6-聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分析过氧化物酶同工酶

聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分析过氧化物酶同工酶

聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分析

过氧化物酶同工酶

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摘要：本实验采用聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳技术，分离小麦幼苗过氧化

物酶同工酶，根据酶的生化反映，通过染色方法显示出酶的不同区带，以鉴定小麦幼苗过氧化物酶同工酶。通过本实验，主要掌握电泳技术的原理、方法、设计、装臵、凝胶配臵等问题，熟悉所有的操作过程，另外，对同工酶有一个感性的认识。

关键字：聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳，同工酶

一、 研究背景及目的：

同工酶是指能催化同一种化学反应，但其酶蛋白本身的分子结构组成却有所不同的一组酶。它们是DNA编码的遗传信息表达的结果。最近的研究表明，同工酶与生物的遗传、生长发育、代谢调节及抗性等有一定关系。因此，测定同工酶在理论上和实践上都有重要的意义。用聚丙烯酰胺凝胶电泳测定同工酶，方法简便、灵敏度高、重现性强，测定结果便于观察、记录和保存。

过氧化物是植物体内普遍存在的、活性较高的一种酶。它与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有关系。在植物生长发育过程中它的活性不断变化。因此，测定这种酶的活性或其同工酶的变化情况，可以反映某一种时期植物体内代谢的变化。

本实验采用聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳技术，分离小麦幼苗过氧化物酶同工酶，根据酶的生化反映，通过染色方法显示出酶的不同

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区带，以鉴定小麦幼苗过氧化物酶同工酶。通过本实验，主要掌握电泳技术的原理、方法、设计、装臵、凝胶配臵等问题，熟悉所有的操作过程，另外，对同工酶有一个感性的认识。

二、 研究依据及原理：

聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(acrylamide，简称Acr)和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺(N，N—methylene-bisacylamide，简称Bis)在加速剂N，N，N ，N —四甲基乙二胺(N，N，N ，N —tetramethyl ethylenedia mine，简称TEMED)和催化剂过硫酸铵(ammonium persulfate (NH4)2S2O8，简称AP)或核黄素(ribofavin即vita min B2，C17H20O6N4)的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis，简称PAGE)。

聚丙烯酰胺凝胶有下列特性：

(1)在一定浓度时，凝胶透明，有弹性，机械性能好；

(2)化学性能稳定，与被分离物不起化学反应，在很多溶剂中不溶；

(3)对pH和温度变化较稳定；

(4)几乎无吸附和电渗作用，只要Acr纯度高，操作条件一致，则样品分离重复性好；

(5)样品不易扩散，且用量少，其灵敏度可达10-6g

(6)凝胶孔径可调节，根据被分离物的分子量选择合适的浓度，通过改变单体及交联剂的浓度调节凝胶的孔径；

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(7)分辨率高，尤其在不连续凝胶电泳中，集浓缩、分子筛和电荷效应为一体。因而较醋酸纤维薄膜电泳、琼脂糖电泳等有更高的分辨率。

电泳现象：带电粒子在电场中向与其自身相反电荷的电极移动。由于带电胶粒或分子中各种成分，所具有的电荷和分子量不同，在电场中将以不同的速度移动，因而在电泳进行过程中，不同的成分将按照各自的迁移速度得到有效地分离。

不连续体系由电极缓冲液、浓缩胶及分离胶所组成。浓缩胶是由AP催化聚合而成的大孔胶，凝胶缓冲液为pH6.7的Tris-HC1。分离胶是由AP催化聚合而成的小孔胶，凝胶缓冲液为pH8.9 Tris-HC1。电极缓冲液是pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液。2种孔径的凝胶、2种缓冲体系、3种pH值使不连续体系形成了凝胶孔径、pH值、缓冲液离子成分的不连续性，这是样品浓缩的主要因素。电荷效应；分子筛效应

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样品；浓缩效应。

过氧化物酶广泛存在于植物体中，是活性较高的一种酶。它与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有关系。在植物生长发育过程中它的活性不断发生变化。一般老化组织中活性较高，幼嫩组织中活性较弱。这是因为过氧化物酶能使组织中所含的某些碳水化合物转化成木质素，增加木质化程度，而且发现早衰减产的水稻根系中过氧化物酶的活性增加，所以过氧化物酶可作为组织老化的一种生理指标。此外，过氧化物同工酶在遗传育种中的重要作用也正在受到重视。在动、植物中，一种酶的同工酶在各组织、器官中的分布和含量不同，形成各组织特异的同工酶谱，叫做组织的多态性，体现各组织的特异功能。大多数基因性同工酶由于对底物亲和力不同和受不同因素的调节，常表现不同的生理功能，例如动物肝脏的碱性磷酸酯酶和肝脏的排泄功能有关，而肠粘膜的碱性磷酸酯酶却参与脂肪和钙、磷的吸收。对LDH催化的可逆反应，心肌中富含的LDH1及LDH2在体内倾向于催化乳酸的脱氢，而骨骼肌中丰富的LDH4及LDH5则有利于丙酮酸还原而生成乳酸。所以同工酶只是做相同的“工作”（即催化同一个反应），却不一定有相同的功能。

联邻茴香胺在酸性,低温条件下与亚硝酸作用生成四氮盐.四氮盐有两个重氮盐,其中一个重氮基在碱性条件下与所要显示的组氨酸,色氨酸及酪氨酸的苯环结合产生偶联反应,另一个重氮基与酚类或奈类发生偶联反应以增色.因此,可以用生成的偶氮染料来代表组织细胞的蛋白质含量。

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影响电泳的因素如下：待分离的生物大分子的性质、电场强度、缓冲液的性质、支持介质的筛孔、电渗。

三、 实验材料与方法：

1、

2、 实验材料：小麦幼苗 仪器：

（1）电泳仪一套（稳定电源及垂直板电泳槽）

（2）移液器

（3）烧杯 50ml 3个

（4）微量进样品(100ul)

（5）大培养皿一套

（6）pH试纸

3、 试剂：贮液配臵表

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实验方法：

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1. 凝胶的制备：

（1）将贮液由冰箱取出，待与室温平衡后再配制工作液

（2）安装电泳槽。安装时，注意旋紧螺丝时，需均衡用力，以免夹碎玻璃片

（3）用 2%的琼脂糖封底，以防漏胶

（4）按下表所示配制分离胶

在小烧杯中混匀后，立即灌胶，灌胶时，将电泳槽略微倾斜，用于扶稳，将小烧杯尖端 抵在长玻璃片顶端中央某点，小心倒入两玻璃片之间，灌至距短玻璃片顶端 2 厘米左右即 可，放平电泳槽，立即用滴管在胶的上层小心轻缓地覆盖约 2-3 毫米厚的水层；灌注水层时要均匀轻缓，以防在胶顶部产生漏洞，影响结果，刚加水时，可看出界面，后逐渐消失，等到再出现界面时，表明分离胶已聚合，再静臵一会儿（此过程大约10分钟），便可将水倒出，可用滤纸条从一侧略微吸浸，注意不要碰毁胶面，然后准备灌注浓缩胶。

（4）按下表所示配制浓缩胶：

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配制均匀后，立即灌胶，操作同分离胶的灌注，当胶面达到距短玻璃片 0.5 厘米左右即 可，然后立即插入样品槽模板（梳子）。聚合完成后，在电泳槽内倒入电极缓冲液，然后小心拨出梳子，准备点样。此过程大约15分钟

2．点样： 用微量进样器将根、叶样本分别各加：5μl ，15μl，20μl，30μl，40μl

3．电泳

接好电源线(上槽接负极，下槽接正极 )。打开电源开关，调节电流，初始时控制在 15mA 左右，当前沿进入分离胶后，可调节电流到 30mA左右，待前沿指示染料下行至距胶板末端 1~2 厘米处，即可停止电泳。

4．剥胶、染色及记录结果 垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳结束之后，将垂直板从电泳槽上取下，小心地将两块玻璃板分开，并小心地胶臵于大培养皿中，进行染色反应（浓缩胶可以去掉）。

过氧化物酶在分解过氧化氢的过程中产生自由氧基，能使联大茴香发生颜色反应，产生褐色的化合物，所以用联大茴香胺染色液浸泡过的凝胶板上，有过氧化物酶同工酶蛋白质带的部位可以看到褐色的谱带。

染色过程如下：

（1）向大培养皿中倒入约 50ml pH4.7 乙酸缓冲注，将胶板淹没，室温浸泡 10 分钟。

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（2）倒掉乙酸缓冲液，加入联大茴香胺染色液，将胶板淹没，室温下浸泡20分钟，在此期间会出现过氧化物酶同工酶的谱带，观察记录酶谱。

四、 实验结果：见附图

五、 结果分析：

本实验采用聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳技术，分离小麦幼苗过氧化物酶同工酶，根据酶的生化反映，通过染色方法显示出酶的不同区带，以鉴定小麦幼苗过氧化物酶同工酶。

如图中所示，左侧为根，右侧为叶，浓度梯度也不同。电泳后不同的蛋白质在电泳中分成不同的条带，样品槽下端有微量的绿色，应该是样品液中的叶绿素，实验结果基本清晰，分层较明显，实验应为成功。

六、 参考文献：

1、 兰海燕 李立会，《蛋白质凝胶电泳技术在作物品种鉴定中的应用》，

中国农业科学，2002 ，35（8）：916-920

2、 沈新明，江培洲，黄华，李欣，姚开泰(第一军医大学肿瘤研究所，广东

广州510515)，《运用双向聚丙烯酰胺凝胶电泳和图像软件分析TPA处理NIH3T3细胞前后的蛋白质表达谱差异》，第一军医大学学报(J First Mil Med Univ），2004，,2（3）

3、 曹成喜 等，《生物化学仪器分析基础》，2008，化学工业出版社

4、 孙培龙 吴石金，《生物化学技术实验指导》，2008，化学工业出版社

5、 张龙翔 张庭芳 李玲媛，《生化试验方法和技术》，1997，高等教育出版

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七、 思考题：

1、 化学聚合是通过一系列的化学反应来完成聚合的过程；光聚

合是通过不同的光照刺激下来完成物质的聚合过程。

2、 不可以混合；分离缓冲液与浓缩缓冲液中都有Cl-离子在电

泳的时候Cl-离子已经进入了连接正极的缓冲液中，而连接负极的缓冲液中Cl-离子含量减少。

3、 为了不使溶液扩散，向样品液中加入等量40%的蔗糖。加入

了蔗糖的样品液能提高沉降率，增加样品比重使样品液能很好的沉降到样品孔的底部。

4、 本实验关键步骤：1）配制分离胶和浓缩胶时要按顺序加入

各组分并迅速倒入两玻璃板间，防止胶体变质凝固；2）装胶要快，太慢则形成的胶不均匀3）装分离胶后应立即加水封闭，防止氧气是胶体变质；4）拔出梳子的时候要均匀用力向上，否则容易破坏样品槽

八、 实验小结：

本实验采用聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳技术，分离小麦幼苗过氧化物酶同工酶，根据酶的生化反映，通过染色方法显示出酶的不同区带，以鉴定小麦幼苗过氧化物酶同工酶。通过本实验，主要掌握电泳技术的原理、方法、设计、装臵、凝胶配臵等问题，熟悉所有的操作过程，另外，对同工酶有一个感性的认识。

如图中所示，不同的蛋白质在电泳中分成不同的条带，实验结果

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基本清晰，分层较明显，实验应为成功。

实验过程中我们出现过一次浓缩胶没有凝固的问题，推测应为浓缩丙胶加入量错误。

本文来源：https://www.bwwdw.com/article/vfxi.html