白纹伊蚊_肌动蛋白基因片段的克隆及其作为基因表达内参照的应用

基因克隆

中国病原生物学杂志

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JournalofPathogenBiology

December2007,　Vol.2,　No.6

2007年12月　　第2卷第6期

论著

白纹伊蚊β2肌动蛋白基因片段的克隆及其3

作为基因表达内参照的应用

焦健华1,2,马磊2,张东辉233

(1.南京医科大学第一附属医院消化科,江苏南京210029;2.南京医科大学病原生物学系,

江苏省现代病原生物学重点实验室,江苏南京210029)

【摘要】　目的　获取白纹伊蚊β2肌动蛋白基因序列并探讨其作为基因表达内参照的作用。　方法　根据昆虫β2肌动蛋白核苷酸序列的高度保守区设计引物,通过PCR的方法从白纹伊蚊C6/36β2肌动蛋白基因片段,进一步通过RT2PCR的方法验证其在稳定转染空载体和40SC6/36细胞中的表达。　结果　获得白纹伊蚊β2肌动蛋白基因片段,长91189%以上。在稳定转染空载体和RPS4基因的36。　结论　成功获得了白纹

伊蚊β2肌动蛋白基因片段,。【关键词】　白纹伊蚊;PCR;RT2PCR

【中图分类号】　　A　　　【文章编号】　167325234(2007)0620454203

[JournalofPathogenBiology.2007Dec;2(6):454-456.]

CloningandsequencesofAedesalbopictusβ2actingenefragmentanditsapplicationasaninternalcontrolJIAOJian2hua1,2,MALei2,ZHANGDong2hui2　(1.DepartmentofGastroenterology,theFirstAffiliated

HospitalofNanjingMedicalUniversity,Nanjing210029,China;2.DepartmentofPathogenBiology,NanjingMedicalUniversity;JiangsuProvinceKeyLaboratoryofModernPathogenBiology)

【Abstract】　Objective　ObjectiveToisolateandsequenceAedesalbopictusβ2actingeneandtestitsapplicabilityasanin2

ternalcontrolingeneexpressionstudies.　Methods　Primersweredesignedbasedontheconservednucleotidesequencesofinsectβ2actingenes.AfragmentofAe.albopictusβ2actingenewasamplifiedfromthecDNAofC6/36cells.Theex2pressionlevelsofAe.albopictusβ2actininRPS4genestablytransfectedandcontrolvectortransfectedC6/36cellswerebothdetectedbyRT2PCR.　Results　Afragmentof911bpwasisolatedwhichshowsover89%identitieswiththecor2respondingsequencesofothermosquitoβ2actingenes.ThefragmentwasalsosuccessfullyamplifiedfromRPS4genetransfectedandcontrolvectortransfectedC6/36cells.　Conclusion　Ae.albopictusβ2actingenefragmentwassuccess2fullycloned.Asahousekeepinggene,itcanbeusedasaninternalcontrolingeneexpressionstudies.

【Keywords】　Aedesalbopictus;C6/36cells;β2actingene;PCR;RT2PCR

肌动蛋白(actin)是真核生物中普遍存在,在进化中高度保守的蛋白质家族。它几乎参与了真核细胞的所有生理过程,如细胞分裂、染色体运动、细胞器运动、细胞激化、胞质流动等[1～3]。肌动蛋白有6种不同的β、γ异构体,根据不同的等电点,分别称之为α、2肌动β蛋白。2肌动蛋白作为一种细胞质肌动蛋白,是细胞β骨架的重要组成部分。2肌动蛋白除有基因序列高度保守的特征外,还具有mRNA的表达数量高和表达稳定的特点,它与一些管家基因一样在生物体内持续衡量表达,因而在很多需量化的实验技术,如RT2PCR和Northern杂交中被当作内参照[4～6]。

白纹伊蚊(Aedesalbopictus)是我国登革热和流行性乙型脑炎等虫媒病的重要传播媒介,在我国分布广泛[7,8]。尽管白纹伊蚊相关的分子生物学研究很多,但白纹伊蚊β2肌动蛋白的基因序列至今未见报告。

本实验根据昆虫β2肌动蛋白基因序列的高度保守区设

计引物,通过PCR的方法从白纹伊蚊C6/36细胞中扩增获得白纹伊蚊β2肌动蛋白基因片段,并初步探讨了其作为基因表达内参照的应用。

材料和方法

1　材料

1.1　白纹伊蚊C6/36细胞　白纹伊蚊C6/36细胞

系,购自武汉大学中国典型培养物保藏中心。培养液

3【基金项目】　南京医科大学科技发展基金重点项目(No.

06NMUZ005)。【作者简介】　焦健华(19682),女(汉),江苏人,南京医科大学第一附属医院消化科副主任医师,南京医科大学2005级博士研究生。研究方向:抗药性的分子基础。E2mail:jiaojh1968@3【通讯作者】3　E2mail:iota@njmu.edu.

cn

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为EMEM(含非必需氨基酸)+10%胎牛血清+100

U/ml青霉素和100μg/ml链霉素。培养条件为28℃、5%CO2。1.2　主要试剂　TrizolReagent、Taq酶和胶回收试剂盒购自Tiangen公司;反转录酶M2MLV购自Pro2mega公司;RNA酶抑制剂和随机引物购自TaKaRa公司。

α和pGT1.3　菌种和质粒　感受态大肠埃希菌DH5载体购自Tiangen公司。

1.4　引物　自Genbank获取埃及伊蚊、淡色库蚊、冈比亚按蚊和黑腹果蝇的β2肌动蛋白核苷酸序列,用DNAMAN软件进行序列比对,根据在4个物种内高度保守的核苷酸序列,设计1对扩增白纹伊蚊β2蛋白基因片段的引物,:

Aedesβ2肌动蛋:52CAC2CAGGGTGTGATGGTC′;β2肌动蛋白reverseprimer:5′2CCACCGATCCAGACGGAGT23′。

核糖体蛋白S4(RPS4)基因特异性上游引物和载体特异性HRAS下游引物序列为:

RPS4forwardprimer:5′2GTGGGCTTTCG2CACTCTT23′;HRASreverseprimer:5′2AAGATT2AGCGACGCTGCT23′。引物由上海英骏生物技术有限公司合成。2　方法2.1　总RNA的抽提　使用TrizolReagent根据说明书抽提C6/36细胞总RNA。变性琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性。2.2　白纹伊蚊β2肌动蛋白基因片段的获得　取2μg从C6/36细胞抽提的总RNA,以Randomprimers(9mers)为引物,用M2MLV根据使用说明进行反转录,然后取1μlcDNA为模板扩增β2肌动蛋白基因片段。PCR反应总体积20μl,其中含1×反应缓冲液,1.5mmol/LMgCl2,150μmol/LdNTP,引物各0.5μmol/L,1UTaq酶。PCR反应条件为:94℃5min;94℃30s,58℃40s,72℃50s,共30个循环;72℃延伸10min。1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产

条件为94℃5min;94℃30s,58℃30s,72℃40s,

β共30个循环(2肌动蛋白25个循环);72℃延伸10

min。取8μlPCR产物,1%的琼脂糖凝胶电泳鉴定(120V30min),凝胶成像系统拍照保存。

结　果

1　白纹伊蚊β2肌动蛋白基因片段的克隆

PCR得到约900bp的产物(图1)。割胶纯化后T2A克隆入pGT载体,转入感受态大肠埃希菌,PCR

鉴定,阳性克隆送测序

,911bp的序列(图2)。

M　MarkerDL2000　1　PCR产物

图1　白纹伊蚊β2肌动蛋白基因片段扩增产物电泳图

M　DNAMarker　1　PCRproduct

Fig.1　Electrophoresis

ofPCRproductsofAe.albopictus

β2actingenefragment

(下划线标出的为引物序列)

图2　白纹伊蚊β2肌动蛋白基因911bp片段序列

(Theprimersequenceswereunderlined)

Fig.2　ThenucleotidesequencesofAe.albopictusβ2actinfragment

物,割胶纯化目的片段。

2.3　PCR产物的克隆、鉴定和测序　在T4DNA连

2　白纹伊蚊β2肌动蛋白基因序列分析

接酶作用下,将纯化的DNA片段连接到pGT载体

α,蓝白斑筛选重组中,转化感受态大肠埃希菌DH5

子,PCR鉴定克隆,阳性克隆送Invitrogen公司测序。2.4　RT2PCR鉴定稳定转染RPS4基因的C6/36细胞　分别提取稳定转染pIE123空载体和RPS4基因的C6/36细胞总RNA并反转录为cDNA,PCR鉴定RPS4基因在两组细胞中的表达差异,以白纹伊蚊β2肌动蛋白基因片段为内参照[9]。PCR体系同上,PCR

将911bp的序列与Genbank数据库比对(Blastn),该序列位于β2肌动蛋白基因的开读框内部,其与埃及伊蚊(Aedesaegypti)β2肌动蛋白对应序列的同源性为93%,与淡色库蚊(Culexpipienspipiens)和冈比亚按蚊(Anophelesgambiae)β2肌动蛋白对应序列的同源性为89%。3　白纹伊蚊β2肌动蛋白基因片段作为基因表达内参照的应用

以白蚊伊蚊β2肌动蛋白基因片段为内参照,采用

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RT2PCR的方法鉴定RPS4基因在稳定转染的C6/36

参照基因。

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【收稿日期】　2007201225　【修回日期】　2007205214

细胞内的表达,结果显示:在稳定转染pIE123空载体和RPS4基因的C6/36细胞中均成功扩增出本文所克

隆的白蚊伊蚊β2肌动蛋白基因片段(图3)

。

M　MarkerDL2000　1　稳定转染RPS4基因的C6/36细胞β2ac2tin基因的表达　2　稳定转染pIE123空载体的C6/36细胞β2actin基因的表达　3　稳定转染RPS4基因的C6/36细胞RPS4基因的表达　4　稳定转染pIE123空载体的C6/36细胞RPS4基因的表达图3　RT2PCR鉴定稳定转染RPS4基因的白纹伊蚊C6/36细胞

βM　DNAMarker　1　2actinPCRproductofthecellstransfectedβwithRPS4gene　2　2actinPCRproductofthecellstransfectedh

pIE123vector　3　RPS4PCRproductofthecellsRPS4gene　4　RPS4PCRproductofthecellsthpvector

Fig.3　RT2PCRanalysisof36

cells讨论

细胞浆β2肌动蛋白的mRNA为丰富的转录模板,

并在所有组织中相对衡量、持续表达,因而成为RT2PCR和杂交技术最常用的对照基因。虽然在哺乳动物研究中也常有人采用GAPDH和核糖体等作为内参照[10～12],但作为一种成熟的参照系统,在无脊椎动物分子生物学的研究中β,2肌动蛋白基因仍然是最常用的内参照基因。

本研究克隆的白纹伊蚊β2肌动蛋白基因片段与其他几种蚊β2肌动蛋白基因对应序列的相似性在89%以上,表明β2肌动蛋白基因在生物进化过程中相当保守。在稳定转染空载体和RPS4基因的C6/36细胞中,均稳定地扩增出白纹伊蚊β2肌动蛋白基因片段,提示该基因完全可以作为检测外源基因表达差异时的内(上接459页)

1.3　效果考核　于第1个疗程后的第90d和3个疗程后的140d,复查,蛲虫感染率分别降至11.0%(31/283)和4.6(13/283)。2　结果

稳定。

由于蛲虫生活史简单,生活周期短,且传染源广泛存在,因此,防治效果不易巩固。若能以蛲虫阳性儿童的家庭成员进行治疗并加强卫生知识的宣传和教育,有望取得更佳的防治效果。

【参考文献】

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阿苯达唑组205例,疗前蛲虫感染率为54.1%(111/205)。治疗1疗程后感染率下降至11.7%(24/205),3个疗程后下降至3.9%(8/205)。复方甲苯咪唑组78例,疗前感染率为

73.1%(57/78)。治疗1疗程后感染率下降至9.0%(7/78),3

研究[J].中国寄生虫病防治杂志,1997,4:310.

[2]方悦丽.阿苯达唑驱虫糖治疗蛲虫疗效观察[J].中国寄生虫病防治

个疗程后下降至6.4%(5/78)。

3　讨论

杂志,2001,9:228.

[3]杜尊伟,王学忠,张再兴,等.云南省肠道蠕虫感染现状调查[J].中

以上两种驱虫药儿童均能耐受,且服用方法简便易行,便于推广应用。从防治效果来看,服用阿苯达唑或复方甲苯咪唑儿童蛲虫感染率均有较大幅度的下降,3个疗程后分别从服药前的54.1%和73.1%下降至3.9%和6.4%,效果比较理想和

国寄生虫病防治杂志,2005,12:425.

【收稿日期】　2007205212　【修回日期】　2007208230

本文来源：https://www.bwwdw.com/article/vg8e.html