MALDI TOFTOF在蛋白质组学中的应用介绍
更新时间:2023-09-04 11:12:01 阅读量: 教育文库 文档下载
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在国际市场上,08年以后waters、PE公司、Bio-Rad的Maldi TOF相继停产后,市场主要的MALDI TOF生产;/厂家实际就只有三家:Bruker、AB、岛津。最近两年,由于仪器性能获得肯定、技术上不断取得突破,Bruker在全球MALDI TOF市场更是取得了极大的成功,目前已在欧洲成功占据了80%以上的市场份额,在美国占据了60%以上的市场份额。毋庸置疑,Bruker已是目前全球MALDI TOF领域当之无愧的行业领袖。
MALDI-TOF/TOF质谱的原理及其在临床蛋白质组学中的应用
目 录
一、MALDI-TOF/TOF质谱的基本原理
二、布鲁克公司MALDI-TOF/TOF质谱的仪器特点和性能优势
宽域离子聚焦PAN 专利技术
靶上浓缩AnchorChip 专利技术
全新的离子源自动清洗SourceShower 专利技术
氮气激光与固体激光优点完美结合的Smartbeam 激光专利技术
激光光束的直径大小可调
支持所有同位素标记技术
Top-down测序技术
三、解决方案
解决方案一:双向电泳-MALDI TOF/TOF技术路线 解决方案二:LC-MALDI TOF/TOF技术路线 解决方案三:ClinProt液体芯片- MALDI TOF系统 解决方案四:MALDI分子成像技术 解决方案五:MALDI Biotyper微生物快速鉴定与分类
四、参考文献
在国际市场上,08年以后waters、PE公司、Bio-Rad的Maldi TOF相继停产后,市场主要的MALDI TOF生产;/厂家实际就只有三家:Bruker、AB、岛津。最近两年,由于仪器性能获得肯定、技术上不断取得突破,Bruker在全球MALDI TOF市场更是取得了极大的成功,目前已在欧洲成功占据了80%以上的市场份额,在美国占据了60%以上的市场份额。毋庸置疑,Bruker已是目前全球MALDI TOF领域当之无愧的行业领袖。
一、MALDI-TOF/TOF质谱的基本原理
MALDI-TOF/TOF质谱主要由MALDI离子源和飞行时间质量分析器TOF组成。样品在离子源内受激光的轰击而电离,受加速电场的作用获得一定的动能后,在无电场的真空管内飞行,不同质量的离子在飞行管内的飞行时间不同,通过测量离子的飞行时间即可测得离子的质量。它不仅可以通过一级质谱模式测得多肽和蛋白质等分子的质量,还可通过二级质谱模式测得多肽的序列。
布鲁克公司是当今世界上唯一专门生产高性能生物质谱的公司,仅MALDI TOF/TOF系列的仪器就至少有六种型号。其中, Autoflex Speed MALDI TOF/TOF是目前最先进的MALDI-TOF/TOF质谱仪。它不仅在硬件上具有布鲁克公司的多项专利技术,还提供了很多独特的分析软件,为临床医学研究人员提供了蛋白质组学研究方向的多种解决方案。除了通过经典的以二维电泳为分离手段的双向电泳-MALDI TOF/TOF技术路线和以液相色谱为分离手段的LC-MALDI TOF/TOF技术路线,进行表达蛋白质组学或差异蛋白质组学研究以外,它还在临床医学研究的具有广泛的应用,如发现与鉴定生物体液(如血清)中生物标志物的ClinProt技术,用于发现和监测组织中生物标志物的MALDI分子成像技术,用于临床微生物快速鉴定与分类的BioTyper技术,都是布鲁克公司独家提供的医学蛋白质组学解决方案。
Autoflex Speed 是当今世界最先进的MALDI TOF/TOF,由高能碰撞池和两级TOF组成。它打破了三重四极杆等仪器采用的“先选择母离子,然后碰撞打碎母离子,再检测碎片离子”的传统串联质谱模式,巧妙地利用了TOF检测器的特点,采用“先碎裂母离子,再选择检测母离子及其碎片离子”的方式,从而使串联质谱一气呵成,无需离子的减速过程,避免了其它产家的MALDI TOF/TOF在进行串联质谱时,离子先加速,选择母离子,然后减速,打碎后再加速等多步过程造成的离子信号损失。其工作原理看似不好理解,其实也很简单,根据在飞行管中飞行的母离子在碎裂前后飞行时间不变的性质,先打碎母离子,并不影响对母离子及其碎片离子的选择及检测。
Autoflex Speed型MALDI-TOF质谱仪检测范围宽,分析速度快,分辨率和灵敏度高等优点,具有非常广泛的应用范围。Bruker公司独创的smartbeam激光技术,吸收了氮气激光器
在国际市场上,08年以后waters、PE公司、Bio-Rad的Maldi TOF相继停产后,市场主要的MALDI TOF生产;/厂家实际就只有三家:Bruker、AB、岛津。最近两年,由于仪器性能获得肯定、技术上不断取得突破,Bruker在全球MALDI TOF市场更是取得了极大的成功,目前已在欧洲成功占据了80%以上的市场份额,在美国占据了60%以上的市场份额。毋庸置疑,Bruker已是目前全球MALDI TOF领域当之无愧的行业领袖。
的优点,克服了全固态激光器的缺点,大大扩展了其应用范围。它不仅适用于高通量的蛋白质组分析鉴定,还可进行血清临床蛋白质组分析、微生物快速鉴定、组织切片成像分析,更可利用独特的ISD和T3测序技术进行蛋白质的Top-down直接测序和蛋白质末端序列分析。
它采用的实时校准技术克服了TOF检测器易受环境温度变化而导致质量漂移的缺陷,保证了质量准确度的稳定性。它采用的宽域离子聚焦技术保证了在很宽的质量范围内同时获得高分辨率和高准确度,充分满足蛋白质组研究的需要,是蛋白质组研究不可或缺的工具。
二、布鲁克公司MALDI-TOF/TOF质谱的仪器特点和性能优势
宽域离子聚焦PAN 专利技术:可同时在很宽的质量范围内得到超高分辨率和宽范围
内极高质量精度
靶上浓缩AnchorChip 专利技术:提高分析灵敏度10-100倍
全新的离子源自动清洗SourceShower 专利技术:不仅保证了仪器的持续运行和长期
灵敏度,还大大缩短了清洗时间,方便了仪器的维护
氮气激光与固体激光优点完美结合的Smartbeam 激光专利技术:对所有的基质都有
很好的通用性,不局限于CHCA ;Smartbeam 激光频率可在1-1000Hz范围调节,分析速度更快,充分满足分子成像和LC-MALDI分析的需要。
激光光束的直径10-100µm大小可调:特别有利于组织切片的分子成像,提高图像的
分辨率。
支持所有同位素标记技术:充分满足定量蛋白质组学的应用需求。
Top-down测序技术:不需进行蛋白的酶解,直接进行整蛋白的序列分析,尤其是末端
测序。
三、解决方案
布鲁克公司为临床蛋白质组学的研究提供的解决方案大致可以分为五大部分: 解决方案一:双向电泳-MALDI TOF/TOF技术路线
蛋白鉴定、蛋白翻译后修饰位点的鉴定等,可用于表达蛋白质组学、差异蛋白质组学和功能蛋白质组学等
在国际市场上,08年以后waters、PE公司、Bio-Rad的Maldi TOF相继停产后,市场主要的MALDI TOF生产;/厂家实际就只有三家:Bruker、AB、岛津。最近两年,由于仪器性能获得肯定、技术上不断取得突破,Bruker在全球MALDI TOF市场更是取得了极大的成功,目前已在欧洲成功占据了80%以上的市场份额,在美国占据了60%以上的市场份额。毋庸置疑,Bruker已是目前全球MALDI TOF领域当之无愧的行业领袖。
解决方案二:LC-MALDI TOF/TOF技术路线
除上述功能和应用外,更重要的是能够满足标记定量蛋白质组学的需要,标记试剂不仅仅限于iTRAQ同位素标记试剂,而且还可用于其它类型的标记试剂ICPL、SILAC等。进一步扩展了定量蛋白质组学的应用领域。
解决方案三:ClinProt液体芯片- MALDI TOF系统
适用于生物体液样品,如血清、血浆、尿液、唾液、脑脊液和细胞液等。该解决方案以发现和鉴定蛋白质及多肽类的生物标志物为目标,是医学蛋白组学不可缺少的技术。
解决方案四:MALDI分子成像技术
用于发现和监测组织中的生物标志物
解决方案五:MALDI Biotyper微生物快速鉴定与分类
微生物蛋白特征质谱指纹图谱鉴定法,二十一世纪最先进的快速鉴定临床微生物新技术。
AB公司的4800因为在蛋白分子量测定方面的性能不好,也没有相应的软件支持,只能满足前两种解决方案,无法应用于后三种解决方案。
解决方案详述
1、解决方案一:双向电泳-MALDI TOF/TOF技术路线
双向电泳是目前蛋白质组学领域中分离效果最好的蛋白质分离方法,可以在一张胶上显示上千个蛋白质的等电点、分子量和含量信息。通过双向电泳的分离,大大降低了样品的复杂程度,非常适合MALDI TOF/TOF质谱的分析。把分离后的胶点切下来,通过胶上酶解和肽段的提取,既可通过MALDI TOF一级质谱分析,获得蛋白质的肽质量指纹图,直接用于蛋白质的鉴定;又可通过MALDI TOF/TOF二级质谱分析,获得肽段的序列信息,进一步提高蛋白质鉴定的可靠性。
利用AnchorChip靶可进行样品的靶上浓缩和脱盐,大大方便了双向电泳分离后微量蛋白样品的分析。采用实时校准技术克服了TOF检测器易受环境温度变化而导致质量漂移的缺陷,
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保证了长期稳定的高质量准确度。
2、解决方案二:LC-MALDI蛋白质组技术路线
对于不适合进行双向电泳分离的样品,可以在SDS-PAGE分离后进行酶解或直接进行酶解或,再对酶解产生的肽段混合物进行LC-MALDI TOF/TOF分析。通过LC分离后,大大降低了肽段混合物的复杂程度,非常有利于肽段的二级质谱分析。该技术路线可以用于蛋白质结构的深入分析和血清分肽的鉴定,还可以用于定量蛋白质组学。
2.1. 必要的硬件和软件
PROTEINEER fc是一个将LC分离后多肽/蛋白质组分直接进行MALDI点样的自动收集点样器,与纳升液相结合组成LC-MALDI技术路线的前端样品分离系统,将PROTEINEER fc 和能对液相系统实行实时控制的HyStar软件有机的结合,形成了一个全自动的从液相分离到质谱分析的蛋白质组学流程。LC分离后的样品可直接点在预先点好基质和校准品的PAC靶上,不仅提高了分析的灵敏度,还大大节省了时间和人力劳动。通过WARP-LC软件可以非常方便地进行LC-MALDI数据的采集和分析。
在国际市场上,08年以后waters、PE公司、Bio-Rad的Maldi TOF相继停产后,市场主要的MALDI TOF生产;/厂家实际就只有三家:Bruker、AB、岛津。最近两年,由于仪器性能获得肯定、技术上不断取得突破,Bruker在全球MALDI TOF市场更是取得了极大的成功,目前已在欧洲成功占据了80%以上的市场份额,在美国占据了60%以上的市场份额。毋庸置疑,Bruker已是目前全球MALDI TOF领域当之无愧的行业领袖。
纳升液相
Proteineer fc 自动收集点样器 Autoflex Speed MALDI
2.2. LC-ESI-MALDI-MS/MS相辅相成
众所周知,MALDI TOF/TOF和ESI-Q-TOF在蛋白质的鉴定中的作用是互补的,布鲁克公司在Biomarker鉴定工作中整合了在线 LC-micrOTOF-Q的技术平台。利用Bruker HyStar软件控制液相和点样器,通过分流系统将LC分离后的待检物质分别送入MALDI TOF/TOF和micrOTOF-QII ESI-Q-TOF系统中.追踪已发现的Biomarker在液相的洗脱时间,经WARP-LC软件整合LC-MALDI TOF/TOF和
ESI-Q-TOF的数据以达到最终鉴定目的。目前只有Bruker公司能够实现自身的软硬件的完美结合,为用户今后扩展蛋白质组学质谱平台奠定了基础,从而更有效地帮助研究人员解决蛋白质鉴定工作中遇到的问题。
2.5µl/min 在线 LC-ESI-Q-TOF Split 离线 LC-MALDI
Proteineer fc
自动收集点样器
在国际市场上,08年以后waters、PE公司、Bio-Rad的Maldi TOF相继停产后,市场主要的MALDI TOF生产;/厂家实际就只有三家:Bruker、AB、岛津。最近两年,由于仪器性能获得肯定、技术上不断取得突破,Bruker在全球MALDI TOF市场更是取得了极大的成功,目前已在欧洲成功占据了80%以上的市场份额,在美国占据了60%以上的市场份额。毋庸置疑,Bruker已是目前全球MALDI TOF领域当之无愧的行业领袖。
3、解决方案三:Clinprot液体芯片飞行时间质谱系统
基于飞行时间质谱的Clinprot是一个完整的临床蛋白组学解决方案,包含了样品处理(液体芯片试剂盒)、质谱检测(MALDI TOF)和数据分析(ClinProtTools)。整个临床蛋白组学流程见图1。
图
1、Clinprot系统流程简介
3.1质谱分析
质谱分析采用的质谱仪是布鲁克公司flex系列的MALDI TOF/TOF飞行时间质谱仪,布鲁克公司是目前世界上唯一一家专门生产高性能生物质谱的公司。其中MALDI TOF(/TOF) 质谱仪1997年进入中国市场,目前已有近七十个大学、研究所和医院购买了该类型的质谱仪。该仪器在德国生产制作,仪器品质值得信赖。
3.2分析软件
除了操作仪器和处理质谱图的软件以外,布鲁克为液体芯片解决方案开发了自己的处理软件ClinProTools。ClinProTools软件是一个具备生物标志物检测和评价的所有主要功能的生物信息学软件,可以进行数据的预处理,能够从大规模样品组中获得强大的直观可视化数据,可以进行峰统计和模式识别,可进行聚类分析和独立试验数据敏感性、特异性的交叉验证,同时也可以满足未知样品的分类需要。
在国际市场上,08年以后waters、PE公司、Bio-Rad的Maldi TOF相继停产后,市场主要的MALDI TOF生产;/厂家实际就只有三家:Bruker、AB、岛津。最近两年,由于仪器性能获得肯定、技术上不断取得突破,Bruker在全球MALDI TOF市场更是取得了极大的成功,目前已在欧洲成功占据了80%以上的市场份额,在美国占据了60%以上的市场份额。毋庸置疑,Bruker已是目前全球MALDI TOF领域当之无愧的行业领袖。
该软件具有以下特点:
a. 软件可在windows系统下安装、运行,易学、易用、直观。
b. 软件具有疾病生物标志物的发现和鉴定,疾病诊断模型建立,疾病预测等功能。 c. 软件可同时分析八组数据,可包括正常人和7种不同的疾病类型,含有模型显示、模拟凝胶、簇群分析等几个窗口。
d. 软件含有三种高级生物信息统计算法:Support vector machine、QuickClassfier和Genetic Algorithm,用于正常和疾病模型的建立和预测。
e. 可显示单个和平均的质谱图,分析更加灵活方便。
f. 可设置的数据分析参数多,包括:基线扣除、峰定义和校准、平均化等。
g. 生物标志物可重点突出的标明,可让用户直观的了解每一个谱图,确认最终的结果。
h. 可存储每次分析的完整数据,无数据丢失之忧。
3.3液体芯片质谱仪的用途
1) 疾病相关差异蛋白/多肽的发现,用于临床疾病的早期诊断和个体化治疗等。
2) 蛋白/多肽的鉴定,用于疾病生物标志物的发现,在临床上可应用于疾病的早 期诊断和预警和个体化治疗等。
3) 健康人血清多肽谱、疾病特异谱图等的构建,用于临床疾病,如肿瘤等的早 期诊断、预警、个体化治疗、手术、放化疗等的预后等。
4) 疾病诊断模型的建立,可应用于疾病的早期和快速诊断。
5) 糖类、核酸与反义核酸等生物大分子相互作用,可应用于药物的筛选和评价。
6) 糖蛋白研究,可应用于肿瘤标志物的发现等方面。
在国际市场上,08年以后waters、PE公司、Bio-Rad的Maldi TOF相继停产后,市场主要的MALDI TOF生产;/厂家实际就只有三家:Bruker、AB、岛津。最近两年,由于仪器性能获得肯定、技术上不断取得突破,Bruker在全球MALDI TOF市场更是取得了极大的成功,目前已在欧洲成功占据了80%以上的市场份额,在美国占据了60%以上的市场份额。毋庸置疑,Bruker已是目前全球MALDI TOF领域当之无愧的行业领袖。
4、解决方案四:组织分子成像(MALDI IMAGING)
4.1基本工作流程
1) 导电玻璃片固定组织冷冻切片;
2) 组织切片表面喷以基质;
3) MALDI TOF质谱仪测定;
4) flexImaging- 分子成像软件
MALDI组织分子成像技术是今年来新兴技术,用于快速直观的发现组织中的生物标志物,目前处于临床医学研究阶段。具有可观的临床诊断前景,为医学临床诊断学的研究提供了一个具有前瞻性的医学平台。在临床病理诊断中克服了人为因素,医生有可能用真实的数据来评判病情。同时也是病理组织染色领域的一个全新的里程碑。布鲁克公司从硬件和软件两方面为这一划时代的新技术提供了完整的解决方案。而ABI公司的部分硬件和软件采用的是第三方产品,从而可以充分说明一个质谱公司对质谱在临床研究领域的应用的重视和投入程度。
在国际市场上,08年以后waters、PE公司、Bio-Rad的Maldi TOF相继停产后,市场主要的MALDI TOF生产;/厂家实际就只有三家:Bruker、AB、岛津。最近两年,由于仪器性能获得肯定、技术上不断取得突破,Bruker在全球MALDI TOF市场更是取得了极大的成功,目前已在欧洲成功占据了80%以上的市场份额,在美国占据了60%以上的市场份额。毋庸置疑,Bruker已是目前全球MALDI TOF领域当之无愧的行业领袖。
4.2 布鲁克公司性能可靠、独一无二的硬件组合
导电玻片 样品靶
自动基质喷雾仪
4.4功能多样化、信息量大、可视性好的控制软件和生物信息软件组合 Smartbeam 激光
flexImaging Software专门用于MALDI IMAGING 分子成像的分析软件,包括图谱的生成及相关数据的分析;ClinProtTools可用于发现组织中的生物标志物,其具有统计学意义的主成份分析可使您的研究更具有代表性。
TM flexImaging
ClinProtTools
TM
在国际市场上,08年以后waters、PE公司、Bio-Rad的Maldi TOF相继停产后,市场主要的MALDI TOF生产;/厂家实际就只有三家:Bruker、AB、岛津。最近两年,由于仪器性能获得肯定、技术上不断取得突破,Bruker在全球MALDI TOF市场更是取得了极大的成功,目前已在欧洲成功占据了80%以上的市场份额,在美国占据了60%以上的市场份额。毋庸置疑,Bruker已是目前全球MALDI TOF领域当之无愧的行业领袖。
4.5主要应用:
差异蛋白发现和确证
蛋白表达谱
用于药物代谢的研究
免疫组化的替代
5、解决方案五:微生物快速鉴定与分类
5.1工作流程
5.2 MALDI Biotyper的工作原理
每种微生物都有自身独特的蛋白质组成,因而拥有独特的蛋白质指纹图谱。 MALDI Biotyper高通量微生物鉴定系统通过MALDI-TOF质谱仪测得待测微生物的蛋白质指纹谱图,通过Biotyper软件对这些指纹谱图进行处理并和布鲁克独家开发的微生物数据库中的三千多种微生物特征指纹谱进行比对,从而在几分钟之内完成对微生物的鉴定。
在国际市场上,08年以后waters、PE公司、Bio-Rad的Maldi TOF相继停产后,市场主要的MALDI TOF生产;/厂家实际就只有三家:Bruker、AB、岛津。最近两年,由于仪器性能获得肯定、技术上不断取得突破,Bruker在全球MALDI TOF市场更是取得了极大的成功,目前已在欧洲成功占据了80%以上的市场份额,在美国占据了60%以上的市场份额。毋庸置疑,Bruker已是目前全球MALDI TOF领域当之无愧的行业领袖。
5.3 MALDI Biotyper的特点
(1) 操作简单、快速、通量高
单个微生物菌落或其它生物材料经简单的样品前处理(仅需几分钟)后,使用MALDI-TOF质谱仪进行测定。所获得的质谱图可直接送到Biotyper数据库进行检索。简单而独特的工作流程不需要进行革兰氏染色、氧化酶试验或选择PCR引物。
(2) 灵敏度高
使用经久耐用且性能可靠的布鲁克·道尔顿的MALDI-TOF系列仪器,可以实现高重复性的快速检测。由于仪器的高灵敏度,可以检测到低至100ng的细胞,甚至25ng的样品就能满足需求。
(3) 准确度好
MALDI-TOF获得的蛋白指纹图谱用作模式匹配,匹配分值用作鉴定结果的分级和归类。Biotyper软件对所得的图谱进行分析统一化,其复杂而精巧的校正和统计运算保证了鉴定的精确性。
(4) 商品化数据库
包括三千多种菌种;布鲁克公司独家拥有。
总而言之,布鲁克公司的ultraflex III具有提供完整的临床医学蛋白质组学研究的解决方案。
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