细菌分子鉴定及转化.pdf

细菌分子鉴定及转化.pdf

第二章

材料与方法

.取样 21

从海南购得军曹鱼卵， 将卵在海边的咸水池中孵化，并取卵样和水样。将卵培养成鱼苗，取鱼苗样和水样三个。再将鱼苗移到大鹏湾南澳养殖区进行网箱养殖，取鱼肠样和水样 1个。具体内容如下： 3

时间： 0 年4从海南陵水 24月购进Z军 g k曹鱼卵。地点： 深圳市龙岗区大鹏镇水头海水鱼苗泥池底池塘，面积40厅 ( 0, 8宽6长 m8m) 0,水深最深4米左右。方法：

养殖：池塘提前 1天清池、消毒、换水，然后施肥培养浮游生物；卵先放置在池 0塘中架起的小网箱中 (m月o,上有遮光网，打气冲氧，表层水温 2℃一2℃,经 l m) 4

过 2一 0仆 3小时，孵化率超过 9%;天鱼苗开口吃饵， 0 7投喂少量鱼肉和幼牡蜗肉浆，4天后移入南澳鱼排养殖网箱中，网箱规格 333,以冰鲜鱼糜为饵料投喂。 5 xxm采样：整个实验共计采样 1次，实验周期 1个月，其中卵样一次，鱼苗样四次， 7 2稚鱼 2次，养成期 1次，每次相应水体环境也采样做对比，滤膜放入无菌 5m的离 0 0l

心管中加入t su rs y bf o而，一℃ i s e 0 7冰箱中保存。鱼卵在灭菌水中清洗3放入5耐离心管中，鱼苗样前 4 次， 0次用整条鱼在灭菌水中冲洗 3次后做样品，第五、六次用全肠样品，后 1次剖出前后肠分别做成样品。所 0有样品保存在一8℃超低温冰箱中备用。 0

取样情况见表 1:

细菌分子鉴定及转化.pdf

表1 军曹鱼细菌的一年取样情况肠b l s P s f ors at u io ya l e m e a l oC b, ce m n n e ab r i e r

样品测定，臂期}班一拍水群

几L 扇一箭产璨注

、烈却)‘渡骊途2加a犷访康勘

一咖海亘蒸礴

犁嗽搏资六

后漏繁,愁.分 _入朴声 _ _

‘公汽、味豁子爪介欲节

李如芬归盆 2魏伽犷一月铸妇七 3} )

知4叼、妙触薇厂餐妙橇冲琴。、二魏旅钟鸭颠脚2 0一打加一 5恤屁全 0 4余二察盯、

不一赢一刃两事一 1轰币全嘛肠、始时石衬如

彰渺鲜卿钾瞬毯盗

成硫揭遥妞叫必玫成耘瘫谕澎协娜y一声面.全 0一此一。癸伽贬 7 0 4 3 w ae ) r;2 0￣ 0一印- 9铸一 04 6呼《百份幻〔

下不蕊而一奚后肠王(i绍。1其1而，、 n,· ) h,拄后肠 2工idu一义2人1ng止工！

)卜 1 1后肠3 (id u l(3 Ahng t !)一 ) 1后肠礴 (i北u l《 )人 1n t)1、一阅刃1后肠S (丈d U l (百- A n g t)1) h

佣 - 1垃一比 -扭

2一续夕1夺压艰可王加嵘仁的劝后如(旗叭丫，朋通二=1功w一萝川一夕 .卿一 -扁 1以 t心 9、后文、。的

黝蒸蒸撰2 0一切一1 04 7 6, (湘已 g‘宙 t r〕

后肠b〔 n o1〔 Ah d 1 1 i g )里歼

n任oeu丁 (f)后肠7 (idu l ( rg t汾 F3 A hn g t) 1]刀

川锁； )越加冬书}一 1碗珍 1p苏此法2癸刃乐氛

川孙卜如箱菠穿恤踌交巍晶一 (笼)拼速娜‘垂}孤资 E7巍一格代表一个样品)

吻箔稗斡堆共嘟未襄爽砂(

(注：以军曹鱼胃下方的转折点为界，前肠指该点以前的消化道，后肠则反之，表中每

. 2肠道细菌D A和水体细菌D A的提取 2 N N

.军曹鱼肠道细菌样品总D A抽提流程 21 . 2 N

细菌分子鉴定及转化.pdf

参见《 分子克隆实验指南》(第二版)的S S D裂解法，并作改良.具体过程如下： A 、将肠道剪碎于 1m管中成匀浆加入 50 0林 0%认 e8( S, 50 .l s 0一801 . T吧n0 B ) 0一 1 P

0印 80 m离心 1分钟收集取上清， 0如此离心2次；

B ( 0 rl 0 n 1分钟离、 10 ) 2o p心收集清。上C倒弃上清， 、加入 30 4林 s s提取液[on比‘一c十 5) 5 6一50L D lu o o 5 l .; 0 P ( 0 m o D; 5n比 N c〕重悬， m l认 2o几E o u al再加入4一6卜 l的s s 0 0Lo% D水溶液；D 5 ℃水浴 1分钟；一8℃冰溶 5、6 0 0分钟，6℃水溶 1分钟 ( 5 0反复三次)。

E加入等体积酚的抽提， 、混匀静置3 5一分钟， 1 0r 6再 2 p分钟离心取上清液。 5 m

F加入积的 等体氯仿：戊醇 4 )、异 (:1 2抽提， 20 p 6钟离心上再1 rn分 5 l取清液。 G再加入等积氯仿 、体抽提，以1 o m分钟 2n 6离心取液 ( 5印上清此步可。省)H加入2体积异丙醇或2倍 1%冰乙醇一2℃静置过夜( 3、/ - 5 0 0两个小时以上也可)。

12 0 s m分钟离心并倒弃上清液，、1印 0 5然后用7% 0的乙醇洗二遍 ( 15卿 m每次 2 0离心 1分钟倒弃

上清液) 0,干燥。 J 、最后向管中加入 10 0 x于 4 0川 .化 l℃保存备用。

.水样细菌总 D A的提取 2 2 . 2 N

A 、将吸附有水样细菌的滤纸放入灭了菌的管中；. B加入 1料^裂解液 (5 M Ts C加 s, m E T, 2 VP, 00。N、 0 1 m r . IH o s M D i H]^ 0%P

1% D )旋涡混合器上混合3秒； . SS 5, 0C 5 2分钟，其间每 5、6℃水溶 0分钟混合一次：

D 2 0 巧分、1 9 0钟取上清，等体酚氯仿 (:1抽提加入积的/ l )一次，取上清液； E再 积的/仿：1、加入等体酚氯 ( ) 1抽提一取上次，清液；F .倍 10、加入2 0%乙醇一2℃静置过夜 (个小时以 5 0 2上也可);

G 4095钟弃上 1分、1 0 0清液，以301%醇清 0林 0乙洗沉淀 7一次； H 4 0 0钟弃上 1分、1 9 0清液，沉淀于3℃燥： 8干

1然后溶于5 T 0川缓冲液中一℃存。、 E 0 2保

细菌分子鉴定及转化.pdf

.细菌总D A琼脂糖电 23 N . 2泳检侧

取住琼糖加 0 I A冲，波中沸li直加琼 ,入5 L倍T缓液微炉煮 m,到了脂 9 5脂 m E n糖的lTE冲液透明 xA缓变得澄清；却至5℃右，入2川 lg L冷 0左加。 m m浪化乙 E )/锭(B倒入用制胶板封闭的胶槽中，完全凝固后静置3m; 0 i置于电泳槽 (面V, Oa n M E B Rd) i中，加入约 80 LIT E缓冲液，去梳子后每孔加入 51 u D A样品与Z L 0 m、A一 LN 0 p上样

缓冲液的混合样， a e用5L k公司的D 20上样； 0 v 81泳3而n M rr林[a k ar L0以1, n o 0 A电 0,完毕后，紫外照相 ( l r o a Fa e ie r V b Lu t rn )并分析。 m a, c卜T〔 0 4 比 Ts A: 0m r一 . o i乙酸； 0 m比 E T,储存于室温。 .l 0 0o D A上样缓冲液： 2 0%澳酚兰； 2% . 5。 5二甲苯青F;% (沙 ) F4 0 vv蔗糖水溶液，储存于4 ℃。

或者：

取让 9 5琼脂糖，加入51 5 0l l倍拍E L住缓冲液，微波炉中煮沸 l i直到加了 mn,琼脂搪的0 x .扭E缓冲液变得透明 5澄清；冷却至5

℃ 0左右，加入 2贝 G l c . 5 o d w核酸 i v染料倒入用制胶板封闭的胶槽中，完全凝固后静置 3m;置于电泳槽 ( n E D i n i V Mi,

i a中， B Rd)加入约8 m 1 5化E液，梳子 o 0 L 0 . x缓冲去后每孔加入5。 D A样品一1 N川与2L样液的”上缓冲混合样， a e用5U k公司 L0上样； ovs A M rr林几a k a r的D 20以l, m o电泳 3 i,完毕后，紫外照相 ( b Lu m,F田 )并分析。 m 0n劝l or a n c r e j at e . T: 0 x E,储存于室温。 sB

上样缓冲液： 2% . 0澳酚兰： 2%苯青F;% ( ) 5 . 0二甲 5 F 4词亏蔗糖水溶液，储存 0于4。 ℃

. 2细菌核糖体1S N 3 6r A的P R D C细菌核糖体 1S N的 P R扩增引物为通用引 6r A D C物对 98一1 l( s:5’一 6F 4 R9 r o 6 A C C A G A C T C 3 1 l:,C G G G A A G c C 3,在正向 A G G A A C TA一， 4 R 5 G T T C A A C一，; 0一 T )

引 6的5连个G夹 ococc cooGo物9 F,接一 C ( cccG叱GocGco 8端 cG cG GA弱弱c )( a叮b,01 pR应体 (林：物1 MG 9s o Gcc G w加a 20) C反系 01引 0 C 6F e。 5 )肛

及1 M1 l各1, o c Bfr扩加e5, 5MM c 412l 0 4 R卜 l PR u (+ )“ 2刀 gl卜 .l“ o 1 x eM 1 1:, sM州即 l

细菌分子鉴定及转化.pdf

41灭菌dHo 3“模 11 s E一 q 51(连宝生。于PR林， dZ 351板林 u x肠酶0林大，,物)样品 c循环仪 (T一10 P C 0,MJR s r,I . e e c n )上扩增。 C ah c P R循环参数参见文献。B 6的 9 8

P R反应参数为： C最初的变性步为9℃3 i然后从变性 9℃l i退火5.而n 4 m; n 4 m, 55 n℃1,直到延伸 7℃l i, 2 m如此反复 3个循环；℃1 m, n 6 2 7 0 i结束步为巧℃3 m ( n 0 i黄留玉， n20 ) 05。

24 DGGE .

利用 D o通用突变检测系统 (。Rd e cd i B一a,美国)完成整个实验；除特殊说明外，所有的试剂均购自美国Alr公司。 le c ls o

参照E s R等的方法，使用Boa公司的通用突变检测

系统电泳仪 (h Bo d n a v ia i Rd Te

Do Ui a u oDtt st )行泳电条：%丙酞胶 Cd n v l t n ec nye进电。泳件 6聚烯胺，严 e Ma s r i ei s o m凝胶的变性范围为 3%一6% ( 0 5 0 1%的变性胶包含 7 0 M尿素和 4%甲酞胺)肠道样品 0;

10,0,3: 0V 6, 1水环境样品 10,0,j。 C h 0 6o g h电泳缓冲液：0 MT s1m V C 2m r,0 M i

N,叭c

lM D, H 4电 m E T p 7。泳结束后，以E染 0分 A B色3钟到6分 d漂洗5 0钟，场。分钟，紫外线照射成像。

. D G 2 I G E试剂的配制 . 4

1 l m 4%丙烯酞脚甲叉基双丙烯酞胺溶液 (7:1 . o L0 3. ) 5丙烯酞胺甲叉基双丙烯酞胺 3. 9 83 9 17 .9 0

加d Z H d O至1 m, 4m的滤膜 (ao s德国) 0 L 0林 . S r, tu ri抽滤后避光保存于4℃。2 Z 5 XT E= . . L 0 A伊H 7 ) 4T S韶e巧 b

22 9 4., 05 11 71 1, 1 1 0n, 0 Il

Ac ca i, g i di cd l a c al 05 E人， P S M DI H. 0

补加d Z l o l HO到 o m。混合高压灭菌 ( oae 2一分钟，并在室温保存。 t u l a cv) 0 3 0

细菌分子鉴定及转化.pdf

3 1O工 1% . 0m 0变性剂溶液 (%的胶) 6

0丙 4%烯酸胺/ 又基双丙烯酞胺溶液甲5 XT E (二 .) H 74 0 A P

1 mL 5

211 1 1

服素

49 24 n 0I L

去离子甲酞胺

加dHo至 l L 5℃ m, 0水浴助溶， 4 m的 d Z o o 0拼滤膜 (aou, s rs德国) t ri抽滤后避光保存于4 ℃。 4 l m O变性剂溶液 (%的胶), o L% 6

0丙 4%烯酸胺/ 叉基双丙甲烯酞胺溶液5 XT E ( H= 4 .) 0 A P 7

I mL s夕「 ml

加d姚0至 10 L 0林 m, . m的滤膜 (aou德国)抽滤后避光保存于4 d 0 4 Srr ti s℃。 5 Sm上样缓冲液 . OL甘油 4 m 1L )d 0 1m 2 H 0L

澳酚兰 5 0 29 1二甲 5苯青 0 2 . 9 1室温保存。

6 n 1的过硫酸钱溶液 .I L 0 1%

过硫

m酸钱 1 g 0d H0 l L d2 m

4保存，一周内有效。℃

. 22DG . 4 G E操作过程：

(将两套玻璃板用硫酸与重铬酸钾所配成的洗液浸泡4以上，彻底洗净后烘干， ) 1 h 8

细菌分子鉴定及转化.pdf

再用 9% 7的乙醇擦拭干净，风干；()在一洁净的操作台上，将一块相对长的玻璃板朝下，两边各放置一条让 1n的 2 5l 71 l

隔条， 在其上再放上另一块相对短的玻璃板，两边分别夹上与隔条平行的玻璃板夹并稍旋紧固定旋钮；

() 3将上述装好的玻板固定在制胶器上，其下方垫一块密封海绵垫，调整隔条垂直；

4重复以 ()上操作，两套玻璃板作同样的固定后待用；(利用 10变性剂溶液 (% ) 5 0% 6的胶) 0变性剂溶液 (%的和% 6胶)在冰上按要求配成高、 低两种含不同浓度变性剂的胶液各巧m,并保存于冰上； L

6 ()在上述两种胶液中分别加入9科 1的 0L 0过硫酸钱溶液，%搅匀后在冰上冷却s i m n

以再分别 加入9L上，林冰冷的N N N N一四甲二 (E E ) s a,,,,基乙胺 T M D ( g, i m美国) ,搅匀； (取出在一2℃预冷的 2个 3m ) 7 0 0 L注射器及梯度混合器 (注射体积设在 1. L 4 ) sm

( o l7 Ga e ev ye )尽快将步骤 ()两种胶液分别注入两 i Dle ssm, M d 45 r n ir t o dt y 6的个注射器，并装回梯度混合器，保证含高浓度变性剂的胶液先被推出，并使推动 轮逆时针方向推到不动为止；

()连接好胶管和 Y形适配器，将出口置于步骤 ()的一套玻璃板注胶口中央； 8 4 () 9顺时针方向缓慢而匀速地转动推动轮，保证在 8 0 m完成整个注胶过程；一1 i n

() 0 1插入具有所需胶孔的仓 I的梳子， 5l 7n保证没有产生气泡：(重复步骤 (到 ( )川 ) 5 0 1,完成第二块胶的灌注；( )将上述灌注好的两块梯度胶放于光下聚合至少 l以上； 2 1 h

() 3 1水平向上拨去梳子， l T E电泳缓冲液通过注射器彻底洗净未完全聚合的丙用 xA烯酞胺胶液；

( )清洗好的电泳核心， 4 1取出按说明将两套梯度胶玻璃板固定其上，并将整个装置放

入加有7 x A泳缓冲液 (H 7的电 l T E电 L P=. ) 4泳仪中；(巧)接通控制器电源，启动缓冲液泵，将升温速率设在2 ( 0

最大),温度设于 6℃ 0或所需温度；

( )达到温度时，加样按 6 1当预设取下盖，样品：样缓冲液二1上约1 L上：1样 0;林( ) 7 1盖好加样盖，按要求设置好电泳电压与电泳时间，接通电泳直到电泳结束；( ) 8 1在自来水中剥胶，并用 E B于 l T E电泳缓冲液 (H .中染色 3 m, xA P二7 ) 4 0 i n

细菌分子鉴定及转化.pdf

自来水冲洗 sn,紫外成像即可。 rn l

2 D G . G E胶的回收 S闪 E夜。水 0 i其间震 5 n 0 1川无 R a水冲洗， 0 Ns e压碎，巧 T过 4℃浴 4m,旋涡荡 4次，吸取 T E缓冲液冻存于一2℃作为模板 0

. 2回收D A的P R扩增和琼脂糖凝胶电泳检测 6 N C引物中没有 C夹，P R的循环数为 3个，其它同2里面的步骤。 G C 2 . 3聚丙烯酞胺凝胶 D A回收试剂盒 ( N离心柱型)得到的D A经上述 P R后用琼脂 N C糖凝胶电泳检测。其条带亮度要求不高。只要每微升几纳克就可经纯化后用连接反应。电泳检测同2细菌总 D A琼脂糖电泳检测方法。 . 2 . 2 N

. 2 P R产物的回收 7 C采用上海申能博彩有限公司的G S 3 o柱离心式P R产物回收试剂盒V . C 3,具体步 1骤如下：

注意：

首次使用前，必须在W h l o瓶中加入5m无水乙醇，比 s un ot i 0l充分混匀后使用。每次使用后将瓶盖盖紧，以保持叭 s s而。中的乙醇含量。厄h o n l

Tp S或者 EH 0水均可以脱，是水 .用洗但洗胶效通常率要低一些，样品水测序请用洗脱。

该试剂盒不能用于从Aa s胶中回收D A片段。 g e o r N从P R反应体系中回收P R扩增产物： C C

A PR、C结束后， c反从P R应管中将反应液干移至净的1m Ep d离心管中 . 1pe i s n f o加入4倍体积的s uo B混匀。 l o n S i t无论样品量多少，最少需要使用4川 5l o B。 0 o n s i t u

细菌分子鉴定及转化.pdf

B将 3柱放入收集管中， 、 5把混合液转移到柱内，不要盖上离心管盖，室温放置2

分钟；盖上离心管盖(盖子也可以不盖，但是如果您同时有很多样品，担心混淆或弄翻

溶建议您离心管盖 )用台离心速液，盖上子，式机高离心 ( o rl 1 0 1 op )分钟。 nC倒掉收集管中的废液， 5柱放入同一个收集管中， 、将3加入60 a sli, 0川W s ou o h tn高速离心 (00

甲 )1 1 0 m分钟。 0D 、重复步骤3即步骤C一次。

E倒收中废将3放同个集中高离 1 om 2 管的液， 5柱入一收管，速心( 0 r )、掉集 0 p分钟。

F将3柱一根新的1 m离管中， 5柱央 0 T或水，要 放入、 5 .l心 s在3膜中加3川 E不盖上离心管盖，室温或 3℃放置2分钟。 7提高洗脱温度有利于提高 D A的洗脱效率。 N

G盖 心管 1 0rl速离心1钟，管中的、上离盖， O p l 0 l高分离心液体即收的D A为回 N片段，可立即使用或保存于一2℃备用。 0

注意：

用该方法纯化P R产物需要注意几个问 C题：扩增产物的特异性必须非常高。

对特异性差的反应， g s胶回收目 应A a e o r的片段，请用B s B T的K l, 11 N l K DA 3胶回收试剂盒。模板 D A的存在，应不影响下游工作，对于用质粒模板要特别当心。 N

. 2克隆操作 8

.大肠杆菌感受态细胞的制备 21 . 8第一天：

A、准备工作：S B平板 O 2g珍P n 0T t e o s ya g s e tZ i l s l a I mo/ C N

细菌分子鉴定及转化.pdf

2s .ml l】 C mo/ l K

1琼脂 5 9粉加入双蒸水定容至 10而。要灭菌。 0为第二天准备灭菌 6 5m的离心管。准备各种大小的灭菌枪头各一盒、灭菌的个0 l

1 m离心管。 .l s并将它们放入干燥箱中干燥过夜。打开紫外灯灭菌超净工作台。预备好紫外线灭菌要使用的工具：酒精灯、移液器、接种环等等。 B 、用接种环取大肠杆菌D 1B菌种接种在 S B平板上 3℃过夜 1个时以上来 H 0 O 7 8活化菌体再挑单菌落。划线时在培养基上用接种环划之字形注意： 培养基为 S B液体培养基， S B的液体培养基中加入琼脂糖配成的； O是 O其

中没抗生素A p此要小心杂菌污染。有加 m,因第二天：

C 、准备工作：

sB o液体培养基：

Zg。 t e o T,o ns y a E tc g s et x at rZ ml s。 l a I幻o N C/2s

.ml l】 I mo KC j

加入双蒸水定容至 10n。要灭菌。 0 i l检查提前一天准备的灭菌的几个 5m的离心管以及各种大小的灭菌枪头各一盒。 0l

打开紫外灯灭菌超挣工作台。预备好紫外线灭菌要使用的工具：酒精灯、移液器、接种环等等.

D 、挑取大肠杆菌 D 1B单菌落接种于Z S B液体培养基中，3℃摇菌，约6 H 0 l i n O 7小时。第三天：

E、准备工作：S B液体培养基： O2g r t 0T Pn y o e s ya g s e lZ ml s l C mo Na I j

25 l I l】 CI .n】 no/ K

细菌分子鉴定及转化.pdf

加入双蒸水定容至 10而。要灭菌。 0

打开紫外灯灭菌超净工作台。预备好紫外线灭菌要使用的工具：酒精灯、移液器、 接种环等等。

准备好雪花冰或冰块放入一个可放几十个 1 i离心管的小盒子和一个可放 5 ,l sn 0到1 0 l 0 m三角瓶的盒子，这二个盒子都要可放入超净工作台中且不防碍无菌操作。至少提前半个小时打开紫外分光度计，紫外分光度计要半个小时才能完全启动。 调试好离心机， 注意要提前半个小时让离心机中的温度降到4℃以用来离心感受态细胞，并调整好其它参数和转子。

检查提前一天准备的灭菌 6 5m的离心管以及各种大小的灭菌枪头各一盒、灭 个 0l菌的 1 n离心管。 .i s l

迅速灭菌 r的甘油 ( % o丙三醇)用来洗感受态细胞；灭菌5% 0的甘油丙三醇) (用来调整感受态细胞的终浓度至 1 0% 0%一2。F 、将第二天接种于 2 S B液体培养基中并培养了6 1个小时后的种子液接耐 O到

种于含4 1 O 0 1 B培养基的2止S升三角瓶中；G 、同时打开紫外分光度计，测空白对照即S B液体培养基； O

H 3℃ r o m摇床、 2 p 7 0培养至o 5= 5 0,冰 D 0￣ 7在上摇匀，浴速冷1分后， 0 . .冰 0钟

4 1 9 0分钟收℃2离心1 0集细菌。1 将离心管放在冰中，、弃上清，加入sn l% o o甘油， 0 9 l i 2离心 1分钟， 0如此将菌体用 1%甘油洗涤 2 0次； J 用灭菌的 5%的甘油将管底细菌的甘油浓度调至 1%到2%间以利于、弃上清， 0 0 0保存。

K 、最后将细菌收集分装，于一8℃乙醇浴速冻后保存。 0

. 2 2连接反应 . 8 A对于D

A扩增产物回或者浓缩于接， M 1Tvc:载D A、 N收后用连用p D8 e装 N一 t o扩增产物。

B在微量离心管中 、加入p D8 vcr. 1 n r N ll M 1T e o林和Ie D A p补加d到5 1一 t 5 st o,凡。林。然后再向微量离心管中加入5闪等量的L i肠x i o t a gn。

细菌分子鉴定及转化.pdf

C 1连应3时。所用的剂来自肠 aa的p D 8 e r但、℃接反个小 ( 6试 k R M 1TVc,对一 t o试剂盒说明书上提供的方法有改动) D连接混合液需要沉淀。 2、用倍体积的无水乙醇、十分之一体积的3 M的醋酸钠

混匀，于一℃ 8℃并 2或一冷冻2分钟以再以1 0 m的 0 0 0上， 2 r速度离 0p心巧分钟。 E弃上加入7的、清 0无水乙%醇以1 0 m的 2 r速度离心6钟。 0p分F 、小心吸走上清液，将离心管自然烘干。

G最后 0菌水，、加入1闪灭至此得离管中溶液为到的心的连接产物。

H使 i 公的McPl洲 Ec par激化在上冻丑o、用B釉d司 i ue l ro o电转仪。冰解 ci o o r s eo r t t l感受态细胞2匹， 1 0与川连接产物混合，放入电激杯中的两个突起之间，盖上杯盖。1 K,6 s、于10 V m的条件下电 80激。

J将电 、激产物转入 IL 0 so液体培养基更好) n s B( c 1液体培养基中，℃2甲 7 3 0 m摇床中培养 1小时。 K 1林 301、然后吸取 0 10林也可以培养物涂布于含 3林 Xg ( g l 8川 0( ) 5I一 2/ ) l a 0m m,

P ( m比) 1林 m A于的L固培基 3℃ I G1。,。创 L州 T 0 B体养上，培养过夜，以检 7备测。L4 h上，让非重组克隆菌落充分蓝化。、℃放置s以根据Q 一互补的原理 (即当外源D A片段插入到载体的多克隆位点后，由 N于外源D A片段核酸序列的存在改变了 Lc N a Z基因的编码，从而影响了产物 p一半乳糖昔酶

Q片段的活性，此重组克隆在Xg印平板上呈现为白而非重组克隆因 .U T a G色，呈蓝色),

用牙挑色签取白菌落至含有氨节青霉素 (即L工的L液体 1 I ) B 0 .培养基，个至每平板少挑 5个单菌落，3℃、1 r i的振荡培养过夜。 7 0 m 2/ n

.重组子的鉴定和保存 23 . 8A、随机挑取白色单菌落，

用1S N 6 r A的无 G D C夹的通用引物来进行菌落 P R扩 C增，用以鉴定转化效率和插入片段的大小。

P R反 C应体系(林：物98及1 l Zp o 1xu r 1M C 2 m 5 1引 6F 4 R各 om l 0bf s, g1· M, 0) o, e林 2 o

胡T on H 0 3林模板11E一 q 2 U( P .1 2 3. 1 ZM, 5,“ x几酶 5大连宝生。,物)反应体系为： mm比 d T 4 lS川几叼 0川 C bfr川 M l卜 l o N pp U,/酶 .,p R u s, gi 1 5 e C4,

细菌分子鉴定及转化.pdf

补足水至5砰扩增条件为B61 9o分钟； 2 01。 98: 4 3 C 3个循环 (℃1 9分钟， 5℃1钟， 4 5.分 5

2 7℃1; 0 分钟) 7℃1钟；巧℃分钟。川扩物经1琼脂糖凝胶电测。 2分 0 3取5增产%泳检当 确认转化效率在8%以插入片段大小 0上，分布适中以将4保存 (后，℃王艳红， 5。加0)P R克隆产物的鉴定及测序： C利用博亚生物技术有限公司的质粒 D A小抽试剂盒 N

提取克隆质粒，然后用Eo I Eo V (aa,日 cR和 c R T r k a本)消化质粒。具体过程如下：

A取1m过夜培养菌 的、 . s L液到1m Ep o管中，1。 1离心1, . Lp i s d n e f加。八i r1 n而n弃尽上清；

B在细菌 、沉淀中加入20L溶液协 R a ( gI)振荡彻浮； 5”s l与2L s 4/ L,至底悬 N e m O AC加入2 L 林 S溶液，、 0 5 Z立即温和地上下翻转离心管5 0次以一1混匀，使菌体充分裂解直至形成透亮的溶液 (此步不宜超过s i; m ) n

D加入4 L℃ 林 4预冷的5溶液，温和并翻转离心管5 0次以、 0 3立即充分一1混匀，室温下静置Z,直到形成坚实的凝集块，1 0r l离心 1而n l i m加0/ n m 0: E 、小心吸取步骤 D中的上清并转移到D A吸附柱中， N将吸附柱放入置于废液收集管中，10 r i离心 l i 0c/ n o m ml l,弃废液，将吸附柱放入同一收集管中；

F在吸附柱中加入 5“ wl离心3,废液， 、 0 L液， 5 0弃将吸附柱放入同一收集管中；

G在吸附 加入7卜 w液，心35弃液，、柱中 0 L Z离 0废将吸附放入同收，柱一集管中；H G、重复步骤；

1加入冰冷

的7的乙醇6“, 5%、 0 L离心35弃废液， 0,将吸附柱放入同一收集管中；J 、最高速离心 l i以保证产物的纯度； m n

K将吸附柱 移入新的 1n Ep d管中在D A吸附央加6洗液、 5 Lpe r, N 1 n f o膜中即L脱或预热的超纯水，室温静置 1,离心 l i得到克隆质粒D A而n m, n N;

L取克质 N SL加入1反缓液、P I‘ 1林，充 隆粒D A”,、所提 x 0应冲 s和石。各1补，天 L加菌入灭超纯水2L 3℃林，温浴3以 7 h上： M、骤L反产物与2“倍澳蓝样缓冲液混 的应终将步 L6酚上合，1%脂泳 5琼糖电(1 3而n E染色后紫外成像， , 0 ), B 1V 0根据分子量大小确定阳性克隆； N对阳性克隆菌株扩大培养到S L上，心回 、 m以离收所有的菌体细胞直接交于博亚生物技术有限公司用 A I r 33 X D A分析系统测序。 B P s 7O L N i m

本文来源：https://www.bwwdw.com/article/vak1.html