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超高效液相色谱(UPLC)

超高效液相色谱技术（ultra performance liquid chcromatography，简称UPLC）是一种综合了小颗粒填料、非常低系统体积(死体积)及快速检测手段等全新的检测技术。在全面提升HPLC的速度、灵敏度及分离度的同时，保留其原有的实用性及原理。基于小颗粒技术的UPLC，并非普通HPLC系统改进而成。它不但需要耐压、稳定的小颗粒填料（可达1.7μm），而且需要耐压的色谱系统(>15,000psi)、最低交叉污染的快速进样器、快速检测器及优化的系统体积等诸多方面的保障，以充分发挥小颗粒技术优势。这就需要对系统所有硬件和软件的进行全面创新。世界第一个商品化UPLC产品是Waters ACQUITY UPLCTM 超高效液相色谱系统，它于2004年3月投入市场。

图1：填料技术的沿革

1．小颗粒填料改善分离的理论与科学基础

液相色谱30年的发展史是颗粒技术的发展史。颗粒大小的改变直接影响到柱效，从而对分离结果产生直接影响。由上图可知：随着颗粒度的不断降低，色谱分离度不断提高。事实上，上述规律的理论基础是著名的Van Deemeter方程。Van Deemeter方程是色谱科学家预测颗粒度变化而引起的色谱变化的根本依据。Van Deemeter曲线（见图2）预测最佳柱效与相应的流动相流速。由Van Deemeter方程得知：随着颗粒度减小，相应的理论塔板高度（HETP）也下降，得到的柱效会更高。还应该注意到1.7 μm颗粒的HETP最小值区域扩大了（见图2），这表明可以

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在比大颗粒更宽的流量范围内得到最高的柱效，结果可以不损失高分离度的同时来适当提高流动相的流速（分析速度）。小颗粒填料为色谱分离带来如此的高柱效和速度优势，使得利用小颗粒技术成为色谱科学家梦寐以求的目标。然而HPLC系统的设计，一直难于发挥出最小颗粒的优点。小颗粒技术的运用，不但要求仪器在超出目前限度（6000 psi/ 400 bar）的压力下工作，同时要求仪器系统的死体积要更小，以便不影响梯度性能，而且还要检测器能高速检测出峰宽只有几秒的色谱峰。

在利用杂化颗粒技术合成出耐压的新一代小颗粒色谱填料之后，UPLC超高效液相色谱系统的设计，充分利用了小颗粒填料的所有优点，弥补传统HPLC系统的不足。

图2: 范德米特(van Deemeter)曲线

1.1 超高分离度

根据等度液相色谱分离的分离度(Rs)方程，分离度(Rs)与柱效(N)的平方根成正比。

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k2N1α－Rs = ()()()k2+1……………(1) α4

按Van Deemter色谱理论，柱效(N)与颗粒度(dp)成反比：

LN∝dp…………(2)

故：随着dp的降低，N值会增加；而N值增加，则Rs值增加。HPLC与UPLC的基本分离理论，进一步说明了颗粒度大小和分离度密不可分的关系。

新一代UPLC系统发挥了1.7 μm颗粒提供柱效增高的全部优越性。尤其是1.7 μm颗粒提供的柱效比5 μm颗粒提高了3倍。因为分离度与粒度的平方根成反比，1.7 μm颗粒的分离度比5 μm颗粒提高了70％。在梯度分离中也具有同样的优越性，此时分离能力用峰容量衡量。

UPLC用1.7 μm颗粒提高了分离能力，可以分离出更多的色谱峰（见图3），从而对样品提供的信息达到了一个新的水平。而且又最大地缩短了开发方法所需的时间。图3显示UPLC可以大大提高分离度，同时色谱峰强度也得到了提高。

图3: UPLC与HPLC：分离度比较

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1. 2 超高速度

较小的颗粒能超乎寻常地提高分析速度而不降低分离度。因为颗粒度减小后，柱长可以按比例缩短而保持柱效不变(见式3)，而且Van Deemter理论表明最佳流速与粒度成反比(见式4)。柱长缩短会加快分离速度，而颗粒度越小，最佳流速也越大，进而可以通过提高流速来进一步加快分离速度。

N∝Ldp……（3）

最佳流速∝ ——……..(4)

dp

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由于新一代UPLC系统用1.7 μm颗粒，柱长可以比用5 μm颗粒时缩短3倍而保持柱效不变，而且使分离在高3倍的流速下进行，结果使分离过程快了9倍而分离度保持不变。

1.3 超高灵敏度

过去几年中，提高灵敏度的工作集中在检测器上，包括光学检测器和质谱检测器。这种趋势主要是受要求检测化合物的浓度越来越低（如高效药物）的驱动。然而采用超高性能色谱系统就能获得灵敏度的显著提高。

在UPLC中始终可得到较高的灵敏度。UPLC使用小颗粒技术可以得到更高的柱效（因而改善了分离度）、更窄的色谱峰宽(见式5），即更高的灵敏度。

1…….(5) N∝2W 峰高∝——…..(6)

W 1

峰高∝——……(7)

L

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因为色谱峰变得更窄，峰高也就更高了(见式6)；同样，当UPLC用于快速分析、用较短色谱柱而使柱效不变时，色谱峰高会相应增加 (见式7)。因此，使用UPLC技术，不仅可以在保持与HPLC相同分离度时提高峰高，而且在改善分离度的同时亦可提高峰高即灵敏度。

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图5: HPLC到UPLC：灵敏度的改善无需折衷

1.4 UPLC为最佳的质谱入口

UPLC与质谱联用，可以实质性地改善质谱检测结果的质量。UPLC的特殊性能使质谱检测器的性能首次得以充分体现。

由于低流速下色谱峰扩散不大，增加了峰浓度，有利于提高离子源的效率，因而使灵敏度至少提高了3倍。除UPLC技术本身带来的速度、灵敏度和分离度的改善外，UPLC的超强分离能力有助于待测物与同其竞争电离的杂质的分离，从而可以使质谱检测器的灵敏度因离子抑制现象的减弱或克服而得到进一步的提高。故使用UPLC－MS联用，可以获得灵敏度较HPLC－MS联用系统大有改善的分离结果，获得更多、质量更好的信息。

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