微生物学实验指导大全

微生物学实验指导

华南师范大学生命科学学院

黄文芳 张 松 编著

第一部分 基础实验

实验1 培养基的配制

一、实验目的和内容

目的：学习和掌握配制培养基的一般方法和步骤。 内容：1．牛肉膏蛋白陈培养基的配制。

2．高氏1号培养基的配制。 3．马丁氏培养基的配制。 二、实验材料和用具 牛肉膏、蛋白胨、琼脂、可溶性淀粉、葡萄糖、孟加拉红、链霉素、1mol/L NaOH、lmol/L HCl、KNO3、NaCl、K2HPO423H2O、MgSO427H2O、FeSO427H2O。

试管、三角瓶、烧杯、量筒、玻璃棒、天平、牛角匙、pH试纸、棉花、牛皮纸、记号笔、线绳、纱布、漏斗、漏斗架、胶管、止水夹等。

三、操作步骤

（一）牛肉膏蛋白胨培养基的配制

牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基。其配方如下： 牛肉膏3g，蛋白胨10g，Nacl5g，琼脂15～20g，水1000mL，PH7.4～7.6

1．称药品 按实际用量计算后，按配方称取各种药品放入大烧杯中。牛肉膏可放在小烧杯或表面皿中称量，用热水溶解后倒入大烧杯；也可放在称量纸上称量，随后放入热水中，牛肉膏使与称量纸分离，立即取出纸片。蛋白胨极易吸潮，故称量时要迅速。

2．加热溶解 在烧杯中加入少于所需要的水量，然后放在石棉网上，小火加热，并用玻棒搅拌，待药品完全溶解后再补充水分至所需量。若配制固体培养基，则将称好的琼脂放入己溶解的药品中，再加热融化，此过程中，需不断搅拌，以防琼脂糊底或溢出，最后补足所失的水分。

3． 调pH 检测培养基的pH，若pH偏酸，可滴加lmol/L NaOH，边加边搅拌，并随时用pH试纸检测，直至达到所需pH范围。若偏碱，则用lmol/L HCl进行调节。pH的调节通常放在加琼脂之前。应注意pH值不要调过头，以免回调而影响培养基内各离子的浓度。

4．过滤 液体培养基可用滤纸过滤，固体培养基可用4层纱布趁热过滤，以利培养的观察。但是供一般使用的培养基，这步可省略。

5．分装 按实验要求，可将配制的培养基分装入试管或三角瓶内。分装时可用漏斗以免使培养基沾在管口或瓶口上而造成污染。

分装量：固体培养基约为试管高度的l/5，灭菌后制成斜面。分装入三角瓶内以不超过其容积的一半为宜。半固体培养基以试管高度的1/3为宜，灭菌后垂直待凝。

6．加棉塞 试管口和三角瓶口塞上用普通棉花(非脱脂棉)制作的棉塞。棉塞的形状、大小和松紧度要合适，四周紧贴管壁，不留缝隙，才能起到防止杂菌侵入和有利通气的作用。要使棉塞总长约3/5塞入试管口或瓶口内，以防棉塞脱落。有些微生物需要更好的通气，则可用8层纱布制成通气塞。有时也可用试管帽或塑料塞代替棉塞。

7．包扎 加塞后，将三角瓶的棉塞外包一层牛皮纸或双层报纸，以防灭菌时冷凝水沾

湿棉塞。若培养基分装于试管中，则应以5支或7支在一起，再于棉塞外包一层牛皮纸，用绳扎好。然后用记号笔注明、培养基名称、组别、日期。

8．灭菌 将上述培养基于121.3℃湿热灭菌20min。如因特殊情况不能及时灭菌，则应故人冰箱内暂存。

9．摆斜面 灭菌后，如制斜面，则需趁热将试管口端搁在一根长木条上，并调整斜度，便斜面的长度不超过试管总长的1/2。

10．无菌检查 将灭菌的培养基放入37℃温箱中培养24～48h，无菌生长即可使用，或贮存于冰箱或清洁的橱内，备用。

（二）高氏l号培养基的配制

高氏1号培养基是用于分离和培养放线菌的合成培养基。其配方如下：

可溶性淀粉20g，KNO3 1g，NaCl 0.5g，K2HPO423H2O 0.5g，MgSO427H2O 0.5g，FeSO427H2O 0.01g，琼脂15～20g，水1000mL，pH7.4～7.6。

l．称量和溶解 先计算后称量，按用量先称取可溶性淀粉，放入小烧杯中，并用少量冷水将其调成糊状，再加至少于所需水量的水，继续加热，边加热边搅拌，至其完全溶解。再加入其他成分依次溶解。对微量成分FeSO427H2O可先配成高浓度的贮备液后再加入，方法是先在1000mL中加入1g的FeSO427H2O，配成浓度为0.01g/mL的贮备液，再在1000mL培养基中加入以上贮备液1mL即可。待所有药品完全溶解后，补充水分到所需的总体积。如要配制固体培养基，其琼脂溶解过程同牛肉膏蛋白胨培养基配制。

2．pH调节、分装、包扎及无菌检查 同牛肉膏蛋白胨培养基配制。 （三）马丁氏培养基的配制

马丁氏培养基是用于分离真菌的选择培养基。其配方如下：

K2HPO4 1g，MgSO427H2O 0.5g，蛋白胨5g，葡萄糖l0g，琼脂15～20g，水1000mL，自然pH。

1．称量和溶解 先计算后称量，按用量称取各成分，并将其溶解在少于所需的水中。待各成分完全溶解后，补充水分到所需体积。再将孟加拉红配成1%的水溶液，在1000mL培养液中加入以上孟加拉红溶液3.3mL，混匀后，加入琼脂加热融化，方法同牛肉膏蛋白胨培养基配制。

2．分装、包扎、灭菌及无菌检查同牛肉膏蛋白膝培养基配制。 3．链霉素的加入 链霉素受热容易分解，所以临用时，将培养基融化后待温度降至45℃左右时才能加入。可先将链霉素配成1%的溶液(配好的链霉素溶液保存于-20℃)，在100mL培养基中加1%链霉素0.3mL ，使每毫升培养基中合链霉素30μg。

四、注意事项

称药品用的牛角匙不要混用，称完药品应及时盖紧瓶盖。调pH时要小心操作，避免回调。不同培养基各有配制特点，要注意具体操作。

五、实验报告

记录本实验配制培养基的名称、数量，并图解说明其配制过程，指明要点。 六、问题和思考

l．配制培养基有哪几个步骤?在操作过程中应注意些什么问题?为什么?

2．培养基配制完成后，为什么必须立即灭菌?若不能及时灭菌应如何处理?已灭菌的培养基如何进行无菌检查?

3．试设计实验对饮料进行无菌检查。

实验2 消毒与灭菌

一、干热灭菌 （一）目的要求

1．了解干热灭菌的原理和应用范围。 2．学习干热灭菌的操作技术。 （二）基本原理

干热灭菌是利用高温使微生物细胞内的蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。细胞内的蛋白质凝固性与其本身的含水量有关，在菌体受热时，当环境和细胞内含水量越大，则蛋白

蛋凝固就越快，反之含水量越少，凝固缓慢。因此，与湿热灭菌相比，干热灭菌所需温度要高（160～170℃），时间要长（1～2h），但干热灭菌温度不能超过180℃，否则，包器皿的纸或棉塞就会烧焦，甚至引起燃烧。干热灭菌使用的电烘箱的结构如图2-1。

图2-1 电烘箱的外观和结构

A.外观 B.结构

1.温度计; 2.排气阀; 3.箱体; 4.控温器旋钮; 5.箱门; 6.指示灯; 7.加热开关; 8.温度控制阀; 9.控制室; 10.侧门; 11.工作室; 12. 保温室; 13.电热器;

14. 散热板; 15.搁板

（三）器材

培养皿、试管、吸管、电烘箱等。 （四）操作步骤 1．装入待灭菌物品

将包好的待灭菌物品（培养皿、试管，吸管等）放入电烘箱内，关好箱门。

物品不要摆得太挤，以免妨碍空气流通，灭菌物品不要接触电烘箱内壁的铁板，以防包装纸烤焦起火。

2．升温 接通电源，拨动开关，打开电烘箱排气孔，旋动恒温调节器至绿灯亮，让温度逐渐上升。当温度升至100℃时，关闭排气孔。在升温过程中，如果红灯熄灭，绿灯亮，表示箱内停止加温，此时如果还未达到所需的160—170℃温度，则需转动调节器使红灯再亮，如此反复调节，直至达到所需温度。

3．恒温

当温度升达到160～170℃时，恒温调节器会自动控制调节温度，保持此温度2h。 干热火菌过程。严防恒温调节的自动控制失灵而造成安全事故。 4．降温

切断电源、自然降温。 5．开箱取物

待电烘箱内温度降到70℃以下后，打开箱门，取出灭菌物品。

电烘箱内温度末降到70℃，切勿自行打开箱门以免骤然降温导致玻璃器皿炸裂。 （五）实验报告 思考题

l．在干热灭菌操作过程中应注意哪些问题，为什么? 2．为什么干热火菌比湿热灭菌所需要的温度要高，时间要长?请设计干热灭菌和湿热灭菌效果比较实验方案。

二 高压蒸气灭菌 （一）目的要求

1．了解高压蒸气灭菌的基本原理及应用范围。 2．学习高压蒸气灭菌的操作方法。 （二）基本原理

高压蒸气灭菌是将待灭菌的物品放在一个密闭的加压灭菌锅内，通过加热，使灭菌锅隔套间的水沸腾而产生蒸气。待水蒸气急剧地将锅内的冷空气从排气阀中驱尽，然后关闭排气阀，继续加热，此时由于蒸气不能溢出，而增加了灭菌锅内的压力，从而使沸点增高，得到高于100℃的温度。导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。

在同一温度下，湿热的杀菌效力比干热大。其原因有三：一是湿热中细菌菌体吸收水分，蛋白质较易凝固，因蛋白质含水量增加，所需凝固温度降低（表2—1），二是湿热的穿透力比干热大（表2—2），三是湿热的蒸气有潜热存在。1g水在100℃时，由气态变为液态时可放出2.26kJ(千焦)的热量。这种潜热，能迅速提高被灭菌物体的温度，从而增加灭菌效力。

表2—1 蛋白质含水量与凝固所需温度的关系 卵白蛋白含水量/% 30分钟内凝固所需温度/℃ 50 25 18 6 56 74～80 80～90 145 0 160～170 在使用高压蒸气灭菌锅灭菌时，灭菌锅内冷空气的排除是否完全极为重要，因为空气的膨胀压大于水蒸气的膨胀压，所以，当水蒸气中含有空气时，在同一压力下，含空气蒸气的温度低于饱和蒸气的温度。灭菌锅内留有不同分量空气时，压力与温度的关系见（表2—3）

表2-2 干热温热穿透力及灭菌效果比较 温度/℃ 时间/h 透过布层的温度/℃ 灭菌 20层 干热130-140 湿热105.3 4 3 86 101 10层 72 100层 70.5 不完全 101 101 完全 表2—3 灭菌锅留有不同分量空气时，压力与温度的关系 全部空气排出时的温度/℃ 2/3空气排出时的温度/℃ 100 109 115 121 126 130 1/2空气排出时的温度/℃ 94 105 112 118 124 128 1/3空气排出时的温度/℃ 90 100 109 115 121 126 空气全不排出时的温度/℃ 72 90 100 109 115 121 压力数 Mpa Kg/cm2 Ib/in2 0.03 0.07 0.10 0.14 0.17 0.21 0.35 0.70 10.5 1.40 1.75 2.10 5 10 15 20 25 30 108.8 115.6 121.3 126.2 130.0 134.6 现在法定压力单位己不用磅和kg/cm2表示，而是用Pa或bar表示，其换算关系为：1kg/cm2=98066.5Pa；1Ib/in2=6894.76Pa.

一般培养基用0.1Mpa（相当于15 Ib/in2或1.05kg/cm2），121.5℃,15～30min可达到彻底灭菌的目的。灭菌的温度及维持的时间随灭菌物品的性质和容量等具体情况而有所改变。

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例如含糖培养基用0.06Mpa（8Ib/in或0.59kg/cm）112.6℃灭菌，然后以无菌操作手续加入灭菌的糖溶液。又如盛于试管内的培养基以0.1Mpa,121.5℃灭菌20min即可，而盛于大瓶内的培养基最好以0.1Mpa，122℃灭菌30min。

实验中常用的非自控高压蒸气灭菌锅有卧式（图2-2，A）和手提式（图2—2，B）二种，其结构和工作原理相同，本实验以手提式高压蒸气灭菌锅为例，介绍其使用方法，有关自控高压蒸气灭菌锅（autoclave）的使用可参照厂家说明书。

图2—2A 卧式灭菌锅

图2—2B 手提式灭菌锅

1. 安全阀; 2.压力表; 3.放气阀; 4.软管; 5.紧固螺栓; 6.灭菌桶; 7. 筛架; 8.水

（三）器材

牛肉膏蛋白胨培养基，培养皿(6套一包)，手提式高压蒸气灭菌锅等。 （四）操作步骤

1．首先将内层锅取出，再向外层锅内加入适量的水，使水面与三角搁架相平为宜。 切勿忘记加水，同时水量不可过少，以防灭菌锅烧干而引起炸裂事故。

2．放回内层锅，并装入待灭菌物品。注意不要装得太挤，以免防碍蒸气流通而影响灭菌效果。三角烧瓶与试管口端均不要与锅壁接触，以免冷凝水淋湿包口的纸而透入棉塞。

3．加盖，并将盖上的排气软管插入内层锅的排气槽内。再以两两对称的方式同时旋紧相对的两个螺栓，使螺栓松紧一致，勿使漏气。

4．用电炉或煤气加热，并同时打开排气阀，使水沸腾以排除锅内的冷空气。待冷空气完全排尽后，关上排气阀，让锅内的温度随蒸气压力增加到逐渐上升。当锅内压力升到所需压力时，控制热源，维持压力至所需时间。本实验用0.1Mpa，121.5℃，20min灭菌。

灭菌的主要因素是温度而不是压力。因此锅内冷空气必须完全排尽后，才能关上排气阀，维持所需压力。

5．灭菌所需时间到后，切断电源或关闭煤气，让灭菌锅内温度自然下降，当压力表的压力降至“0”时，打开排气阀，旋松螺栓，打开盖子，取出灭菌物品。

压力一定要降到“0”时，才能打开排气阀，开盖取物。否则就会因锅内压力突然下降，使容器内的培养基由于内外压力不平衡而冲出烧瓶口或试管口，造成棉塞沾染培养基而发生污染，甚至灼伤操作者。

6．将取出的灭菌培养基，需摆斜面的则摆成斜面，然后放入37℃温箱培养24h，经检查若无杂菌生长，即可待用。

（五）实验报告 l．结果

检查培养基灭菌是否彻底。 2．思考题

（1）高压蒸气灭菌开始之前，为什么要将锅内冷空气排尽?灭菌完毕后，为什么待压力降低“0”时才能打开排气阀，开盖取物？

（2）在使用高压蒸气灭菌锅灭菌时，怎样杜绝一切不安全的因素? （3）灭菌在微生物实验操作中有何重要意义?

（4）黑曲霉的孢子与芽孢杆菌的孢子对热的抗性哪个最强?为什么? 三、紫外线灭菌

（一）目的要求

了解紫外线灭菌的原理和方法 （二）基本原理

紫外线灭菌是用紫外线灯进行的。波长为200~300nm的紫外线都有杀菌能力，其中以260nm的杀菌力最强。在波长一定的条件下，紫外线的杀菌效率与强度和时间的乘积成正比。紫外线杀菌机理主要是因为它诱导了胸腺嘧啶二聚体的形成和DNA链的交联，从而抑制了DNA的复制。另一方面，由于辐射能使空气中的氧电离成[O]，再使O2氧化生成臭氧（O3）或使水（H2O）氧化生成过氧化氢（H2O2）。O3和H2O2均有杀菌作用。紫外线穿透力不大，所以，只适用于无菌室，接种箱，手术室内的空气及物体表面的灭菌。紫外线灯距照射物以不超过1.2m为宜。

此外，为了加强紫外线灭菌效果，在打开紫外灯以前；可在无菌室内(或接种箱内)喷洒3%～5%石炭酸溶液，一方面使空气中附着有微生物的尘埃降落，另一方面也可以杀死一部分细菌。无菌室内的桌面、凳子可用2%～3%的来苏尔擦洗，然后再开紫外灯照射，即可增强杀菌效果，达到灭菌目的。

（三）器材

1．培养基 牛肉膏蛋白胨平板。

2．溶液或试剂 3%~5%石炭酸或2%~3%来苏尔溶液。 3．仪器或其他用具 紫外线灯。 （四）操作步骤 l．单用紫外线照射

（1）在无菌室内或在接种箱内打开紫外线灯开关，照射30min，将开关关闭。

（2）将牛肉膏蛋白胨平板盖打开15min，然后盖上皿盖。置37℃培养24h。共做三套。 （3）检查每个平板上生长的菌落数。如果不超过4个，说明灭菌效果良好，否则，需延长照射时间或同时加强其他措施。

2．化学消毒剂与紫外线照射结合使用

（1）在无菌室内，先喷洒3%～5%的石炭酸溶液，再用紫外线灯照射15imn。 （2）无菌室内的桌面，凳子用2%～3%来苏尔擦洗，再打开紫外线灯照射15min。 （3）检查灭菌效果[方法同“单用紫外线照射”(3)]。 因紫外线对眼结膜及视神经有损伤作用，对皮肤有刺激作用，故不能直视紫外线灯光下工作。

（五）实验报告 1．结果

记录两种灭菌效果于下表中 处理方法 平板菌落数 灭菌效果比较 1 2 3 紫外线照射 3%～5%石炭酸+紫外线照射 2%～3%来苏尔+紫外线照射 2．思考题。

（1）细菌营养体细胞和细菌芽孢对紫外线和的抵抗力会一样吗，为什么？

（2）你知道紫外线灯管是用什么玻璃制作的？为什么不用普通灯用玻璃？ （3）在紫外灯下观察实验结果时，为什么要隔一块普通玻璃？ 四 微孔滤膜过滤除菌 （一）目的要求

1．了解过滤除菌的原理。

2．掌握微孔滤膜过滤除菌的方法。 （二）基本原理

过滤除菌是通过机械作用滤去液体或气体中细菌的方法。根据不同的需要选用不同的滤器和滤板材料。微孔滤膜过滤器是由上下二个分别具有出口和入口连接装置的塑料盖盒组成，出口处可连接针头，人口处可连接针筒，使用时将滤膜装入两塑料盖盒之间，旋紧盖盒，当溶液从针筒注入滤器时，此滤器将各种微生物阻留在微孔滤膜上面，从而达到除菌的目的。根据待除菌溶液量的多少，可选用不同大小的滤器。此法除菌的最大优点是可以不破坏溶液中各种物质的化学成分，但由于滤量有限，所以一般只适用于实验室中小量溶液的过滤除菌。

（三）器材

1．培养基 2%的葡萄糖溶液，肉汤蛋白胨平板。

2．仪器或其他用具 注射器，微孔滤膜过滤器，0.22μm滤膜，无菌试管，镊子，玻璃刮棒。

（四）操作步骤 l．组装、灭菌

将0.22μm孔径的滤膜装入清洗干净的塑料滤器中，旋紧压平，包装灭菌后待用(0.lMPa，121.5℃灭菌20min)。

2．连接

将灭菌滤器的入口在无菌条件下，以无菌操作方式连接于装有待滤溶液（2%葡萄糖溶液）的注射器上，将针头与出口处连接并插入带橡皮塞的无菌试管中。见图2—3。

3．压滤

将注射器中的待滤溶液加压缓缓挤入过滤到无菌试管中，滤毕，将针头拨出。 压滤时，用力要适当，不可太猛太快，以免细菌被挤压通过淀胶． 4．无菌检查

无菌操作吸取除菌滤液0.1ml于肉汤蛋白胨平板上，涂布均匀，置37℃温室中培养24h，检查是否有菌生长。

5．清洗

弃去塑料滤器上的微孔滤膜，将塑料滤器清洗干净，并换上一张新的微孔滤膜，组装包扎，再经无菌后使用。

整个过程应在无菌条件下严格无菌操作，以防污染，过滤时应避免各连接处出现渗漏现象。

（五）实验报告 l．结果

记录无菌检查结果 2．思考题

(1)你做的过滤除菌实验效果如何?如果经培养检查有杂菌生长，你认为是什么原因造成的?

(2)如果你需要配制一种含有某抗生素的牛肉膏蛋白胨培养基，其抗生素的终浓度(或工作浓度)为50μg/ml，你将如何操作?

(3)过滤除菌应注意哪些问题?

实验3 土壤的稀释分离、纯化微生物及无菌操作技术

一、实验目的和内容

目的：学习从土壤中分离微生物的方法，学习无菌操作技术。

内容：

l．用稀释法分离细菌、放线菌和霉菌。 2．用平板划线方法分离微生物。

3．学习斜面接种及穿刺接种等无菌操作技术。 二、实验材料和用具

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和普通变形菌(Proteus vulgaris)斜面菌种。

已灭菌的牛肉膏、高氏1号、土豆蔗糖固体培养基各1瓶，49.5mL无菌水(带玻璃珠)1瓶，4.5mL无菌水6管，80%乳酸，10%酚液，95%乙醇。

无菌培养皿12套，1mL无菌移液管10支，土壤样品及天平、称量纸、药勺、试管架、玻璃铅笔、橡皮头(用75%乙醇浸泡)、玻璃刮。

三、操作步骤 (一)土壤稀释分离

1．取土壤 取表层以下5—10cm处的土样，放入无菌的袋中备用，或放在4℃冰箱中暂存。

2．制备稀释液(要无菌操作)

(1)制备土壤悬液：称土样0.5g，迅速倒入带玻璃珠的49.5mL无菌水瓶中(玻璃珠用量以充满瓶底力最好)，振荡5～10min，使土样充分打散，即成为10-2的土壤悬液。

(2)稀释：用无菌移液管吸10-2的土壤悬液0.5mL，放入4.5mL无菌水中即为10-3稀释液，如此重复，可依次制成10-3～10-8的稀释液(图3-1)。注意：操作时管尖不能接触液面，每一个稀释度换用一支移液管，每次吸入土液后，要将移液管插入液面，吹吸3次，每次吸上的液面要高于前一次，以减少稀释中的误差。 ]

图3—1 稀释法分离土壤微生物操作过程图解

3. 混菌法测定菌落数的方法

(1)细菌：取10-7、10-6两管稀释液各1mL，分别接人相应标号的平皿中，每个稀释度接两个平皿。然后取冷却至50℃的牛肉膏琼脂培养基，分别倒入以上培养皿中(装量以铺满皿底高1.5～2mm为宜)，迅速轻轻摇动平皿，使菌液与培养基充分混匀，但不沾湿皿的边缘，待琼脂凝固即成细菌平板。倒平板时要注意无菌操作，见图3-2。

图3—2 倒平板的方法

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（2）放线菌：取10、10两管稀释液，在每管中加入10%酚液5～6滴，摇匀，静置片刻，然后分别从两管中吸出1mL加入相应标号的平皿中，选用高氏1号培养基，用与细菌相同的方法倒入平皿中，便可制成放线菌平板。

（3）霉菌：取10-2、10-3两管稀释各1mL，分别接入相应标号的平皿中，每个稀释度接两个平皿。在融化的土豆蔗糖培养基中，每100mL加入灭菌的乳酸1mL，轻轻摇匀，然后用与细菌相同的方法倒入平皿中，便可制成霉菌的平板。

4．培养 将接种好的细菌、放线菌、霉菌平板倒置，即皿盖朝下放置，于28～30℃中恒温培养，细菌培养1～2d，放线菌培养5～7d，霉菌培养3～5d。观察生长的菌落，用于进一步纯化分离或直接转接斜面。

（二）平板制作及划线分离方法。

1．倒平板 按无菌操作要求，在火焰旁操作（图3—2），做法如3（1）。

2．划线分离 使用接种环，从待纯化的菌落或待分离的斜面菌种只沾取少量菌样，在相应培养基平板中划线分离，划线的方法多样，目的是获得单个菌落，主要方法参见图3—3。

图3—3 平板划线方法示意图

A. 划线分离操作; B.用于稀释液中, 可连接划线;

C. 用于较浓的菌样, 分数次划线, 每次划线后要烧接种环, 然后再划下一区。

3．培养 方法同“土壤稀释分离”。 （三）斜面接种和穿刺接种 1．斜面接种

（1）取新鲜固体斜面培养基，分别做好标记（写上菌名、接种日期、接种人等），然后用无菌操作方法，把待接菌种接入以上新鲜培养基斜面上。

（2）接种的方法是，用接种环沾取少量待接菌种，然后在新鲜斜面上“之”字形划线，方向是从下部开始，一直划至上部（图3—4A）。注意划线要轻，不可把培养基划破。

图3—4 斜面接种（A）及穿刺接种（B）示意图

（3）接种后30℃ 恒温培养，细菌培养48h，放线菌、霉菌培养至孢子成熟方可取出保存。

2．穿刺接种

（1）取两支新鲜半固体牛肉膏蛋白胨柱状培养基，做好标记（写上菌名）、接种日期，接种人等）。

（2）接种的方法是，用接种针沾取少量待接菌种，然后从柱状培养基的中心穿入其底部（但不要穿透），然后沿原刺入路线抽出接种针，注意接种针不要移动。

（3）接种后30℃恒温培养， 24h后观察，比较两种菌的生长结果。 四、注意事项

1．一般土壤中，细菌最多，放线菌及霉菌次之，而酵母菌主要见于果园及菜园土壤中，故从土壤中分离细菌时，要取较高的稀释度，否则菌落连成一片不能计数。

2．在土壤稀释分离操作中，每稀释10倍，最好更换一次移液管，使计数准确。 3．放线菌的培养时间较长，故制平板的培养基用量可适当增多。 五、实验报告

1．记录土壤稀释分离结果，并计算出每克土壤中的细菌、放线菌和霉菌的数量。 计算方法：选择长出菌落数30～300之间的培养皿进行计数，按以下公式： 总菌数/g=同一稀释度几次重复的菌落平均数3稀释倍数 2．分别记录平板划线、斜面接种的结果，并自我评价。 3．比较两种细菌穿刺接种的结果，并进行分析。 七、问题和思考

1．在测定土壤微生物含量中，除混菌法外还可用什么方法? 2．试设计实验，从土壤中分离出酵母菌，并进行计数。

实验4 微生物菌落的观察

一、实验目的和内容

目的：识别细菌、酵母菌、放线菌和霉菌四大类微生物的菌落特征。 内容：

1．观察已知菌的菌落的形态、大小、色泽、透明度、致密度和边缘等特征。 2．根据菌落的形态特征判断未知菌的类别。 二、实验材料和用具

大肠杆菌(E.coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粘红酵母(Rhodotorula gracitis)、热带假丝酵母(Candida tropicalis)、细黄链霉菌(Streptomyces microflavus，又称“5406”抗生菌)、灰色链霉菌(Streptomyces griseus )、黑曲霉(Aspergillus niger )、产黄青霉(Penicillium chrysogenum)、球孢白伍菌(Beauveria bassiana)等细菌的斜面菌种。

牛肉膏蛋白胨培养基、马铃薯培养基、高氏1号培养基、无菌水。 接种环、接种针、酒精灯、无菌培养皿多套、电热恒温箱。 三、操作步骤

(一)制备已知菌的单菌落

1．制备平板 将已融化的无菌培养基待冷却至50℃左右，分别制备牛肉膏蛋白胨培养基平板、马铃薯蔗糖培养基平板和高氏1号培养基平板各一皿。

2．制备菌悬液或孢子悬液 在培养好的斜面菌种管内加入5mL无菌水，制成菌悬液后备用。

3．制备单菌落 通过平板划线法获得细菌、酵母菌和放线菌的单菌落。用三点接种法获得霉菌的单菌落。细菌于37℃恒温培养24～48h，酵母菌于28℃培养2～3d，霉菌和放线菌置28℃培养5～7d，待长成菌落后，仔细观察四大类微生物菌落的形态特征，并将观察结果记录于表4-1中。

(二)制备未知菌落 l．倒平板

2．接种 可用弹土法接种，其要点为：采集校园土壤，待风干磨碎后，可将细土撒在无菌的硬板纸表面，先弹去纸面浮土，然后打开皿盖，便含土的纸面对着平板培养基的表

面，用手指在硬板纸背面轻轻一弹即可接种上各种微生物。

3．培养 将牛肉膏蛋白胨培养基平板倒置于37℃培养箱中恒温培养2～3d，将马铃薯蔗糖培养基倒置于28℃培养箱中恒温培养3～5d，即可获得未知菌的单菌落。

4．编号 从培养好的未知平板中，挑选8个不同的单菌落，逐个编号，根据菌落识别要点区分未知菌落类群，并将判断结果填入表4～2中。

(三)直接观察菌落

直接用实验3中的“土壤稀释分离”获得的单菌落进行观察识别，并将结果填入表4-2中。

四、注意事项

观察菌落特点时，要选择分离得很开的单个较大菌落；已知菌落和未知菌落要编好号，请勿随意移动开盖，以免搞混菌号。

五、实验报告

1．已知菌落的形态特征记录于表4～1中。 2．将未知菌落的辨别结果记录于表4～2中。 七、问题和思考

1．试比较细菌、放线菌、酵母菌和霉菌菌落形态的差异? 2．设计一个实验，检测实验室空气环境中的微生物类别?

表4—1 已知菌菌落的形态 微类生物数 厚薄 细菌 大肠杆菌 金黄色葡萄球菌 枯草杆菌 酵母菌 酿酒酵母 粘红酵母 热带假丝酵母 放线菌 细黄链霉菌 灰色链霉菌 霉菌 产黄青霉 黑曲霉 球孢白僵菌 菌名 辩别要点 湿 大小 松密 干 大小 表面 边缘 隆起形状 正面 菌落描述 颜色 反面 水溶性色素 透明度 表4—2 未知菌菌落的形态

菌落号 厚薄 湿 大小 松密 干 大小 表面 边缘 隆起形状 菌落描述 颜色 正面 反面 水溶性色素 透明 度 判断结果 1 2 1 2 3 4 5 6 7 8 注：四大类微生物菌落的识别要点如下：

小

菌落

干燥，正反面，中央与边缘颜色不一致

大而扁平????

小而扁平?? 细菌 大而扁平?? 大而隆起??酵母菌 小 小而致密 大

湿润：正反面颜色一致

大

大而致密?? 大而疏松??

霉菌

实验5 显微镜油浸系物镜的使用

一、实验目的和内容

目的：复习显微镜低倍镜和高倍镜的使用技术，了解油浸系物镜的基本原理，掌握油浸系物镜的使用方法。

内容：1．学习油浸系物镜的使用方法。

2．用油镜观察枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌染色装片。 二、实验材料和用具

枯草芽孢杆菌(Bacillus subitilis)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的染色装片。 香柏油、二甲苯、显微镜、擦镜纸。 三、操作步骤 (一)观察前的准备

1．将显微镜置于平稳的实验台上，镜座距实验台边沿约为4cm。坐正，练习用左眼观察。

2．调节光源：将低倍物镜转到工作位置，把光圈完全打开，聚光器升至与载物台相距约1mm左右。转动反光镜采集光源，光线较强的天然光源宜用平面镜，光线较弱的天然光源或人工光源宜用凹面镜，对光至视野内均匀明亮为止。观察染色装片时，光线宜强；观察末染色装片时，光线不宜太强。

(二)低倍镜观察染色装片

首先上升镜简，将枯草芽孢杆菌染色装片置于载物台上，用标本夹夹住，将观察位置移至物镜正下方，物镜降至距装片0.5cm处，适当缩小光圈然后两眼从目镜观察，转动粗调节器使物镜逐渐上升(或使镜台下降)至发现物像时，改用细调节器调节到物像清楚为止。移动装片，把合适的观察部位移至视野中心。

(三)高倍镜观察

眼睛离开目镜从侧面观察，旋转转换器，将高倍镜转至正下方，注意避免镜头与玻片相懂。再由目镜观察，仔细调节光圈，使光线的明亮度适宜。用细调节器校正焦距使物镜清晰为止。将最适宜观察部位移至视野中心，绘图。不要移动装片位置，准备用油镜观察。

(四)油镜观察

1．提起镜筒约2cm，将油镜转至正下方。在玻片标本的镜检部位(镜头的正下方)滴一滴香柏油。

2．从侧面注视，小心慢慢降下镜筒，使油镜浸在油中至油圈不扩大为止，镜头几乎与装片接触，但不可压及装片，以免压碎玻片，损坏镜头。

3．将光线调亮，左眼从目镜观察，用粗调节器将镜筒徐徐上升(切忌反方向旋转)，当视野中有物像出现时，再用细调节器校正焦距。如因镜头下降未到位或镜头上升太快末找到物像，必须再从侧面观察，将油镜降下，重复操作直至物像看清为止。仔细观察并绘图。

4．再次观察 提起镜筒，换上金黄色葡萄球菌染色装片，依次用低倍镜、高倍镜和油镜观察，绘图。重复观察时可比第一次少加香柏油。

(五)镜检完毕后的工作 1．移开物镜镜头。 2．取出装片。

3．清洁油镜，油镜使用完毕后，须用擦镜纸擦去镜头上的香柏油，再用擦镜纸沾少许二甲苯擦掉残留的香柏油，最后再用干净的擦镜纸擦干残留的二甲苯。

4．擦净显微镜，将各部分还原。将接物镜呈“八”字形降下，不可使其正对聚光器，同时降下聚光器，转动反光镜使其镜面垂直于镜座。最后套上镜罩，对号放入镜箱中，置阴凉干燥处存放。

四、注意事项

1．使用油镜必须按先用低倍镜和高倍镜观察，再用油镜观察

2．下降镜头时，一定要从侧面注视，切忌用眼睛对着目镜，边观察边下降镜头的错误操作，以免压碎玻片而损坏镜头。

3．使用二甲苯擦镜头时，注意二甲苯不能过多，以防溶解固定透镜的树脂。

4．注意保持显微镜的洁净，对金属部分要用软布擦拭，擦镜头必须用擦镜纸，切勿用手或用普通布、纸等，以免损坏镜头。

五、实验报告

分别绘出在高倍镜和油镜下观察到的枯草芽孢杆菌及金黄色葡萄球菌的形态，注明物镜放大倍数和总放大率。

六、问题和思考

1．用油镜便于观察细菌的依据是什么？ 2．使用油镜应特别注意哪些问题？

3．当物镜从低倍镜转到高倍镜和油镜时，对照明度有何要求？应如何调节？ 油镜的基本原理 （一）油镜头的辨认

油镜头上常刻有OI(oil immersion)或HI（homogeneneous immersion）字样，有的还刻有一圈红线或黑线标记，在低倍物镜、高倍物镜和油镜3物镜中，油镜的放大倍数和数值孔径（numerical aperture）最大，而工作距离最短（图5—1）

图5—1 显微镜物镜参数示意图

（二）显微镜的分辨率

显微镜性能的优劣不单是看它的总放大倍数，更重要的是看它分辩率的大小。分辨率是指显微镜能分辨出物体两点间最小距离（D）的能力。D值愈小表明分辨率愈高。D值与光线的波长（λ）成正比，与物镜的数值孔径（NA）成反比。

?

D? 2NA

从上式可看出，缩短光波长和增大数值孔径都可提高分辨率。

数值孔径指光线投射到物镜上的最大角度（称镜口角，α）的一半正弦与介质折射率（n）的乘积；

?NA?n?sin

2

影响数值孔径大小的因数，一是镜口角，二是介质的折射率。

当镜与装片之间的介质为空气时，由于空气（n= 1.52）的折射率不同，光线会发生折射，不仅使进入物镜的光线减少，降低了视野的照明度，而且会减少镜口角（图5—2A）。当以香柏油（n=1.515）为介质时，由于它的折射率与玻璃相近，光线经过载玻片后可直接通过香柏油进入物镜而不发生折射（图5—2B），不仅增加了视野的照明度，更重要的是通过增加数值孔径达到提高分辨率的目的。可见光的波长平均为0.55μm。当使用数值孔径为0.65的高倍镜时，它能辨别两点之间的距离为0.42μm；而使用数值孔径为1.25的油镜时，能辨别两点之间的距离则为0.22μm。

图5—2 介质为空气（A）与介质为香柏油（B）时光线通过的比较

实验6 细菌形态的观察

一、实验目的和内容

目的：巩固油镜的使用；掌握细菌形态观察的基本方法，了解细菌的基本形态。 内容：1．观察细菌的基本形态染色装片。

2．观察枯草芽孢杆菌活菌。

3．观察细菌细胞结构的染色装片。 二、实验材料和用具

溶血链球菌(Streptococcus haemolyticus )、棒杆菌(Corymebacterium)、螺菌(Spirillum)、浮游球衣菌(Sphaerotilus natans)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium )、苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis )、普通变形菌(Proteus vulgaris)、丙酮丁醇梭菌(Clostridum acetotylicum)、褐球固氮菌(Azotobacter chroococcum )等细菌的染色装片，枯草芽泡杆菌(Bacillus subis)的斜面菌种。

香柏油、二甲苯、无菌水；

显微镜、擦镜纸、接种环、酒精灯、载玻片、盖玻片、吸水纸、小滴管。 三、操作步骤

(一)观察细菌的基本形态

用低倍镜、高倍镜和油镜观察溶血链球菌、棒杆菌、螺菌、浮游球衣菌的染色装片，并分别在油镜下绘图。

(二)观察细菌的细胞结构

用低倍镜、高倍镜和油镜观察巨大芽孢杆菌(示细胞壁)、巨大芽孢杆菌(示异染粒)、苏云金芽孢杆菌(示伴胞晶体)、普通变形菌(示鞭毛)、丙酮丁醇梭菌(示芽孢)、褐球固氮菌(示荚膜)等细菌的染色装片，并分别在油镜下绘图。

(三)观察枯草杆菌活菌，常用压滴法观察。

1．将洁净无油腻的载片放于自己右边前方，在中央放一小滴无菌水。 2．将酒精灯放于自己正前方，点燃。

3．用无菌操作方法从枯草芽孢杆菌斜面中沾取少量菌体，与载片上的水滴充分混匀，把接种环上残留的菌体杀灭后，放回试管架。

4．用镊子夹一洁净的盖玻片，使其一边先接触菌液，然后将整个盖玻片慢慢放下，注意不要产生气泡。如菌液过多，可用吸水纸适当吸去一部分。

5．先用低倍镜然后转用高倍镜观察，观察时光线要适当调暗些。 四、注意事项

1．注意擦镜头时，只能用擦镜纸。

2，观察完毕，必须将镜筒上升，才能取下装片，放入另一装片后，要按使用油镜要求，重新操作，不能在油镜下直接取下和替换装片，切记！

3．无菌操作过程中，接种环灭菌后不能触及其他物品，挑菌不能过多。 五、实验报告 (一)绘图

l．给出你所观察到的几种细菌的个体形态视野图。

2．给出你所观察到的细菌细胞结构视野图，并注明各部分。 (二)试指出在制备活菌装片时，应注意什么问题? 七、问题和思考

1．用明视野显微镜观察细菌的形态时，你认为用染色装片好，还是用非染色的活体装片好，为什么?观察活体装片与染色装片，光线调节各有什么不同?

2．无菌操作过程中，可否将棉塞放在桌面上?为什么? 3试设计一个准备本实验的工作方案。

实验7 细菌单染色法及口腔微生物的观察

一、实验目的和内容

目的：巩固无菌操作技术，掌握细菌的涂片和单染色技术，了解口腔中的微生物及其观察方法。

内容：1.学习细菌单染色操作技术。

2. 用单染色法或负染色法观察口腔中的微生物。

二、实验材料和用具

大肠杆菌(E.coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylocosccus aureus)的斜面菌种。

吕氏美蓝染色液、石炭酸复红染色液、黑色素液或碳素墨水、香柏油、二甲苯、无菌水；

显微镜、擦镜纸、接种环、酒精灯、载玻片、吸水纸、无菌牙签。 三、操作步骤 (一)单染色法

1．涂片 在洁净无脂的载玻片中央滴一小滴无菌水，用无菌操作方法从菌种斜面挑取少量菌体与水滴充分混匀，涂成薄膜，涂布面积约1～1.5cm2(图7—1A、B)。

2．干燥 将涂片于室温中自然干燥。

3．固定 手扶载片一端，使涂菌的一面向上，将载片通过微火2～3次。在火上固定时，用手摸涂片反面，以不烫手为宜。不能将载片在火上烤，否则细菌形态毁坏(图7—1C)。

4．染色 将涂片置于水平位置，滴加染色液覆盖于涂菌处，染色约2min（图7—1D） 5．水洗 倾去染色液，斜置载片，用自来水的细水流由载片上端流下，不得直接冲在涂菌处，直洗至从载片上流下的水中无染色液的颜色为止（图7—1E）。

6．干燥 自然晾干或用吸水纸轻轻地吸干，注意不要擦掉菌体（图7—1F）。

7．待标本完全干燥后，先用低倍镜和高倍镜观察，将典型部位移至视野中央，再用油镜观察。

图7—1 单染色的方法

(二)口腔微生物的观察 1．单染色法

(1)在洁净无油腻的载片中央滴一小滴无菌水，用牙签取牙垢少许与水滴充分混匀，涂成薄膜。

(2)将涂片于室温中自然干燥后，按上面单染色法的步骤，进行固定、染色、水洗，干燥后镜检。

2．负染色法

(1)在洁净无油腻的载片的一端滴一小滴无菌水，用牙签取牙垢少许与水滴充分混匀，然后加少许黑色素溶液，充分混匀。

(2)另取一载片将其边缘放在含菌载片的一端，然后推向另一端，则含菌载片上的混合液被推成薄膜。

(3)于室温中自然干燥。

(4)镜检：将光线调亮，先用低倍镜观察，再用高倍镜观察。 四、注意事项

载玻片要洁净无脂，否则菌液涂不开。涂片时，滴水不要过多，挑菌量宜少，菌膜宜薄。

五、实验报告 (一)绘图

1．单染色后观察到的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的形态图。

2．你所观察到的口腔微生物的形态图，并注明使用的染色方法，菌体和背景的颜色。 (二)单染色法和负染色法操作要点。 七、问题和思考

1．涂片在染色前为什么要先进行固定?固定时应注意什么问题? 2．制备染色装片时应注意哪些事项，为什么?制片为什么要完全干燥后才能用油镜观察? 3．你知道口腔中通常存在哪些微生物吗?如何进行区分?

实验8 细菌的革兰氏染色

目的：初步掌握细菌涂片方法及革兰氏染色法步骤。 内容：1．制作细菌染色装片。

2．进行革兰氏染色法操作。 二、实验材料和用具

苏云金杆菌或金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大肠杆菌(E.coli)菌液，待测菌菌液1～2种。

革兰氏染色液(结晶紫染液、卢戈氏碘液、95%乙醇、石炭酸复红液等)、香柏油、二甲苯；显微镜、擦镜纸、接种环、载玻片、吸水纸、试管、小滴管、酒精灯。

三、操作步骤 (一)制片

1．涂菌 用无菌操作方法从试管中沾取菌液一环，用接种环在洁净无脂的载玻片上做一薄而均匀、直径约lcm的菌膜。涂菌后将接种环火焰灭菌。

2．干燥 于空气中自然干燥。亦可把玻片置于火焰上部略加温加速干燥(温度不宜过高)。

3．固定 目的是杀死细菌并使细菌粘附在玻片上，便于染料着色，常用加热法，即将细菌涂片膜向上，通过火焰3次，以热而不烫为宜，防止菌体烧焦、变形。此制片可用于染色。

(二)染色

l．初染 于制片上滴加结晶紫染液，染lmin后，用水洗去剩余染料。 2．媒染 滴加卢戈氏碘液，lmin后水洗。 3．脱色 滴加95%乙醇脱色，摇动玻片至紫色不再为乙醇脱退为止 (根据涂片之厚薄需时30s至lmin)，水洗。

4．复染 滴加石炭酸复红液复染lmin，水洗。 5．滤纸吸干，油镜镜检。 (三)结果

革兰氏阳性菌染成蓝紫色，革兰氏阴性菌染成淡红色。 (四)检测未知菌

用以上方法对未知菌进行革兰氏染色，并绘图、记录染色结果。 四、注意事项

1. 涂片务求均匀，切忌过厚。

2．在染色过程中，不可使染液干涸。

3．脱色时间十分重要，过长，则脱色过度，会使阳性菌被染成阴性菌；脱色不够，则会使阴性菌被染成阳性菌。

4．老龄菌因体内核酸减少，会便阳性菌被染成阴性菌，故不能选用。 五、实验报吉 (一)绘图

1．大肠杆菌革兰氏染色视野图。

2．金黄色葡萄球菌或苏云金杆菌革兰氏染色视野图。 (二)记录革兰氏染色法法步骤，并进行结果分析。 (三)未知菌的检测结果。 六、问题和思考

1．涂片后为什么要进行固定?固定时应注意什么? 2．什么是革兰氏染色法?染色过程应注意什么? 3．试分析革兰氏染色法在细菌分类中的意义。

实验9 细菌鞭毛染色及其运动的观察

一、实验目的和内容

目的：了解细菌鞭毛染色的原理，掌握鞭毛染色法；学习观察细菌运动的方法。 内容：1. 细菌的鞭毛染色法。

2．用压滴法观察细菌的运动。 3．用悬滴法观察细菌的运动。

二、实验材料和用具

普通变形菌(Proteus vulgaris)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)。

牛肉膏蛋白胨培养基斜面、鞭毛染色液、0.01%美蓝水溶液、香柏油、二甲苯、无菌水、凡士林；显微镜、擦镜纸、接种环、酒精灯、载玻片、凹载玻片、盖玻片、镊子、细玻棒、吸水纸。

三、操作步骤 (一)细菌鞭毛染色

1．活化菌种 将保存的变形菌在新制备的普通牛肉膏蛋白胨斜面培养基上连续移种2～3次，每次于30℃培养10～15h。活化后菌种备用。

2．制片 在干净载玻片的一端滴一滴蒸馏水，用无菌操作法，以接种环从活化菌种中取少许菌苔(注意不要带培养基)，在载玻片的水滴中轻沾几下。将载玻片稍倾斜，使菌液随水滴缓缓流到另一端，然后平放，于空气中干燥。

3．染色

(1)滴加鞭毛染色液A液，染3～5min。 (2)用蒸馏水充分洗净A液，使背景清洁。 (3)将残水沥干或用B液冲去残水。

(4)滴加B液，在微火上加热使微冒蒸汽，并随时补充染料以免干涸，染30～60S。 (5)待冷却后，用蒸馏水轻轻冲洗干净，自然干燥或滤纸吸干。

4．镜检 先用低倍镜和高倍镜找到典型区域，然后用油镜观察。菌体为深褐色，鞭毛为褐色。注意观察鞭毛着生位置(镜检时应多找几个视野，有时只在部分涂片上染出鞭毛)。

(二)细菌运动的观察 1．压滴法

(1)制备菌液：从幼龄菌斜面上，挑数环菌放在装有1～2mL无菌水的试管中，制成轻度混浊的菌悬液。

(2)取2～3环稀释菌液于洁净载玻片中央，再加入一环0.01%的美蓝水溶液，混匀。 (3)用镊子夹一洁净的盖玻片，先使其一边接触菌液，然后慢慢地放下盖玻片，这样可防止产生气泡。

(4)镜检：将光线适当调暗，先用低倍镜找到观察部位，再用高倍镜观察。要区分细菌鞭毛运动和布朗运动，后者只是在原处左右摆动，细菌细胞间有明显位移者，才能判定为有运动性。

2．悬滴法

(1)取洁净盖玻片，在四周涂少许凡士林。 (2)在盖玻片中央滴一小滴菌液（图9—1A）

(3)将凹玻片的凹窝向下，使凹窝中心对准盖玻片中央的菌液(图9-1B)，轻轻地盖在盖玻片上，便凹玻片与盖玻片粘在一起(注意液滴不得与凹玻片接触)。

(4)小心将玻片翻转过来，使菌液正好悬在窝的中央。再用火柴棒轻压盖玻片四周使封闭，以防菌液干燥。

（5）镜检：将光线适当调暗，先用低倍镜找到悬滴的边缘后(图9—1D)，再将菌液移至视野中央，换用高倍镜观察，注意细菌是如何运动的，它与分子布朗运动的不同。

图9—1 悬滴标本的制备

四、注意事项

1．鞭毛染色液最好当日配置当日用，次日使用则鞭毛染色浅，观察效果差。染色时一定要充分洗净A液后再加B液，否则背景不清晰。

2．观察细菌的运动，载玻片和盖玻片都要洁净无油，否则会影响细菌的运动。有些细菌，温度太低时不能运动。

五、实验报告

1．绘出你所观察到的细菌的形态及鞭毛着生情况。 2．试描述你所观察的细菌有无运动性，是如何运动的?

六、问题和思考

1．鞭毛染色的菌种为什么要先连续传几代，并且要采用幼龄菌种? 2．根据你的实验体会，哪些因素影响鞭毛染色的效果?如何控制?

3．试设计一实验，如何鉴别某种细菌是否能运动，是否有鞭毛，其鞭毛的着生位置。

实验10 细菌芽孢、荚膜的染色及观察

一、实验目的和内容

目的：掌握细菌的芽孢及荚膜染色方法。 内容：1．细菌的芽泡染色。

2．细菌的荚膜染色。 二、实验材料和用具

枯草芽孢杆菌、褐球固氮菌的斜面菌种。

二甲苯、香柏油、蒸馏水、5%孔雀绿水溶液、0.5%沙黄水溶液(或0.05%碱性复红)、绘图墨水(用滤纸过滤后备用)、95%乙醇、石炭酸复红染液；

显微镜、接种环、酒精灯、载玻片、盖玻片、小试管(l36.5cm)、烧杯(300mL)、滴管、试管夹、擦镜纸、吸水纸。

三、操作步骤 (一)芽孢染色法 1．方法1

(1)取37℃培养18～24h的枯草芽孢杆菌作涂片，并干燥，固定(参见“细胞单染色法”)。 (2)于涂片上滴人3～5滴5%孔雀绿水溶液。

(3)用试管夹夹住载玻片在火焰上用微火加热，自载玻片上出现蒸汽时，开始计算时间约4～5min。加热过程中切勿使染料蒸干，必要时可添加少许染料。

(4)倾去染液，待玻片冷却后，用自来水冲洗至孔雀绿不再褪色为止。 (5)用0.5%沙黄水溶液(或0.05%碱性复红)复染lmin，水洗。 (6)制片干燥后用油镜观察。芽孢呈绿色，菌体红色。 2．方法2

(1)加1～2滴自来水于小试管中，用接种环从斜面上挑取2～3环培养18～24h的枯草芽孢杆菌菌苔于试管中，并充分混匀打散，制成浓稠的菌液。

(2)加5%孔雀绿水溶液2～3滴于小试管中，用接种环搅拌使染料与菌液充分混合。 (3)将此试管浸于沸水浴(烧杯)中，加热15～20min。

(4)用接种环从试管底部挑数环菌于洁净的载玻片上，并涂成薄膜，将涂片通过微火3次固定。

(5)水洗，至流出的水中无孔雀绿颜色为止。

(6)加沙黄水溶液，染2～3min后，倾去染液，不用水洗，直接用吸水纸吸干。 (7)干燥后用油镜观察。芽孢绿色，菌体红色。 (二)荚膜染色法 1．石炭酸复红染色

（1）取培养了72h的褐球固氮菌制成涂片，自然干燥(不可用火焰烘干)。 （2）滴入1～2滴95%乙醇固定(不可加热固定)。

（3）加石炭酸复红染液染色1～2min，水洗，自然干燥。

(4) 在载玻片一端加一滴墨汁，另取一块边缘光滑的载玻片与墨汁接触，再以匀速推向另一端，涂成均匀的一薄层，自然干燥。

(5)干燥后用油镜观察。菌体红色，荚膜无色，背景黑色。 2．背景染色

(1)先加1滴墨水于洁净的玻片上，并挑少量褐球固氮菌与之充分混合均匀。

(2)放一清洁盖玻片于混合液上，然后在盖玻片上放一张滤纸，向下轻压，吸收多余的菌液。

(3)干燥后用油镜观察。背景灰色，菌体较暗，在其周围呈现一明亮的透明圈即荚膜。

四、注意事项

1．荚膜染色涂片不要用加热固定，以免荚膜皱缩变形。

2．供芽孢染色用的菌种应控制菌龄，使大部分芽孢仍保留在菌体上为宜。 五、实验报告 (一)绘图

1．枯草芽孢杆菌及巨大芽孢杆菌的菌体及芽孢形态，芽孢的着生位置。 2．褐球固氮菌菌体及荚膜的形态。

(二)试制片，但不进行染色，观察是否能看到芽孢和荚膜? 七、问题和思考

1．为什么芽孢染色要加热?为什么芽孢及营养体能染成不同的颜色? 2．组成荚膜的成分是什么?涂片一般用什么固定方法，为什么?

3．试设计实验如何鉴定某一产芽孢菌株的芽孢形态、着生位置及所属分类地位。

实验11 放线菌的形态观察

一、实验目的和内容

目的：辨认放线菌的营养菌丝、气生菌丝、孢子丝、孢子的形态；学习放线菌的观察方法。

内容：用水封计法、玻璃纸法、印片法观察放线菌的形态特征。 二、实验材料和用具

细黄链霉菌(streptomycs micuoflavus)又称5406的培养平皿，棘孢小单孢菌(Micromonospora echinospora)的玻璃纸培养平皿。

0.1%美蓝染色液、石炭酸复红染色液；

盖玻片、载玻片、镊子、接种环、显微镜、涂布器、玻璃纸、打孔器。 三、操作步骤

(一)观察自然生长状态的放线菌

用镊子小心取出用插片法培养的5406菌培养皿中的一张盖玻片，将其背面附着的菌丝体擦净。然后将长有菌的一面向上放在洁净的载玻片上，用低倍镜、高倍镜观察。找出3类菌丝及其分生孢子，并绘图。注意放线菌的基内菌丝、气生菌丝的粗细和色泽差异。

(二)水封片观察

取一滴美蓝染色液置于载玻片中央，将用搭片法培养棘孢小单孢菌培养皿中的盖玻片取出，并将有菌面朝下，放在载玻片上，浸在染色液中，制成水封片，用高倍镜观察其单个分生孢子及其基内菌丝，并绘图。

(三)玻璃纸法的镜检观察

l．直接玻璃纸观察 分别用5406和棘孢小单孢菌的玻璃纸制片观察。制片时，于载玻片上放一小滴蒸馏水，将含菌玻璃纸片小心剪下一小块，移至载玻片上，并使有菌面向上。在玻璃纸与载玻片间不能有气泡，以免影响观察。将制片于显微镜下观察，先用低倍镜观察菌的立体生长状况，再用高倍镜仔细观察。注意区分5406菌的基内菌丝、气生菌丝和弯曲状或螺旋状的孢子丝。观察棘孢小单孢菌时注意把视野调暗，其基内菌丝纤细发亮，其单个分生孢子发暗，直接生长在基内菌丝长出的小梗上。绘图。

2．印片染色法观察 用镊子取洁净载玻片并微微加热，然后用这微热载玻片盖在长有5406或棘孢小单孢菌的平皿上，轻轻压一下，注意将载玻片垂直放下和取出，以防载玻片水平移动而破坏放线菌的自然形态。反转有印痕的载玻片微微加热固定．用石炭酸复红染色l min，水洗，晾干。用油镜观察。绘图。注意比较两种菌的形态特征有何不同。

四、注意事项

1．培养放线菌中要注意，放线菌的生长速度较慢，培养期较长，在操作中应特别注意无菌操作，严防杂菌污染。

2．玻璃纸法培养接种时注意玻璃纸与平板琼脂培养基间不宜有气泡，以免影响其表面放线菌的生长，

3．不同观察方法中严格按要求进行，注意菌体的上下位置。

五、实验报告

1．绘图 玻璃纸法、水封片法、印片法及自然生长状态下观察的放线菌形态。 2．试比较5406菌与棘孢小单孢菌特征的异同。 六、问题和思考

1．在高倍镜或油镜下如何区分放线菌的基内菌丝和气生菌丝? 2．用插片法和搭片法如何制备放线菌标本，其主要优点是什么?可否用此法观察其他微生物?为什么?

3．以玻璃纸覆盖法培养和观察放线菌有何优点?试用此法设计一个观察青霉菌形态的实验。

注：

(一)插片法和搭片法培养放线菌 1．插片法

(1)制平板、接种：用冷却至约50℃的高氏1号琼脂培养基倒平板(每皿约20mL)，可用两种方法接菌：1、先接种后插片：冷凝后用接种环挑取少量斜面上的5406菌孢子，用平板培养基的一半面积作来回划线接种(接种量可适当加大)；2、先插片后接种：用平板培养基的另一半面积进行。

(2)插片及培养：用无菌镊子取无菌盖玻片，在已接种平板上以45°角斜插入培养基内，插人深度约占盖玻片1/2长度(图11-1A)。同时，在另一半未经接种的部位以同样方式插入数块盖玻片，然后接种少量5406菌孢子至盖玻片一侧的基部，且仅接种于其中央位置约占盖玻片长度的一半左右，以免菌丝蔓延至盖玻片的另一侧。将插片平板倒置于28℃，培养3～7d。

2．搭片法

(1)开槽及接种：用无菌打孔器在凝固后的平板培养基上打洞数个，并将棘孢小单孢菌孢子划线接种至洞内边缘。

(2)搭片及培养：在接种后的洞面上放一无菌盖玻片，平板倒置于28℃，培养3～7d（图11—1B）。

(二)玻璃纸法固体培养5406菌和棘孢小单孢菌

1．玻璃纸灭菌 将玻璃纸剪成比培养皿直径略小的片状，将滤纸剪成培养皿大小的圆形纸片并稍润湿，然后把 滤纸和玻璃纸交互重叠地放在培养皿中，借滤纸将玻璃纸隔开。然后进行湿热灭菌，备用。

图11—1 放线菌的插片与搭片培养示意图

A. 插片法； B. 搭片法

2．制平板及铺玻璃纸 取冷凝后的高氏1号琼脂培养基，用无菌镊子将预先灭菌的块状玻璃纸平铺至平板培养表面，铺玻璃纸时可用无菌涂布器将玻璃纸与培养基之间的气泡除去。

3．涂布菌液及培养 取0.l mL的孢子悬液涂布在铺有玻璃纸的平板培养基表面。接种平板倒置于28℃，培养 5～7d。

实验12 酵母菌的形态观察

一、实验目的和内容

目的：了解自然存在的酵母菌及其形态结构。了解酵母菌产生子囊孢子的条件及其形态。

内容：

1．观察酵母菌个体形态。

2．观察酵母菌的假菌丝和繁殖过程。 3．观察自然状态的酵母菌。 二、实验材料和用具

酿酒酵母(Saccharomyes cerevisiae)、热带假丝酵母(Candida tropicalis)斜面菌种。

PDA培养基、麦氏(McCLary)培养基(醋酸钠培养基)、0.05%美蓝染色液(以pH6.0的0.02mol/L磷酸缓冲液配制)、碘液、0.04%的中性红染色液%孔雀绿，0.5%沙黄液、95%乙醇；

显微镜、载玻片、擦镜纸、盖玻片、接种环、V形玻璃棒、放置一个三角形玻璃棒支架的培养皿。

三、操作步骤

(一)酵母菌形态观察

1．酵母菌的话体染色观察及死亡率的测定

(1)以无菌水洗下PDA斜面培养的酿酒酵母菌苔，制成菌悬液。

(2)取0.05%美蓝染色液1滴，置载玻片中央，并用接种环取酵母菌悬液与染色液混匀，染色2～3min，加盖玻片，在高倍镜下观察酵母菌个体形态，区分其母细胞与芽体，区分死细胞(蓝色)与活细胞(不着色)。

(3)在一个视野里计数死细胞和活细胞，共计数5～6个视野。 酵母菌死亡率一般用百分数来表示，以下式来计算：

死亡率=死细胞总数÷死活细胞总数3100%

2．酵母菌液泡系的话体观察 于洁净载玻片中央加一滴中性红染色液，取少许上述酵母菌悬液与之混合，染色5min，加盖玻片在显微镜下观察。细胞无色，液泡呈红色。

3．酵母菌细胞中肝糖粒的观察 将1滴碘液置于载玻片中央，接人上述酵母菌悬液，混匀，盖上盖玻片，显微镜观察，细胞内的贮藏物质肝糖颗粒呈深红色。

4．酵母菌子囊孢子的观察

(1)活化酿酒酵母：将酿酒酵母接种至新鲜的麦芽汁培养基上，置28C培养2～3d，然后再移植2～3次。

(2)转接产孢培养基：将活化的酿酒酵母转接至醋酸钠培养基上，置30℃恒温培养14d。 (3)观察：挑取少许产孢菌苔于载玻片的水滴上，经涂片、热固定后，加数滴孔雀绿，lmin后水洗，加95%乙醇30S，水洗，最后用0.5%沙黄液复染30S，水洗去染色液，最后用吸水纸吸干。制片干燥后，镜检，子囊孢子呈绿色，子囊为粉红色。注意观察子囊孢子的数目、形状和子囊的形成率。

(4)计算子囊形成的百分率：计数时随机取3个视野，分别计数产子囊孢子的子囊数和不产孢子的细胞，然后按下列公式计算：

子囊形成率（%）=3个视野中形成子囊的总数

÷3个视野中（形成子囊的总数+不产孢子细胞总数）3100%

5．酵母菌假菌丝的观察 取一无菌载玻片浸于溶化的PDA培养基中，取出放在温室培养的支架上，待培养基凝固后，进行酵母菌划线接种，然后将无菌盖玻片盖在接菌线上(图12—1)，28℃培养2～3d后，取出载玻片，擦去载玻片下面的培养基，在显微镜下直接观察。可见到芽殖酵母形成的藕节状假菌丝，裂殖酵母则形成竹节状假菌丝(图12—2)。

图12—1 酵母菌假菌丝的培养 图12—2 酵母菌的假菌丝形态

A. 藕节状假菌丝； B.竹节状假菌丝

6．自然状态下的酵母菌观察 取一滴美蓝染色液于载玻片中央，春夏秋季取酱油或淹菜上的白膜，冬季取腌酸菜汤上的白膜，将其置于载玻片染色液中，盖上盖玻片，显微镜下仔细观察酵母菌形态，出芽生殖，假菌丝等。

四、注意事项

1．用于活化酵母菌的麦芽汁培养基要新鲜、表面湿润。 2．在产孢培养基上加大移种量，可提高子囊形成率。 3．通过微加热增加酵母的死亡率，易于观察死亡细胞。 五、实验报告 (一)绘图

1．数个酵母菌细胞，示观察到的结构。 2．数个子囊及子囊孢子形态图。

(二)记录并计数酵母菌的死亡率及子囊形成率(原始记录及计算结果)。 六、问题和思考

1．酵母菌的假菌丝是怎样形成的?与霉菌的真菌丝有何区别? 2．如何区别营养细胞和释放出的子囊孢子?

3．试设计一个从子囊中分离子囊孢子的试验方案。 注：

酵母菌的简易培养 配2%葡萄糖水(或自糖水)，煮沸，装入三角瓶中(液面高度2～2cm )，加HCl调至pH3～5放入几块葡萄皮（或其他糖分较高的果皮），置5～28℃温箱中培养2～3d，闻到酒香味后，即可取培养液镜检。

实验13 霉菌的形态观察

一、实验目的和内容

目的：了解霉菌形态，掌握微生物载玻片湿室培养方法。 内容：1．霉菌载玻片湿室培养。

2．曲霉、青霉、根霉、毛霉形态观察。 3．根霉假根的观察。

二、实验材料和用具

产黄青霉(Penicfillium chrysogenum)、黑曲霉(Aspergillus niger)、黑根霉(Rhizopus nigrians)、总状毛霉(Mucor racemosus)等斜面菌种。

半固体PDA培养基、乳酸苯酚固定液、棉蓝染色液、20%甘油;

透明胶带、剪刀、培养皿、载玻片、口形玻棒搁架、盖玻片、圆形滤纸片、细口滴管、镊子、显微镜、接种环。

三、操作步骤

(一)霉菌的载玻片湿室培养

可4人合作，每人制作一霉菌的载玻片。

1．准备湿室 在培养皿底铺一张圆形滤纸片，其上放一“冂”形载玻片搁架，在搁梁上放一块载玻片和两块盖玻片，盖上皿盖，外用纸包扎，经12lC湿热灭菌30min后，置60℃烘箱中烘干，备用。

2．接种 用接种环挑取少量待观察的霉菌孢子至湿室内的载玻片上，每张载玻片可接同一菌种的孢子两处。接种时只要将带菌的接种环在载玻片上轻轻碰几下即可(务必记住接种的位置)。

3．加培养基 用无菌细口滴管吸取少量融化约60℃的培养基，滴加到载玻片的接种处，培养基应滴得圆而薄，其直径约为0.5cm(滴加量一般以l/2小滴为宜)。

4．加盖玻片 在培养基未彻底凝固前．用无菌镊子将皿内盖玻片盖在琼脂块薄层上，用镊子轻压，使盖玻片和载玻片间的距离相当接近，但不能压扁，否则不透气。

5．倒保湿剂 每皿倒大约3mL 20%的无菌甘油，使皿内的滤纸完全润湿，以保持皿内湿度，皿盖上注明菌名、组别和接种日期。此为制成的载玻片湿室，置28℃恒温培养3～5d。

(二)黑根霉假根的培养

将融化的PDA培养基，冷却至50℃倒入无菌平皿，其量约为平皿高度的l/2。冷凝后，用接种环沾取根霉孢子，在平板表面划线接种。然后将平皿倒置，在皿盖内放一无菌载玻片，于28℃培养2～3d后，可见根霉的气生菌丝倒挂成胡须状，有许多菌丝与载玻片接触，并在载玻片上分化出假根和匍匐菌丝等结构（图13—1）。

图13—1 根霉假根的培养

(三)镜检观察

1．湿室培养霉菌镜检载玻片 从培养16～20h开始，通过连续观察，可了解孢子的萌发、菌丝体的生长分化和子实体的形成过程。将湿室内的载玻片取出，直接置于低倍镜和高倍镜下观察曲霉、青霉、毛霉、根霉等霉菌的形态，重点观察菌丝是否分隔，曲霉和青霉的分生孢子形成特点，曲霉的足细胞，根霉和毛霉的孢子囊和孢囊孢子。绘图。

2．粘片观察 取一滴棉蓝染色液置于载玻片中央，取一段透明胶带，打开霉菌平板培养物，粘取菌体，粘面朝下，放在染液上。镜检。

3．假根观察 将培养根霉假根的平皿打开，取出皿盖内的载玻片标本，在附着菌丝

体的一面盖上盖玻片，置显微镜下观察。只要用低倍镜就能观察到假根及从根节上分化出的孢子囊梗、孢子囊、孢囊孢子和两个假根间的匍匐菌丝，观察时注意调节焦距以看清各种构造。

4．制成永久装片 把观察到霉菌形态较清晰，完整的片子，制成标本作较长期保存。制备方法是，轻轻揭去盖玻片，如果载玻片上有琼脂，仔细挑去，然后滴加少量乳酸苯酚固定液，盖上清洁盖玻片，在盖玻片四周滴加树胶封固。

四、注意事项

载玻片湿室培养时，盖玻片不能紧贴载玻片，要彼此有极小缝隙，一是为了通气；二是使各部分结构平行排列，易于观察。

五、实验报告

(一)绘制镜检形态图

1．毛霉和根霉形态图，示各部。 2．青霉和曲霉形态图，示各部 （二）载玻片观察记录

各菌种的载玻片标本观察结果： 菌种 菌丝体 色泽、菌丝有隔或无隔等） 无性孢子特征（孢子着生特征等） 其他特征结构 （有无假根、足细胞匍匐菌丝、囊轴等） （气生菌丝、营养菌丝的粗细、梗的分化特征，孢子 六、问题和思考 1．什么叫载玻片湿室培养?它适用于观察怎样的微生物，有何优点? 2．湿室培养时为何用20%甘油作保湿剂?

3．本实验中观察假根的设计原理是什么?此设计还适合于培养哪类菌。

实验14 细菌大小的测定

一、实验目的和内容

目的：学会测微尺的使用和计算方法及对球菌和杆菌的测量。 内容：1. 认识测微尺，学习目镜测微尺的标定。

2．测定金黄色葡萄球菌和大肠杆菌菌体的大小。 二、实验材料和用具

金黄色葡萄球菌、大肠杆菌的玻片标本。 香柏油、二甲苯；

显微镜、目镜测微尺、镜台测微尺、擦镜纸。 三、操作步骤

l．测微尺的构造 显微镜测微尺是由目镜测微尺和镜台接物测微尺组成，目镜测微尺是一块圆形玻璃片，其中有精确的等分刻度，在5mm刻尺上分50份(图14一lC)。目镜测微尺每格实际代表的长度随使用接目镜和接物镜的放大倍数而改变，因此在使用前必须用镜台测微尺进行标定。

镜台测微尺为一专用中央有精确等分线的载玻片(图14—1A)，一般将长为1mm的直线等分成100个小格，每格长0.0lmm即10μm，是专用于校正目镜测微尺每格长度的。

2．目镜测微尺的标定 把目镜的上透镜旋开，将目镜测微尺轻轻放在目镜的隔板上，使有刻度的一面朝下。将镜台测微尺放在显微镜的载物台上，使有刻度的一面朝上。先用低倍镜观察，调焦距，待看清镜台测微尺的刻度后，转动目镜，使目镜测微尺的刻度与镜台测微尺的刻度相平行，并使两尺左边的一条线重合，向右寻找另外一条两尺相重合的直线(图15—lB)。

3．计算方法 标定公式：

目镜测微尺每格长度（μm）=两条重合线间镜台测微尺的格数310

÷两条重合线间目镜测微尺的格数

例如，目镜测微尺20个小格等于镜台测微尺3小格，已知镜台测微尺每格为10μm，则3小格的长度为3310=30μm，那么相应地在目镜测微尺上每小格长度为3310÷20=1.5μm。用以上计算方法分别校正低倍镜、高倍镜及油镜下目镜测微尺每格实际长度。

4．菌体大小的测定 将镜台测微尺取下，分别换上大肠杆菌及金黄色葡萄球菌玻片标本，先在低倍镜和高倍镜下找到目的物，然后在油镜下用目镜测微尺测量菌体的大小。先量出菌体的长和宽占目镜测微尺的格数，再以目镜测微尺每格的长度计算出菌体的长和宽。并详细记录于表15—1中。

例如，目镜测微尺在这架显微镜下，每格相当于1.5μm，测量的结果，若菌体的平均长度相当于目镜测微尺的2格，则菌体长应为331.5μm=3.0μm。

一般测量菌体的大小，应测定10～20个菌体，求出平均值，才能代表该菌的大小。 四、注意事项

1．镜台测微尺的玻片很薄，在标定油镜头时，要格外注意，以免压碎镜台测微尺或损坏镜头。

2．标定目镜测微尺时要注意准确对正目镜测微尺与镜台测微尺的重合线。 五、演示

1．目镜测微尺、镜台测微尺的显微镜下示教。 2．标定及测量方法示范。 六、实验报告

1．目镜测微尺标定结果：

低倍镜下 倍目镜测微尺每格长度是 μm。 高倍镜下 倍目镜测微尺每格长度是 μm。 油镜下 倍目镜测微尺每格长度是 μm。 2．菌体大小测定结果： 菌号 大肠杆菌测定结果 目镜测微尺格数 宽 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 均值 长 实际长度 宽 长 金黄色葡萄球菌的直径大小测定结果 目镜测微尺格数 实际直径/μm 试与己知的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的大小作一比较是否一致？为何？ 七、问题和思考

1．为什么更换不同放大倍数的目镜和物镜时必须重新用镜台测微尺对目镜微尺进行标定？

2．若目镜不变，目镜测微尺也不变，只改变物镜，那么目镜测微尺每格所测量的镜台上的菌体细胞的实际长度（或宽度）是否相同？为什么？

实验15 微生物数量的测定

细菌群体生长表现为细胞数目的增加或细胞物质的增加。测定细胞数目的方法有显微镜直接计数法(direct microscopic count)、平板菌落计数法(plate count)、光电比油法(turbidity estimation by spectrophotometer)、最大或然数法(most probable number MPN)以及膜过滤法(membrane filtration)等。测定细胞物质的方法有细胞干重的测定，细胞某种成分如氮的含量、RNA和DNA的含量测定，代谢产物的测定等。总之，测定微生物生长量的方法很多，各有优缺点，工作中应根据具体情况要求加以选择。

本实验主要介绍生产、科研工作中比较常用的显微镜直接计数法、平板菌落计数法和光电比浊计数法。

一 显微镜直接计数法 （一）目的要求

1．明确血细胞计数板计数的原理。

2．掌握使用血细胞计数板进行微生物计数的方法。 （二） 基本原理

显微镜直接计数法是将小量待测样品的悬浮液置于一种特别的具有确定面积和容积的载玻片上(又称计菌器)，于显微镜下直接计数的一种简便、快速、直观的方法。目前国内外常用的计菌器有：血细胞计数板、Peteroff-Hauser计菌器以及Hawksley计菌器等，它们都可用于酵母、细菌、霉菌孢子等悬液的计数，基本原理相同。后两种计菌器由于盖上盖玻片后，总容积为0.02mm3，而且盖玻片和载波片之间的距离只有0.02mm，因此可用油浸物镜对细菌等较小的细胞进行观察和计数。除了用这些计菌器外，还有在显微镜下直接观察涂片面积与视野面积之比的估算法，此法一般用于牛乳的细菌学检查。显微镜直接计数法的优点是直观、快速、操作简单。但此法的缺点是所测得的结果通常是死菌体和活菌体的总和。目前已有一些方法可以克服这一缺点，如结合活菌染色微室培养（短时间）以及加细胞分裂抑制剂等方法来达到只计数活菌体的目的。本实验以血球计数板为例进行显微镜直接计数。另外两种计菌器的使用方法可参看各厂商的说明书。

用血细胞计数板在显微镜下直接计数是一种常用的微生物计数方法。该计数板是一块特制的载玻片，其上由四条槽构成三个平台；中间较宽的平台又被一短横槽隔成两半，每一边的平台上各列有一个方格网，每个方格网共分为九个大方格，中间的大方格即为计数室。血细胞计数板构造如图l5-1。计数室的刻度一般有两种规格，一种是一个大方格分成25个中方格，而每个中方格又分成16个小方格(图15—2)；另一种是一个大方格分成16个中方格，而每个中方格又分成25个小方格，但无论是哪一种规格的计数板，每一个大方格中的小方格都是400个。每一个大方格边长为lmm，则每一个大方格的面积为lmm2，盖上盖玻片后，盖玻片与载玻片之间的高度为0.lmm，所以计数室的容积为0.lmm3(万分之一毫升)。

图15—1 血细胞计数板构造（一） 图15—2 血细胞计数板构造（二）

A. 正面图；B.纵切面图； 放大后的方格网，中间大方格为计数室

1.血细胞计数板；2. 盖玻片；3.计数室

计数时，通常数五个中方格的总菌数，然后求得每个中方格的平均值，再乘上25或16，

就得出一个大方格中的总菌数，然后再换算成lml菌液中的总菌数。

设五个中方格中的总菌数为A，菌液稀释倍数为B，如果是25个中方格的计数板，则

1mL菌液中的总菌数=A/53253103B=50000A2B（个）

4

同理，如果是16个中方格的计数板，

1mL菌液中的总菌数=A/53163103B=32000A2B（个）

4

（三）器材

1．菌种 酿酒酵母

2．仪器或其他用具 血细胞计数板，显微镜，盖玻片，无菌毛细滴管。 （四）操作步骤 l．菌悬液制备

以无菌生理盐水将酿酒酵母制成浓度适当的菌悬液。 2．镜检计数室

在加样前，先对计数板的计数室进行镜检。若有污物，则需清洗，吹干后才能进行计数。

3．加样品

将清洁干燥的血细胞计数板盖上盖玻片，再用无菌的毛细滴管将摇匀的酿酒酵母菌悬液由盖玻片边缘滴一小滴，让菌液沿缝隙靠毛细渗透作用自动进入计数室，一般计数室均能充满菌液。

取样时先要摇匀菌液；加样时计数室不可有气泡产生。 4．显微镜计数

加样后静止5min，然后将血细胞计数板置于显微镜载物台上，先用低倍镜找到计数室所在位置，然后换成高倍镜进行计数。

调节显微镜光线的强弱适当，对于用反光镜采光的显微镜还要注意光线不要偏向一边，否则视野中不易舌清楚计数室方格线，或只见竖线或只见横线。

在计数前若发现菌液太浓或太稀，需重新调节稀释度后再计数。一般样品稀释度要求每小格内约有5~10个菌体为宜。每个计数室选5个中格(可选4个角和中央的一个中格)中的菌体进行计数。位于格线上的菌体一般只数上方和右边线上的。如遇酵母出芽，芽体大小达到母细胞的一半时，即作为两个菌体计数。计数一个样品要从两个计数室中计得的平均数值来计算样品的含菌量。

5．清洗血细胞计数板

使用完毕后，将血细胞计数板在水龙头用水冲洗干净，切勿用硬物洗刷，洗完后自行晾干或用吹风机吹干。镜检，观察每小格内是否有残留菌体或其他沉淀物。若不干净，则必须重复洗涤至干净为止。

（五）实验报告 l．结果

将结果记录于下表中。A表示五个中方格中的总菌数；B表示菌液稀释倍数。

各中格中菌数 A B 二室平均值 菌数/ml 1 第一室 第二室 2 3 4 5 2．思考题 (1)根据你的体会，说明用血细胞计数板计数的误差主要来自哪些方面?应如何尽量减少误差．力求准确?

(2)某单位要求知道一种干酵母粉中的活菌存活率，请设计1～2种可行的检测方法。 二 平板菌落计数法 （一）目的要求

学习平板菌落计数的基本原理和方法。 （二）、基本原理

平板菌落计数法是将待测样品经适当稀释之后，其中的微生物充分分散成单个细胞，取一定量的稀释样液接种到平板上，经过培养，由每个单细胞生长繁殖而形成肉眼可见的菌

落，即一个单菌落应代表原样品中的一个单细胞。统计菌落数，根据其稀释倍数和取样接种量即可换算出样品中的含菌数。但是，由于待测样品往往不易完全分散成单个细胞，所以，长成的一个单菌落也可来自样品中的2～3或更多个细胞。因此平板菌落计数的结果往往偏低。为了清楚地阐述平板菌落计数的结果，现在已倾向使用菌落形成单位(colony-forming units，cfu)而不以绝对菌落数来表示样品的活菌含量。

平板菌落计数法虽然操作较繁，结果需要培养一段时间才能取得，而且测定结果易受多种因素的影响，但是，由于该计数方法的最大优点是可以获得活菌的信息，所以被广泛用于生物制品检验(如活菌制剂)，以及食品、饮料和水(包括水源水)等的含菌指数或污染程度的检测。

（三）器材

1．菌种 大肠杆菌菌悬液。

2．培养基 牛肉膏蛋白陈培养基。

3．仪器或其他用具lm1无菌吸管，无菌平皿，盛有4.5ml无菌水的试管，试管架，恒温培养箱等。

（四）操作步骤 l．编号

取无菌平皿9套，分别用记号笔标明10-4、10-5、10-6。(稀释度)各3套。另取6支盛有4.5mL无菌水的试管，依次标是10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6。

2．稀释

用lmL无菌吸管吸取lmL已充分混匀的大肠杆菌菌县液(待测样品)，精确地放0.5ml至10-1的试管中，此即为10倍稀释。将多余的菌液放回原菌液中。

将10-1试管置试管振荡器上振荡，使菌液充分混匀。另取一支lml吸管插入10-1试管中来回吹吸菌悬液三次，进一步将菌体分散、混匀。吹吸菌液时不要太猛太快，吸时吸管伸人管底，吹时离开液面，以免将吸管中的过滤棉花浸湿或使试管内液体外溢。用此吸管吸取10-1菌液lmL，精确地放0.5mL至10-2试管中，此即为100倍稀释。??其余依次类推，整个过程如图15-3所示。

放菌液时吸管尖不要碰到液面，即每一支吸管只能接触一个稀释度的菌悬液，否则稀释不精确，结果误差较大。

3，取样

用三支1mL无菌吸管分别吸取10-4、10-5和10-6。的稀释菌悬液各lmL，对号放入编好号的无菌平皿中，每个平皿放0.2mL。

不要用lmL吸管每次只靠吸管尖部吸0.2mL稀释菌液放入平皿臼，这样容易加大同一稀释度几个重复平板间的操作误差。

图15—3 平板菌落计数操作步骤

4．倒平板．

尽快向上述盛有不同稀释度菌液的平皿中倒入融化后冷却至45℃左右的牛肉膏蛋白胨培养基约15毫升/平皿，置水平位置迅速旋动平皿，使培养基与菌液混合均匀，而又不使培养基荡出平皿或溅到平皿盖上。

由于细菌易吸附到玻璃器皿表面，所以菌液加入到培养皿后，应尽快倒入融化并于已冷却至45℃左右的培养基，立即摇匀，否则细菌将不易分散或长成的菌落连在一起，影响计数。

待培养基凝固后，将平板倒置于37℃恒温培养箱中培养。 5．计数

培养48h后，取出培养平板，算出同一稀释度三个平板上的菌落平均数，并按下列公式进行计算，

每毫升中菌落形成单位(cfu)=同一稀释度三次重复的平均菌落数3稀释倍数35

一般选择每个平板上长有30~300个菌落的稀释度计算每毫升的含菌量较为合适。同一稀释度的三个重复对照的菌落数不应相差很大，否则表示试验不精确。实际工作中同一稀释度重复对照平板不能少于三个，这样便于数据统计，减少误差。由10-4、10-5、10-6三个稀释度计算出的每毫升菌液中菌落形成单位数也不应相差太大。

平板菌落计数法，所选择倒平板的稀释度是很重要的。一般以三个连续稀释度中的第二个稀释度倒平板培养后所出现的平均菌落数在50个左右为好，否则要适当增加或减少稀释度加以调整。

平板菌落计数法的操作除上述倾注倒平板的方式以外，还可以用涂布平板的方式进行。二者操作基本相同，所不同的是后者先将牛肉膏蛋白胨培养基融化后倒平板，待凝固后编号，并于37℃左右的温箱中烘烤30min，或在超静工作台上适当吹干，然后用无菌吸管吸取稀释好的菌液对号接种于不同稀释度编号的平板上，并尽快用无菌玻璃涂棒将菌液在平板上涂布均匀，平放于实验台上20～30min，使菌液渗入培养基表层内，然后倒置37℃的恒温箱中培养24～48h。

涂布平板用的菌悬液量一般以0.1ml较为适宜，如果过少菌液不易涂布开，过多则在涂布完后或在培养时菌液仍会在平板表面流动，不易形成单菌落。

五、实验报告 1．结果

2．将培养后菌落计数结果填入下表 10-4 10-5 10-6 稀释度 Cfu数/平板 1 2 3 平均 1 2 3 平均 1 2 3 平均 每毫升中的cfu 2．思考题 (1)为什么融化后的培养基要冷却至45℃左右才能倒平板? (2)要使平板菌落计数准确，需要掌握哪几个关键?为什么?

(3)试比较平板菌落计数法和显微镜下直接计数法的优缺点及应用。

(4)当你的平板上长出的菌落不是均匀分散的而是集中在一起时，你认为问题出在哪里? (5)用倒平板法和涂布法计数，其平板上长出的菌落有何不同?为什么要培养较长时间(48h)后观察结果?

三 光电比浊计数法 一、目的要求

1．了解光电比浊计数法的原理。

2．学习、掌握光电比浊计数法的操作方法。 二、基本原理

当光线通过微生物菌悬液时，由于菌体的散射及吸收作用使光线的透过量降低。在一定的范围内，微生物细胞浓度与透光度成反比，与光密度成正比，而光密度或透光度可以由

光电池精确测出(图15-4)。因此，可用一系列已知菌数的菌悬液测定光密度，作出光密度—菌数标准曲线。然后，以样品液所测得的光密度，从标准曲线中查出对应的菌数。制作标准曲线时，菌体计数可采用血细胞计数板计数，平板菌落计数或细胞干重测定等方法。本实验采用血细胞计数板计数。

光电比浊计数法的优点是简便、迅速，可以连续测定，适合于自动控制。但是，由于光密度或透光度除了受菌体浓度影响之外，还受细胞大小、形态、培养液成分以及所采用的光波长等因素的影响。因此，对于不同微生物的菌悬液进行光电比浊计数应采用相同的菌株和培养条件制作标准曲线。光波的选择通常在400~700nm之间，具体到某种微生物采用多少还需要经过最大吸收波长以及稳定性试验来确定。另外，对于颜色太深的样品或在样品中还含有其他干扰物质的悬液不适合用此法进行测定。

图15—4 比浊法测定细胞浓度的原理

（三）器材

1．菌种 酿酒酵母培养液

2．仪器或其他用具 721型分光光度计，血细胞计数板，显微镜，试管，吸水纸，无菌吸管，无菌生理盐水等。

（四）操作步骤 1．标准曲线制作

（1）编号 取无菌试管7支，分别用记号笔将试管编号为1、2、3、4、5、6、7。 （2）调整菌液浓度 用血细胞计数板计数培养24小时的酿酒酵母菌悬液，并用无菌

666666

生理盐水分别稀释调整为每毫升1310、2310、4310、6310、8310、10310、1236

10含菌数的细胞悬液。再分别装入已编好号的1至7号无菌试管中。

（3）测OD值 将1至7号不同浓度的菌悬液摇均匀后于560nm波长、1cm比色皿中测定OD值。比色测定时，用无菌生理盐水作空白对照，并将OD值填入下表 1 2 3 4 5 6 7 8 管号 细胞数106/ml 光密度（OD） 每管菌悬液在测定OD值时均必须先摇匀后再倒入比色皿中测定 (4)以光密度(OD)值为纵坐标，以每毫升细胞数为横坐标，绘制标准曲线。 2．样品测定

将待测样品用无菌生理盐水适当稀释，摇均匀后，用560nm波长、lcm比色皿测定光密度。测定时用无菌生理盐水作空白对照。

各种操作条件必须与制作标准曲线时的相同，否则，测得值所换算的含菌数就不准确。 3．根据所测得的光密度值，从标准曲线查得每毫升的含菌数。 （五）实验报告 l．结果

每毫升样品原液菌数=从标准曲线查得每毫升的菌数3稀释倍数

2．思考题

(1)光电比浊计数的原理是什么?这种计数法有何优缺点? (2)光电比浊计数在生产实践中有何应用价值?

(3)本实验为什么采用560nm波长测定酵母菌悬液的光密度?如果你在实验中需要测定大肠杆菌生长的OD值，你将如何选择波长?

四 大肠杆菌生长曲线的测定 (一)目的要求

1．通过细菌数量的测量了解大肠杆菌的生物特征和规律，绘制生长线。 2．复习光电比浊法测量细菌数量的方法。 (二)基本原理

大多数细菌的繁殖速率很快，在合适的条件下，一定时期的大肠杆菌细胞每20min分裂一次。将一定量的细菌转入新鲜液体培养基中，在适宜的条件下培养细胞要经历延迟期，对数期、稳定期和衰亡期四个阶段。以培养时间为横坐标，以细菌数目的对数或生长速率为纵坐标作图所绘制的曲线称为该细菌的生长曲线。不同的细菌在相同的培养条件下其生长曲线不同，同样的细菌在不同的培养条件下所绘制的生长曲线也不相同。测定细菌的生长曲线，了解其生长繁殖规律，这对人们根据不同的需要，有效地利用和控制细菌的生长具有重要意义。

用于测定细菌细胞数量的方法已在上述实验作了介绍。本实验用分光光度计(spectrophotometer)进行光电比浊测定不同培养时间细菌悬浮液的OD值，绘制生长曲线。也可以直接用试管或带有测定管的三角瓶(图15-5)测定“klett units”值的光度计。如图15—6所示，只要接种1支试管或1个带测定管的三角瓶，在不同的培养时间(横坐标)取样测定，以测得的klett units为纵坐标，便可很方便地绘制出细菌的生长曲线。如果需要，可根据公式1 klett units=OD/0.002换算出所测菌悬液的OD值。

图15—5 带侧臂试管的三角烧瓶

(三)器材

1．菌种 大肠杆菌

2．培养基 LB液体培养基70ml，分装2支大试管(5ml/支)，剩余60ml装入250ml的三角瓶。

3．仪器或其他用具 722型分光光度计，水浴振荡摇床，无菌试管，无菌吸管等。

图15—6 直接用试管测OD值

(四)操作步骤 1．标记

取11支无菌大试管，用记号笔分别标明培养时间，即0、1.5、3、4、6、8、10、12、14、16和20h。

2．接种

分别用5ml无菌吸管吸取2.5ml大肠杆菌过夜培养液(培养10~12h)转入盛有50ml LB液的三角瓶内，混合均匀后分别取5ml混合液放入上述标记的11支无菌大试管中。

3．培养

将已接种的试管置摇床37℃振荡培养(振荡频率250r/min)，分别培养0、1.5、3、4、6、8、10、12、14、16和20h，将标有相应时间的试管取出，立即放冰箱中贮存，最后一同比浊测定其光密度值。

4．比浊测定

用未接种的LB液体培养基作空白对照，选用600nm波长进行光电比浊测定。从早取出的培养液开始依次测定，对细胞密度大的培养液用LB液体培养基适当稀释后测定，使其光密度值在0.1~0.65之内(测定OD值前，将待测定的培养液振荡，使细胞均匀分布)。

本操作步骤也可用简便的方法代替：

1．用1ml无菌吸管取0.25ml大肠杆菌过夜培养液转入盛有3~5ml LB液的试管中、混匀后将试管直接插入分光光度计的比色糟中，比色糟上方用自制的暗盒将试管及比色暗室全部罩上，形成一个大的暗环境，另以1支盛有LB液但没有接种的试管调零点，测定样品中培养0h的OD值。测定完毕后，取出试管置37℃继续振荡培养。

2．分别在培养0、1.5、3、4、6、8、10、12、14、16和20h，取出培养物试管按上述方法测定OD值。该方法准确度高、操作简便。但须注意的是使用的2支试管要很干净，其透光程度愈接近，测定的准确度愈高。

(五)实验报告 1．结果

(1)将测定的OD600值填入下表： 培养时间(h) 对照 0 1.5 3 4 6 8 10 12 14 16 20 光密度值 OD600 (2)绘制大肠杆菌的生长曲线。

OD 600值

培养时间/h

2．思考题

(1)如果用活菌计数法制作生长曲线，你认为会有什么不同？两者各有什么优缺点？

(2)细菌生长繁殖所经历的四个时期中，哪个时期其代时最短？若细胞密度为103/ml，培养4.5h后，其密度高达23108/ml，计计算出其代时。

(3)次生代谢产物的大量积累在哪个时期？根据细菌生长繁殖的规律，采用哪些措施可使次生代谢产物积累更多？

实验16 微生物的生理生化反应

微生物生理生化反应的多样性在自然界产生了两种结果：第一是使自然界的有机分子都有可能得到分解；第二是使不同微生物之间有了互相作用和互相依赖的基础。例如，一种微生物能利用另一种微生物所分解的产物，或者一种微生物的产物可抑制或杀死另一种微生物。所以微生物的生理生化反应也被作为细菌鉴定和分类的内容。

一 大分子物质的水解试验 (一)目的要求

1．证明不同微生物对各种有机大分子的水解能力不同，从而说明不同微生物有着不同的酶系统。

2．掌握进行微生物大分子水解试验的原理和方法。 (二)基本原理

微生物对大分子的淀粉、蛋白质和脂肪不能直接利用，必须靠产生的胞外酶将大分子物质分解才能被微生物吸收利用。胞外酶主要为水解酶，通过加水裂解大的物质为较小的化合物，使其能被运输至细胞内。如淀粉酶水解淀粉为小分子的糊精、双糖和单糖；脂肪酶水解脂肪为甘油和脂肪酸；蛋白酶水解蛋白质为氨基酸等。这些过程均可通过观察细菌菌落周围的物质变化来证实：淀粉遇碘液会产生蓝色，但细菌水解淀粉的区域，用碘测定不再产生蓝色，表明细菌产生淀粉酶。脂肪水解后产生脂肪酸可改变培养基的pH，使pH降低，加入培养基的中性红指示剂会使培养基从淡红色变为深红色，说明胞外存在着脂肪酶。

微生物可以利用各种蛋白质和氨基酸作为氮源外，当缺乏糖类物质时，亦可用它们作为碳源和能源。明胶是由胶原蛋白经水解产生的蛋白质，在25℃以下可维持凝胶状态，以固体形式存在。而在25℃以上明胶就会液化。有些微生物可产生一种称作明胶酶的胞外酶，水解这种蛋白质，而使明胶液化，甚至在4℃仍能保持液化状态。

还有些微生物能水解牛奶中的蛋白质酪素，酪素的水解可用石蕊牛奶来检测。石蕊培养基由脱脂牛奶和石蕊组成，是昏浊的蓝色。酪素水解成氨基酸和肽后，培养基就会变得透明。石蕊牛奶也常被用来检测乳糖发酵，因为在酸存在下，石蕊会转变为粉红色，而过量的酸可引起牛奶的固化(凝乳形成)。氨基酸的分解会引起碱性反应，使石蕊变为紫色。此外，某些细菌能还原石蕊，使试管底部变为白色。

尿素是由大多数哺乳动物消化蛋白质后被分泌在尿中的废物。尿素酶能分解尿素释放出氨，这是一个分辨细菌很有用的诊断实验。尽管许多微生物都可以产生尿素酶，但它们利用尿素的速度比变形杆菌属(Proteus)的细菌要慢，因此尿素酶试验被用来从其他非发酵乳糖的肠道微生物中快速区分这个属的成员。尿素琼脂含有蛋白胨，葡萄糖，尿素和酚红。酚红在pH6.8时为黄色，而在培养过程中，产生尿素酶的细菌将分解尿素产生氨，使培养基的pH升高，在pH升至8.4时，指示剂就转变为深粉红色。

(三)器材

1．菌种 枯草芽胞杆菌，大肠杆菌，金黄色葡萄球菌，铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)，普通变形杆菌。

2．培养基 固体油脂培养基，固体淀粉培养基，明胶培养基试管，石蕊牛奶试管，尿素琼脂试管。

3．溶液或试剂 革兰氏染色用卢戈氏碘液(Lugol’s iodine solution)。

4．仪器或其他用具 无菌平板，无菌试管，接种环，接种针，试管架。 (四)操作步骤 l．淀粉水解试验

(1)将固体淀粉培养基溶化后冷却至50℃左右，无菌操作制成平板。

实验17 微生物与氧关系的检测

一、实验目的和内容

目的：学会检测微生物与氧关系的方法，了解微生物与氧的关系。 内容：通过调整转速和瓶装量检测微生物生长与氧气的关系。 二、实验材料和用具

大肠杆菌斜面菌种、牛肉膏蛋白胨培养基。

吸量管、三角瓶、恒温振荡器、721分光光度计、比色杯等。 三、操作步骤

(一)LB培养基的制备

1．配制牛肉膏蛋白胨培养基。

2．分装 取4个300mL三角瓶，每瓶装入50 mL培养基，编号为1、2、3、4；另取4个500mL三角瓶，每瓶分别装入50mL、l00mL、150mL和200mL培养基，编号为5、6、7、8。再取一个100mL三角瓶，装入20mL培养基，剩余的培养基装入到两个500mL三角瓶中，所有三角瓶均用8层纱布和线绳包扎。

3．灭菌 将上述分装的培养基于121C湿热灭菌30min，冷却后备用。 (二)供试菌种的制备

l．菌种活化 将冰箱中储藏的大肠杆菌斜面菌种转接至牛肉膏蛋白胨斜面培养基上，37℃培养18~20h备用。

2．种子制备 取上述活化的大肠杆菌一环接人盛有20mL牛肉膏蛋白胨培养基的100mL三角瓶中，37℃，200r/min摇床培养16～18h作为供试种子。

(三)不同转速对大肠杆菌生长的影响 取1~4号三角瓶，每瓶接入lmL上述大肠杆菌种子，1号静置于温箱中，2号置75r/min摇床，3号置于150r/min摇床，4号置于225r/min摇床，在37℃下培养12~16h后取出，摇匀，经适当稀释后，测定每个瓶中的OD值(λ=600nm)，并同时以原培养基不接种作对照测定。记录结果于表17-1中。

(四)不同瓶装量对大肠杆菌生长的影响 取上述5~8号三角瓶，按1%的接种量接人上述大肠杆菌种子，37C,200r/min培养12~16h后一并取出，用721分光光度计测定OD值(λ=600m)，如密度太大可作适当稀释后再测OD值，记录实验结果于表17-2中。

四、注意事项

1．接种前要将种子充分摇匀，接种时要保证接种量一致。严格无菌操作，以免污染。 2．测定OD值时要摇匀后再取培养液。若经稀释后测定，则各瓶培养物的稀释倍数要一致。

五、实验报告

1．将测定结果列于表17-1和表17-2中：

表17-1 不同转数对大肠杆菌生长量的影响 转数/r2min-1 OD值(λ=600nm) 1 0 75 150 225 2 平均值 表17-2 不同瓶装量对大肠杆菌生长量的影响 瓶装量(mL/500mL三角瓶) OD值(λ=600nm) 1 50 2 平均值 75 100 150 2．绘制曲线分别以转速或瓶装量为横坐标，以OD值为纵坐标绘制大肠杆菌生长与氧关系的曲线。

3．试对以上曲线进行分析。 六、问题和思考

1．根据微生物与氧的关系，可将微生物分为哪几大类？ 2．专性厌氧微生物为什么在有氧的条件下不能生长？

3．试设计一实验，如何测定酵母菌或放红菌及霉菌与氧的关系。

实验18 厌氧微生物的培养

一、实验目的和内容

目的：学习培养厌氧微生物的方法，了解厌氧微生物生长的特性。 内容：1、深层穿刺法，厌氧培养丙酮丁醇梭菌。

2、真空干燥器厌氧培养丙酮丁醇梭菌及产气荚膜梭菌。 3、针筒厌氧法培养丙酮丁醇梭菌及产气荚膜梭菌。 4、厌氧罐培养法示范。

5、厌氧袋法培养丙酮丁醇梭菌。 二、实验材料和用具

丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)。 RCM培养基（即强化梭菌培养基）、TYA培养基、玉米醪培养基、中性红培养基、明胶麦芽汁培养基。CaCO3，焦性没食子酸(即邻苯三酚)、Na2CO3，10%NaOH溶液，0.5%美蓝水溶液，6%葡萄糖水溶液，钯粒(A型)，NaBH4，KBH4，NaHCO3，柠檬酸。

带塞或塑料帽玻璃管(直径18~20mm，长180~200mm)，1mL血浆瓶，250mL血浆瓶，2OmL和50mL针简，250mL三角瓶，试管，厌氧罐，厌氧袋(不透气的无毒复合透明薄膜塑料袋，14cm332cm)，培养皿，真空泵，带活塞干燥器，氮气钢瓶。

三、操作步骤

(一)真空干燥器厌氧培养法

此法不适用于培养需要CO2的微生物。该法是在干燥器内使焦性没食子酸与氢氧化钠溶液发生反应而吸氧，形成无氧的小环境而使厌氧菌生长。

1．培养基准备与接种 将3支装有玉米醪培养基或RCM培养基的大试管放在水浴中煮沸l0min，以赶出其中溶解的氧气，迅速冷却后(切勿摇动)将其中2支试管分别接种丙酮丁醇梭菌和产气荚膜梭菌。

2．干燥器准备与抽气 在带活塞的干燥器内底部，预先放入焦性没食子酸粉末20g和斜放盛有200mL10% NaOH溶液的烧杯。将接种有厌氧菌的培养管放入干燥器内。在干燥器口上涂抹凡士林，密封后接通真空泵，抽气3~5min，关闭活塞。轻轻摇动干燥器，促使烧杯中的NaOH溶液倒入焦性没食子酸中，两种物质混合发生吸氧反应，使干燥器中形成无氧小环境(图18-lA)

3．观察结果 将干燥器置于37℃恒温箱中培养约7d，取出培养管，分别制片观察菌体特征。

图18-1厌氧培养示意图

A干燥器厌氧培养装置

1、连接真空泵；2、干燥器；3、试管；4、10%NaOH溶液；5、焦性没食子酸粉末

B深层穿刺分离培养法

1、塑料盖；2、营养琼脂；3、无菌橡皮塞；4、接种针穿刺至底部；5、培养后长出菌落

(二)深层穿刺厌氧培养法

此法操作简单，适用于一般厌氧微生物的活化和分离培养，但不能用于扩大培养。 1．接种培养 将玻璃管一头塞上橡胶塞，装入培养基(RCM或TYA培养基)的高度为管长的2/3，套上塑料帽或橡皮塞，灭菌并凝固后，将丙酮丁醇梭菌用接种针穿刺接种(图18—lB)，置37℃恒温箱中培养6～7d。

2．观察结果 观察菌落形态特征并制片于显微镜下观察菌体的细胞形态，并记录结果。 (三)针筒厌氧培养法

此法适于活化厌氧菌和小体积的扩大培养。 1．培养基准备 将灭菌的装有RCM或TYA培养基的血浆瓶放在沸水浴中加热10min，在瓶口胶塞上插上2枚医用针头排气，以赶出残留在培养基内的氧气。随后将血浆瓶从沸水浴中取出，再用氮气钢瓶中的高纯氮气(99.99%)通过胶塞上的一枚针头引人血浆瓶中，使血浆瓶内充满氮气，瓶内培养基在冷却过程中保持无氧状态。

2．针筒装灌培养基 将灭菌的针筒接上针头经胶塞刺人血浆瓶中，先利用瓶内氮气的压力将针筒的推杆慢慢推开，待吸入一定体积的氮气后取下针筒，排尽针筒内的气体。按此重复操作3次，以排尽针筒内的残留空气而维持无氧状态。使血浆瓶口朝下倾斜，利用瓶内压力将培养液缓慢注入针筒内，然后取下针筒，用经灭菌的带孔橡皮塞迅速把针筒头部塞住(图18-2)。

图18—2 针筒培养基分装装置

图18—3 针筒间对接法接种

3．接种培养采用无菌操作以菌种液针筒将菌穿刺接入培养液针筒中(图18-3)，置37℃恒温培养，用于菌种活化可培养16~18h，用于测定菌体生长可培养6~7d。

4．观察结果取菌制片观察。 (四)厌氧罐培养法

此法利用透明的聚碳酸酯硬质塑料制成的一种小型罐状密封容器，采用抽气换气法充入

氢气，利用钯作催化剂与罐内氧气发生作用达到除氧的目的，同时充入10%(V/V)的CO2以促进某些革兰氏阴性厌氧菌的生长(图18-4)。

图18—4 厌氧罐厌氧培养装置

其实验操作过程如下：

1．制备厌氧度指示剂 取3mL0.5%美蓝水溶液用蒸馏水稀释至100mL；6mL0.1mol/LNaOH溶液用蒸馏水稀释至l00mL；6g葡萄糖加蒸馏水至l00mL。将上述3种溶液等体积混合，并用针筒注入安瓿管内lmL，沸水浴加热至无色，立即封口即成。取一根直径1cm、长8cm的无毒透明塑料软管，将装有美蓝指示剂的安瓿管置于软管中，制成美蓝厌氧度指示管。

2．培养基准备与接种 将制成无菌无氧的RCM或TYA培养基平板，在无菌操作下迅速划线接种丙酮丁醇梭菌或产气荚膜梭菌，并立即将平皿倒置放入已准备好的厌氧罐中，同时放入一支美蓝厌氧指示剂管。随后及时旋紧罐盖，达到完全密封。

3．抽气换气 将真空泵接通厌氧罐抽气接口(图18-4)，抽真空至表指针0.09~0.093MPa(680~700mmHg柱)时，关闭抽气口活塞，用止血钳夹住抽气橡皮管。打开氮气钢瓶气阀向厌氧罐内充入氮气，当真空表指针返回到零位终止充氮。再接上述步骤抽气和充入氮气，如此重复2~3次，使罐中氧的含量达最低度。最后充入的氮气使真空表指针达0.02MPa(l60mmHg)时停止充氮气。再开启CO2钢瓶阀门，向罐内充入CO2直至真空表指针达到0.011MPa(80mmHg)时停止。为除尽罐内残留的氧，以氢气袋(用医用“氧气袋”灌满氢气)气管连接向厌氧罐内充入氢气直至真空表指针回到零位为止。充气完毕，封闭厌氧罐。

4．恒温培养 将厌氧罐置于37℃恒温箱中培养6~7d，注意罐中厌氧指示剂的颜色变化。

5．观察结果和镜检 从罐内取出平皿，观察菌落特征。并挑取菌落作涂片，用结晶紫染液染色，镜检，比较不同菌的菌体细胞形态特征，并作记录。

(五)厌氧袋培养法

厌氧袋除氧是利用氢硼化钠与水反应产生氢，在催化剂钯的作用下，氢与袋中氧结合生成水达到除氧目的，除氧效果可从袋中厌氧度指示剂观察。同时，利用柠檬酸与碳酸氢钠的作用产生CO2，以有利于需要CO2的厌氧菌的生长。

其反应过程为：

1．厌氧袋 选用无毒复合透明薄膜塑料，采用塑膜封口机或电热法烫制成20340cm塑料袋。

2．产气管 取一根无毒塑料软管(直径2.0cm，长20cm)，管壁制成小孔，一端封实。天平称取0.4g NaBH4和0.4g NaHCO3，用擦镜纸包成小包，塞入软管底部，其上基入3层擦镜纸，将装有5%柠檬酸溶液3mL的安瓿管塞入塑料管中，管口塞上有缺口的泡沫塑料小塞，即制成产气管。

3．厌氧度指示管 取一根无毒透明塑料软管(直径2cm，长10cm)。量取0.5%美蓝水溶液3mL，用蒸馏水稀释至100mL；取0.lmol/LNaOH溶液6mL，用蒸馏水稀释至100mL；称取6g葡萄糖加蒸馏水稀释成100mL。将上述3种溶液等量混合后取2mL装入安瓿管，经沸水浴加热至无色后立即封口，即为厌氧度指示管。

4．催化剂和吸湿剂 催化剂钯粒(A型)10~20粒加热活化，随后装入带孔的小塑料硬管内，制成钯粒催化管。取变色硅胶少许，用滤纸包好塞入带孔塑料管内，为吸湿剂管。

5．培养基准备和接种 将灭菌的中性红培养基和CaCO3明胶培养基分别在沸水浴中煮沸10min，以赶出其中溶解的氧，冷却至50C左右倒平板，冷凝后接种丙酮丁醇梭菌。随后立即将平皿放入厌氧袋中，每袋可倒置平放3个平皿。

6．封袋除氧和培养 将产气管、厌氧度指示管、钯粒催化剂管和吸湿剂管分别放入袋中平皿两边，尽量赶出袋中空气，用宽透明胶带将袋口封住，用一根lcm宽、与袋口宽等长的有机玻璃条或小木条将袋口卷折2~3层，用夹子夹紧，严防漏气(图18-5)。使袋口倾斜向上，随后隔袋折断产气管中的安瓿管颈，使试剂反应产生H2和CO2，H2在钯粒催化下与袋内O2化合生成水。经5~l0min左右，钯粒催化管处升温发热，生成少量水蒸汽。在折断产气管半小时后，隔袋折断厌氧度指示管中的安瓶管颈，观察指示剂不变蓝，表明袋内己形成厌氧环境。此时将厌氧袋转入37℃恒温箱中培养6~7d。

7．观察结果和镜检 从袋中取出平皿观察菌落特征。丙酮丁醇梭菌在中性红平板上显示黄色菌落，挑取典型单菌落涂片染色后进行镜检，观察菌体细胞形态特征，并作记录。

图18—5 厌氧袋厌氧培养装置

四、注意事项

1．培养需要CO2的厌氧菌时，须在厌氧小环境中供应CO2。

2．氢气是危险易爆气体，使用氢气钢瓶充氢时，应严格按操作规程进行，切勿大意，严防事故。

3．选用干燥器、针筒、厌氧罐或厌氧袋时，应事先仔细检查其密封性能，以防漏气。 4．已制备灭菌的培养基在接种前应在沸水浴中煮沸10min，以消除溶解在培养基中的氧气。

5．针筒培养液刃天青指示剂出现红色，表明有残留氧气。厌氧袋和厌氧罐中美蓝厌气度指示剂变成蓝色，表明除氧不够。

6．产气荚膜梭菌为条件致病菌，防止进入口中和沾上伤口。 五、演示

1．显示深层穿刺厌氧培养的厌氧菌菌落特征及生长情况。

2．选用真空干燥器、针筒、厌氧罐或厌氧袋厌氧培养法，演示该方法的操作过程，特别是厌氧罐的抽气换气和厌氧袋的封袋除氧操作过程。

六、实验报告

1．实验中选用厌氧培养法的培养结果： 培养 方法 菌种 名称 菌落形态特征 菌体形态特征 菌落大小、形状、颜色、菌体形态有无芽孢、芽光滑度、透明度、气味 孢形状、碘液染色 液体培 养特征 备注 2．试比较以上厌氧培养方法的优缺点，并分析其成功的关键。 七、问题和思考

1．请设计一个试验方案，如何从土壤中分离、纯化和培养出厌氧菌。 2．试举例说明研究厌氧菌的实际意义。

实验19 免疫血清的制备

一、实验目的和内容

目的：学习和掌握免疫血清的制备方法，为凝集反应和沉淀反应准备凝集素和沉淀素。 内容：1、抗大肠杆菌血清(凝集素)的制备。 2、牛血清白蛋白抗血清(沉淀素)的制备。 二、实验材料和用具

体重2~3kg的健康雄家兔、大肠杆菌(E. coli)斜面菌种；

牛血清白蛋白(蛋白含量1.5mg/mL)、牛肉膏蛋白胨斜面培养基、0.3%甲醛液(用0.85%生理盐水配制)、75%酒精棉球、碘酒棉球、消毒干棉球；

细菌比浊标准管、无菌吸管、无菌注射器(5mL、20mL)、注射针头(5号，B19)、无菌试管、装有玻璃珠的无菌血清瓶、解剖用具(解剖台、兔头夹、止血钳、解剖刀、眼科剪刀、镊子、动脉夹等)、双面刀片、丝线、玻璃管、胶管、离心机及无菌离心管、普通冰箱、超净工作台、水浴箱。

三、操作步骤 (一)凝集素的制备

1．凝集原(颗粒性抗原)的制备

(1)取37C恒温培养24h的牛肉膏蛋白胨大肠杆菌斜面。

(2)每支斜面菌种中加入5mL0.3%甲醛液，小心地把菌苔洗下制成菌液。

(3)用无菌清洁吸管，吸取以上菌液，注入装有玻璃珠的无菌血清瓶内，振荡10~25min，分散菌块制成菌悬液。

(4)将含菌悬液的血清瓶置于60℃的水浴箱中水浴1h，并不时摇动，把菌杀死。

(5)将菌悬液重新接种至牛肉膏蛋白胨斜面培养基中，37℃培养24～48h，如有菌生长，则要在60℃水温中再处理。若无菌生长则进行比浊测定其含菌量。

(6)凝集素的制备

(1)免疫方法：选择2～3kg健康雄免，从耳缘静脉采血2mL，分离出血清。该血清与准备免疫用的抗原进行凝集反应，以检查有无天然凝集素。如没有或只有极微量时，该动物便可用来免疫。

最常用的免疫途径是耳缘静脉注射。将家兔放在家兔固定箱内，一手轻轻拿起耳朵，用碘酒棉花球在耳外侧边缘静脉处消毒，然后用酒精棉球涂擦，并用手指轻轻弹几下静脉血管，使其扩张。消毒细菌悬液瓶塞后，用无菌注射器及5号针头吸取菌液，沿着静脉平行方向刺入静脉血管，并慢慢注入菌液，注射完毕，用干棉球按压住注射处，然后拨出针头，并压迫血管注射处片刻，以防止血液向外溢出。注射时发现注射处隆起，不易推进时，表明针尖不在血管中，应拨出针头，重找位置再注射。有时针尖口被堵塞，菌液推不进去，应及时更换针头。注射途径、剂量和日程安排等视抗原和动物不同而有所不同。大肠杆菌免疫家兔的抗原注射剂量和日程安排如下表： 日期 注射剂量/mL 第1日 0.2 第2日 0.4 第3日 0.6 第4日 1.0 第5日 2.0 (2)试血：通常于最后一次注射后7~11d，从兔耳缘静脉抽取2mL血，分离析出血清，用试管凝集反应测定抗血清效价。效价合格即可大量采血，如效价不高，可继续注射抗原免疫，提高效价。

(3)采血：采血分为心脏采血和颈动脉放血。

心脏采血：使免疫家兔仰卧于台上，四肢固定。用左手探明心脏博动最明显处，用碘酒棉球与酒精棉球消毒后，右手握消毒过的20mL注射器和B19号针头，在上述部位的肋骨间隙与胸部呈45°角刺入心脏，微微抽取针筒，此时可发现血液涌入注射器中便可徐徐抽取血液。2.5kg家兔一次可取血20~30mL。取血完毕后，用消毒棉球按压进针处迅速拨出针头，进针处用棉球继续压住。并马上将所采的血液注入无菌大试管内，斜放，待血液凝固后，置于37℃恒温箱中30min，使血清充分析出，然后放入4~6C冰箱中。

颈动脉采血：将免疫家兔固定于兔台上，用少量乙醚麻醉，剪去颈部的毛，然后用碘酒

棉球和酒精棉球消毒。沿正中线将颈部皮肤切开到锁骨间，拨开肌膜，暴露出气管，在气管深侧处找到搏动的颈动脉。小心地将颈动脉和迷走神经剥离分开4~5cm。用镊子拉出颈动脉，用丝线扎紧血管的离心端，在血管的向心端用止血钳夹住。然后用眼科剪在丝线与止血钳之间的血管上剪一个V型小切口，将弯咀眼科镊自切口插入，使其张开，同时将一小玻管插入，用丝线扎紧，以防玻管脱漏。玻管另一端接入一条胶管，胶管通入大试管(或大离心管)内，然后将止血钳慢慢松开，使血液流入试管，直至动物死亡，无血液流出为止。

(4)抗血清分离与保存：取凝固血液于4000r/min，离心20min，获得抗血清(即凝集素)。加入石炭酸或硫柳汞使其浓度分别达到0.5%或0.01%。测定抗血清的效价后，封好瓶口，贴好标签，注明抗血清名称、效价及日期，置冰箱保存备用。

(二)沉淀素的制备

抗原为可溶性抗原(如脂多糖、类毒素或可溶性蛋白等)。通常每kg兔体重注射2mg蛋白，牛血清白蛋白抗原浓度为1.5mg/mL，则2.5kg兔应注射5mg蛋白。免疫方法、采血方法和抗血清(沉淀素)的分离可参照凝集素制备方法，但效价测定则用沉淀反应来测定。

四、注意事项

由于每个动物对免疫反应不同，产生的抗体效份有高有低，所以在制备抗血清时至少免疫两只家兔。如须保留该免疫动物，刚采取心脏直接取血，取血后应从静脉注射等体积的50%葡萄糖溶液，经过2~3个月的饲养，方可再次免疫。若不保留动物须一次取大量血时，则采用颈动脉放血法。

五、演示

1．耳缘静脉注射抗原的方法。 2．心脏取血的操作过程。 六、实验报告

1．记录免疫家兔的操作过程及免疫过程中兔的反应。 2．实验操作过程的体会。 七、问题和思考

1．如果不用生理盐水来配制抗原，以这样的抗原免疫兔成不成？为什么？

2．现有一支苏云金杆菌(Bacillus thuringinesis)斜面菌种，你能否制备出相应的凝集素？阐述其主要步骤。

实验20 凝集反应

一、实验目的和内容

目的：学习和掌握用试管凝集反应测定抗血清效价的方法。 内容：1、玻片凝集试验。 2、试管凝集试验。 二、实验材料和用具

含10亿个/mL大肠杆菌(E. coli)的生理盐水菌悬液、大肠杆菌抗血清、生理盐水。载玻片、小试管(1cm36.5cm)、试管架、移液管、吸管、水浴箱。

三、操作步骤 (一)玻片凝集试验

1．在载玻片两端各滴一滴大肠杆菌悬液。

2．在一端的菌悬液中加入一滴1：10稀释的大肠杆菌抗血清，另一端悬液加入一滴生理盐水。

3．将载玻片小心地振动使混合液混匀后静置室温中，数分钟后便可观察到抗血清端产生凝集块，而另一端为生理盐水对照。若反应不明显，可放入培养皿中(皿内放入湿滤纸，以保持一定湿度)，37℃保温30min后观察结果。亦可将载玻片放置显微镜下，凝集块明显可见。

(二)试管凝集试验 1．抗血清的稀释 抗血清稀释采取对倍稀释法。取干净小试管10支，排列在试管架上，依次注明号码，每支试管用移液管加入0.5mL生理盐水。

用移液管吸取1：10稀释的大肠杆菌抗血清0.5mL加入第1管，在管内连续吹吸3次，使血清与生理盐水充分混合，然后吸取0.5mL加入第2管，同样混匀后吸取0.5mL加入第3管，依次类推，直至第9管，混匀后从第9管中吸取0.5mL弃去。第10管不加血清作为对照。此时从第1管到第9管的血清稀释倍数分别1：20，1：40，1：80，1：160，1：320，1：640，1：1280，1：2560，1：5120。

2．加入抗原 从第10支管开始，由后向前每支管依次加入0.5mL大肠杆菌菌悬液。此时血清稀释倍数相应加大一倍。

3. 抗原抗体反应 把各管混合液振摇混匀，置37℃水浴箱中水浴4h或在室温中过夜，观察结果。

4．结果观察与效价判断

(1)生理盐水对照管中的抗原(细菌)应分散，无凝集块沉淀而呈混浊菌悬液。

(2)试验管如有凝集，管底可见到凝集块。液体上部澄清、半澄清或混浊度降低，管底凝集块轻摇即浮起，呈片块状。

(3)凝集强弱的判断(以“+”表示) “++++”：很强，表示细菌完全凝集，凝集块完全沉于管底，菌液澄清。 “+++”：很强，表示细菌绝大部分凝集，凝集块小沉于管底，菌液有轻微混浊。 “++”：中等强度，表示细菌部分凝集沉于管底，凝集块呈颗粒状，菌液半澄清。 “+”：弱，表示细菌少数凝集，菌液混浊。 “-”：不凝集，菌液混浊与生理盐水对照管同。

血清的效价就是呈现50%凝集(即“++”反应)的最高血清稀释倍数。 四、注意事项

1．所用载玻片、试管、移液管等用具均应干净。

2．在血清对倍稀释过程中，力求准确。一是防止液体溢出管外，二是在连续吸3次混匀液体时，第2次吸人移液管中的液体高度不能低于第1次，最好是每一稀释度换一支洗净的移液管。

3．试管水浴或静置后，观察前不宜摇动振荡，以免影响实验结果的准确性。 五、演示

1．对倍稀释过程。

2．玻片凝集的显微示范镜，观察凝集块。 六、实验报告

(一)记录玻片凝集试验结果，试比较血清端与生理盐水端结果的不同，并解释其原因。 (二)抗血清的效价测定结果。 1．抗血清效价测定结果： 试管 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 最后血清 稀释倍数 凝集强弱 2．确定抗血清的效价为 。 七、问题和思考

1．为什么取“++”的抗血清最高稀释倍数作为抗血清的效价？ 2．在试管凝集试验中，有否出现不正常现象？并分析其原因。

3．现有枯草孢杆菌斜面菌种及未知效价的相应抗血清，你能否测定出其血清效价？描述其操作过程。

实验21 沉淀反应

一、实验目的和内容

目的：学习和掌握环状沉淀反应及双向琼脂扩散沉淀反应方法。

内容：1. 用牛血清白蛋白及兔抗牛血清白蛋白，进行环状沉淀反应。 2. 用以上抗原和抗体进行双向琼脂扩散沉淀反应试验。 二、实验材料和用具

可溶性抗原(牛血清白蛋白)、兔抗牛血清白蛋白抗血清、生理盐水(0.85%NaCl)。 洗净载玻片、小试管、移液管、玻璃毛细吸管、不锈钢吸管。 三、操作步骤 (一)环状沉淀反应

1. 取1：25的牛血清白蛋白lmL，用生理盐水以对倍稀释法稀释成1：50，1：100，1：200，1：400，1：800，1：1600，1：3200的抗原溶液。

2．取9支洁净干燥的小试管，每支小试管如入1：2的兔抗牛血清白蛋白抗血清0.5mL。 3，用移液管吸取上面已稀释好的牛血清白蛋白(抗原)，按表21—1要求，从最大稀释度开始，沿着管壁徐徐加入各小试管中，使与下层抗体之间形成交界面，切勿摇动混匀，第8管加入生理盐水及第9管加入兔抗血清以作对照。

4．静置15~30min，观察在两液面交界处有无白色环状沉淀物出现。 5．结果记录 凡有白色环状沉淀物者记“+”，没有沉淀者记“-”。最大稀释度的抗原与抗体交界面之间还出现白色环状沉淀者，此管的抗原稀释倍数即为抗体(沉淀素)的效价。

表21-1环状沉淀反应记录表 试管 抗(1:2)/mL 抗原稀释度 抗原用量/mL 体1 0.5 0.5 2 0.5 0.5 3 0.5 0.5 4 0.5 0.5 5 0.5 0.5 6 0.5 0.5 7 0.5 0.5 8 0.5 水 0.5 9 0.5 免血清(1:50) 0.5 1:50 1:100 1:200 1:400 1:800 1:1600 1:3200 盐 (二)双向琼脂扩散沉淀反应 1．称取1g优质琼脂于l00mL pH7.2生理盐水中，在沸水中水浴使琼脂溶化后，加入1%的硫柳汞lmL防腐。每块载玻片(7.5cm34.5cm)滴加4mL琼脂溶液，待凝固后用不锈钢吸管在两端(A、B端)打梅花形小孔，孔径和孔距均为3mm。亦可直接用不锈钢管打孔，再用接种针挑去梅花形孔中的琼脂块。

2．在A端梅花形孔中，用玻璃毛细吸管在中心孔中加入适当稀释的抗血清(抗体)，注意要使孔加满，但不外溢；周围孔加入不同稀释度的抗原(例如1:10，1:20，1:40，1:80，1:160，1:320)。

在B端梅花形孔中，同样在中央孔中加入适当稀释度的抗原，周围的孔中加入不同稀释度的抗体。

3．把以上载玻片放入带盖的铝盒中，下面垫上3一4层湿纱布，置37℃扩散24～48h，可看见抗原和抗体反应处呈现的沉淀线。

4．记录结果 注意沉淀线数目及偏向。 四、注意事项

1．在进行环状沉淀反应试验时，一定要沿着管壁加入抗原，而且切勿摇动，否则影响沉淀环的形成。

2．双向琼脂扩散试验时，抗原或抗体的稀释度多少才合适，教师必须进行预测，否则由于抗原、抗体比例不合适而造成假阴性。

五、演示

结果

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