法的基本原理及操作步骤。

1.紫外线灭菌：

紫外线灭菌是用紫外灯管进行的。波长为200～300nm的紫外线都有杀菌能力，其中以260nm的杀菌力最强。紫外线的杀菌作用主要是因为它诱导了胸腺嘧啶二聚体的形成，从而抑制了DNA复制所致。另一方面，空气在紫外线照射下，可产生臭氧(O3)，臭氧也有一定的杀菌作用。紫外线透过物质的能力很差，所以只适用于空气及物体表面的灭菌，它距照射物以不超过1.2米为宜。

操作方法：

接种室常用紫外光灯作空气灭菌，为了加强紫外线灭菌的效果，在开灯以前，可以在接种室内喷洒石炭酸溶液，一方面使空气中附着有微生物的尘埃降落，另一方面也可以杀死一部分细菌。接种室内的桌面，凳等可用2—3％的来苏尔擦洗。然后再开紫外光照射30分钟左右。紫外线对人体也有伤害作用，所以不能直视开着的紫外灯光，也不能在开着灯的情况下工作。

为了检验紫外线灭菌的效果，可以在灭菌后的接种室内，桌上和桌下各放一套已倾入肉汤蛋白胨培养基的培养皿，把皿盖打开15分钟然后盖上，置37℃培养，如果每个平皿的菌落不超过4个，则可认为灭菌的效果良好，若菌落很多，则需延长照射时间或同时加强其它的措施。

2.加热灭菌

加热灭菌包括湿热和干热两种，湿热灭菌又可分成高压蒸汽灭菌、间歇灭菌、煮沸消毒等，干热灭菌又可分成直接灼烧、恒温干燥箱灭菌等。但无论哪种加热的方法，其基本原理是一样的，即通过不同的加热方法使细菌体内蛋白质凝固变性，而达到杀灭细菌的目的。蛋白质的凝固变性与蛋白质中含水量的多少有关，含水份较多者，其凝固所需要的温度较低，反之，含水份较少者需较高温度才能使蛋白质凝固，因此杀灭芽孢比杀灭营养体所需要的温度高。

在同一温度下，湿热的杀菌效力比干热大，因为在湿热情况下，菌体吸收水份，使蛋白质易于凝固，同时湿热的穿透力强，而且当蒸汽与被灭菌物体接触凝成为水时，又可放出热量，使温度迅速增高，从而增加灭菌效力。

几种加热灭菌的操作方法分述如下。

1）高压蒸汽灭菌 高压蒸汽灭菌是利用高压蒸汽来达到灭菌的目的，其温度在100℃以上，有强大的杀菌能力。灭菌时是用高压蒸汽灭菌锅进行的。微生物实验所需的一切器皿、器具、培养基（不耐高温者除外）等都可用此法灭菌。

高压蒸汽锅是耐一定压力的密闭金属锅，有立式和卧式两种。灭菌锅上附有压力

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表、排气阀、安全阀等。本实验室灭菌锅是电源加热。

其操作方法：

（1）加水： 打开灭菌锅盖，向锅内加入适量的水。或从加水口处加水入锅内。 （2）装锅： 加水后，将待灭菌的物品放入锅内，注意不要放得太挤，以免影响蒸气的流通和灭菌效果。然后关严锅盖，对角式均匀旋紧螺旋，打开排气阀。

（3）点火：打开电源开关，加热。

（4）关闭排气阀：待锅内水沸腾后，则视排气阀排出蒸汽相当猛烈且微带蓝色时，可关闭排气阀。此时蒸汽将锅内冷空气驱净。

（5）升压、升温：关闭排气阀以后，锅内成为密闭系统，蒸汽不断增多，压力计和温度计的指针上升，当压力达到1.05kg/cm2（温度为121℃）即灭菌开始，这时调整火力大小使压力维持在1.05kg/cm215～30min。除含糖培养基用0.56kg/cm2压力外，一般都用1.05kg/cm2压力。

（6）中断热源：达到灭菌时间要求后停止加热，任其自然降压，当指针回到“0”时，打开排气阀（请注意，排气阀不能过早打开，否则培养基因压力突降，温度没下降而使培养基翻腾冲到棉塞处，既损失培养基有玷污了棉塞）。

（7）出锅：排气完毕，即可扭松螺旋柄使锅盖松动。此时应该将锅盖提高1～2cm，并不推开，使用锅内的余热使棉塞、包头纸等烘干。15～20min后。再推开锅盖，取出器物，排掉锅内剩余水。

（8）待培养基冷却后置于37℃恒温箱内培养24h，若无菌生长则放入冰箱或阴凉处保存备用。若是斜面培养基，从锅内取出后立即摆成斜面，待凝后也放于37℃培养，若无菌，保存备用。

高压蒸汽灭菌是应用最广的一种灭菌方法，一般培养基、玻璃器皿以及传染性标本等都可应用此法灭菌。但应用此法灭菌是否彻底的一个重要关键是在压力上升之前，必须先用蒸汽将锅内的冷空气完全驱尽，否则，虽然压力表已指向1.05kg/cm2，但锅内的温度却还只有100℃，结果往往会造成灭菌不彻底。

2）间歇灭菌 有些培养基如明胶培养基、牛乳培养基等因不耐高温，故需用间歇灭菌法。间歇灭菌的温度和时间是100℃，30分钟。这样的温度和时间足以杀死一切细菌的营养体，但是不能杀死芽孢，因此采用此法灭菌是将待灭菌物经第一次灭菌后（100℃、30分钟)，取出置温箱培养，使其中芽孢萌发为营养体，第二日再经100℃，30分钟灭菌，以杀灭发育的营养体。但恐其中仍有芽孢残留，因此第三天再经培养灭菌，以达彻底灭菌。此法可用阿诺氏(Arnold)流动蒸汽灭菌器或普通蒸笼均可，不需加压，所以可普遍使用。但因手续麻烦，时间长，故一般能用高压蒸汽灭菌的均不采用间歇灭菌法。

3）火焰灭菌

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