朱玉贤版分子生物学学习笔记

Modern Molecular Biology

第一章 绪论

开放阅读框（open reading frame）：是指一组连续的含有三联密码子的能够翻译成多肽链的DNA序列。它由起始密码子开始，到终止密码子结束。

中心法则（central dogma）：由克里克首次提出的遗产信息的传递规律，该法则阐明了DNA复制、RNA转录以及翻译产生蛋白质在生命过程中的核心地位。 第二章：染色体与DNA

冈崎片段（Okazaki fragment）:是在DNA半不连续复制中产生的1000~2000个碱基的短的DNA片段，能被连接形成一条完整的DNA链。

DNA的半保留复制（semi-conservative replication）:DNA在复制过程中，每条链分别作为模板合成新链，产生互补的两条链。这样新形成的两个DNA分子与原来DNA分子的碱基顺序完全一样。因此，每个子代分子的一条链来自亲代DNA，另一条链则是新合成的，这种复制方式被称为DNA的半保留复制。

DNA的半不连续复制（semi-discontinuous replication）：DNA复制过程中前导链的复制是连续的，而另一条链，即后随链的复制是中断的、不连续的。

复制子（replicon）:单独复制的一个DNA单元被称为一个复制子，它是一个可移动的单位。一个复制子在任何一个细胞周期只复制一次。

复制叉（replication fork）：复制时，双链DNA要解开两股链分别进行DNA合成，所以复制起点呈叉子形式，被称为复制叉。

错配修复（mismatch repair）:是对DNA错配区的修复。通过母链甲基化原则找出区分母链与子链从而修正子链上错配的碱基。

切除修复（excision reprir）：DNA损伤的一种修复机制。直接切除受损伤的一段DNA片段，以其互补链为模板新合成DNA来取代切除的受损片段。

单顺反正mRNA：指只编码一个蛋白质的mRNA。

多顺反子mRNA(polycistronic messenger RNA);一种能作为两种或多种多肽链翻译模板的信使RNA，由DNA链上的邻近顺反子所界定。

重组修复（recombinant repair）:又被称为“复制后修复”，它发生在DNA复制之后。机体细胞对复制起始时尚未修复的DNA损伤部分可以先复制再修复，即先跳过该损伤部位，在新合成链中留下一个对应于损伤序列的缺口，该缺口由DNA重组酶来修复：先从同源DNA母链上将相应核苷酸序列片段移至子链缺口处，然后再用新合成的序列补上母链空缺。大肠杆菌rec基因编码主要的重组修复系统。

C值矛盾（C-value paradox）：即C值反常现象。我们把一种生物单倍体基因组DNA的总量称为C值，指C值往往与种系的进化复杂性不一致的现象，即基因组大小与遗传复杂性之间没有必然的联系，某些较低等的生物C值却很大,如一些两栖类物种的C值甚至比哺乳动物的还大。由此推断，许多DNA序列可能不编码蛋白质，是没有生理功能的。

真核生物和原核生物DNA复制的区别:一，真核生物每条染色质上可以有多处复制起始点，而原核生物只有一个起始点。二真核生物染色体在全部完成复制前，各个起始点上的DNA复制不能再开始，而在快速生长原核生物中，复制起始点上可以连续开始新的复制。有多个复制叉。

证明DNA半保留复制的实验:梅瑟生-史达实验证明了DNA复制的半保留性质。氮是DNA的重要组成部分，氮14（14N）则是氮中最常见的同位素，而较重的氮15（15N）在自然界也可以独立存在，并不具有放射性，只是相对比重较大。实验首先将大肠杆菌培养在含有氮15的培养基之中数个世代，等这些细菌的DNA只含有氮15N之后，再放入含有

\\氮14的培养基中培养，培养1代后，抽取样本提取DNA，再采用氯化铯密度梯度离心法分析。结果发现提取的DNA样本分子密度从0代(重密度)至1代(中等密度)减少，位于氮15和氮14之间，DNA所含氮15及氮14的密度相等。如果复制为全保留，那么将只有氮15及氮14两种DNA的存在，因此实验结果将华森克里克的半保守复制模型首次获得分子水平的证明。

第三章：从DNA到RNA

启动子（promoter）:是基因转录起始所必需的一段DNA序列，是基因表达调控的上游顺式作用元件之一。

内含子(intron)：是一个基因中非编码DNA片段，它分开相邻的外显子。内含子是阻断基因线性表达的序列。

外显子(exon)：是真核生物基因的一部分，它在剪接后仍会被保存下来，并可在蛋白质生物合成过程中表达为蛋白质。

增强子(enhancer)：能使与它连锁的基因转录频率明显增加的DNA序列，因为它也能强化转录的起始，又称强化子。它们不是启动子的一部分。

衰减子（attenuator）：位于细菌操纵子上游的一段核苷酸序列，通过翻译前导肽控制DNA的转录。

沉默子（silencer）：可降低或抑制邻近基因启动子的一段DNA序列。 操纵子（operon）：很多功能上相关的基因前后相连成串，由一个共同的控制区进行转录的控制，包括结构基因以及调节基因的整个DNA序列。

编码链（coding stand）：即有意义链（sense stand），指DNA双链中与mRNA序列(除T/U替换外)和方向相同的那条DNA链。

模板链（template stand）：即反义链（antisense stand），指DNA双链中能作为转录模板通过碱基互补配对原则指导mRNA前体合成的DNA链。

mRNA转录后的加工：mRNA前体分子需要通过三个修饰加工才能转化为成熟的mRNA。这三个修饰包括5'端加帽、3'端多聚腺苷酸化和RNA剪接，发生在细胞核中mRNA翻译之前。

a、5'端加帽。mRNA前体的加工包括了在其5'端加上7-甲基鸟苷（m7G），称之为“帽”。为了进行加帽，5'端的磷酸基团需要被去除，这是在磷酸酶的帮助下完成的；接着鸟苷转移酶催化产生具二磷酸的5'末端；带二磷酸的5'末端随后攻击GTP分子上的α磷原子，使得鸟嘌呤残基以5'5'三磷酸的连接方式加入5'端；然后在S-腺苷基蛋氨酸辅酶的作用下，将鸟嘌呤环上的N-7位置甲基化。这种类型的“帽”（只含m7G）被称为“帽0结构”（cap 0 structure）；而如果下游邻位核苷酸上的核糖也被甲基化，则为“帽1”，再下游的则为“帽2”??以此类推。其中，甲基基团是被加入到核糖的2'羟基上。这样的加帽加工保护了初级转录RNA免于被能够特异性切割3'5'磷酸二酯键的核糖核酸酶攻击降解。

b、3'端加polyA尾。剪切和多聚腺苷酸化，对于mRNA前体的3'端的加工包括了对3'端的切割以及随后加上的约200个腺嘌呤残基以形成多聚腺苷酸尾。当mRNA前体分子的3'端附近存在有多聚腺苷酸化信号序列（5'- AAUAAA-3'，其后通常还跟着5'-CA-3'序列），切割和腺苷酸化反应就会发生。另一个信号序列：GU富含序列，其通常位于mRNA前体分子的下游远端。在信号序列被合成后，两个多亚基蛋白质复合物，“剪切和多聚腺苷酸化特异性因子”（cleavage and polyadenylation specificity factor）和“剪切刺激因子”（cleavage stimulation factor），从RNA聚合酶II上转移到RNA分子上并与信号序列结合。随后，在加入更多的剪切因子和多聚腺苷酸聚合酶（PAP）后，形成一个更大的蛋白质复合物。这一复合物在RNA上对多聚腺苷酸化信号序列和GU富含序列之间的（5'-CA-3'）特征位点进行切割。然后，多聚腺苷酸聚合酶利用ATP为原料，从切割后生成的新的3'端加入约200

个腺嘌呤基团。多聚腺苷酸尾巴被合成后，多个多聚腺苷酸结合蛋白就可以结合上来，保护3'端，避免被核糖核酸酶降解。

c、剪去内含子拼接外显子。RNA剪接是将RNA上属于非编码区的内含子从RNA前体上除去并将剩余的外显子拼接在一起的加工过程。虽然大多数的RNA剪接发生在RNA前体完全合成并加帽后，许多外显子的剪接可以在转录过程中发生。剪接反应是由一个被称为剪接体（由一些识别位于mRNA前体序列中的剪接位点的蛋白质和小核RNA分子聚合而成）的蛋白质复合物来进行催化的。许多mRNA前体，包括编码抗体的mRNA，都能够以多种方式被剪接，以产生各种编码不同蛋白质序列的成熟mRNA；这样一种剪接加工被称为选择性剪接，其目的是从有限的DNA序列中生成大量不同的蛋白质。

RNA的编辑、编码及化学修饰：p108-p112 第四章：从mRNA到蛋白质 第五章遗传密码的性质：

连续性:起始密码子决定了所有后续密码子的位置，说明三联体密码是连续的。 简并性:许多氨基酸有多个密码子，对应于同一氨基酸的密码子称为同义密码子。 摆动性：密码自语反密码子的相互作用。（摆动假说：在密码子与反密码子的配对中，前两对严格遵守碱基配对原则，第三对碱基有一定的自由度，可以摆动，因而使某些tRNA可以识别1个以上的密码子。）

通用性：遗传密码无论在体内还是体外，对病毒，细菌，动物还是植物而言都是通用的，所以具有通用性。

为什么需要这样的特性，意义何在（从生物进化的角度）：

错义突变（missense mutation）:由于结构基因中某个核苷酸的变化使一种氨基酸的密码变成另一种氨基酸的密码。

无义突变（nonsense mutation）：在DNA序列中任何导致编码氨基酸的三联密码子转变为终止密码子（UAG、UAA、UGA）的突变，它使蛋白质合成提前终止，合成无功能的或无意义的多肽。

同义突变（same sense mutation）：碱基置换后，虽然每个密码子变成了另一个密码子，但由于密码子的简并性，因而改变前、后密码子所编码的氨基酸不变，故实际上不会发生突变效应。

DNA复制与转录的异同点

相同点：都以DNA为模板；都遵循碱基互补配对原则；主要在细胞核内进行。 不同点：a时间不同。复制在细胞分裂的间期，转录发生在个体生长发育的整个过程。b模板不同。复制以DNA双链为模板，转录以DNA的一条链为模板。c、原料不同。复制的原料为4种脱氧核苷酸，转录的原料为4种核糖核苷酸。d、酶不同。复制所用的酶为DNA聚合酶，而转录所用的酶为RNA聚合酶。e、模板去向不同。复制的模板分别进入2个子代DNA分子中，转录的模板恢复原样，与非模板链重新绕成双螺旋结构。f、特点不同：复制的特点是半保留复制，边解旋边复制，转录的特点是边解旋边转录，转录后的DNA仍然恢复原来的双链结构。g、产物不同。复制的产物是2条双链DNA,转录的产物是1条单链RNA。h、信息传递不同。复制是由DNA到DNA，转录是由DNA到RNA。

DNA转录和蛋白质合成的比较:

蛋白质翻译后修饰类型：

1、N端fMet或Met的切除。细菌蛋白质氨基酸的甲酰基能被脱甲酰化酶水解，不管是原核生物还是真核生物，N端的甲硫氨酸往往在多肽链合成完毕之前就被切除。得到有功能的蛋白分子。

2、二硫键的形成。mRNA中没有胱氨酸的密码子，而不少蛋白质都含有二硫键，这是蛋白质合成后通过两个半胱氨酸的氧化作用生成的。二硫键的正确形成对稳定蛋白的天然构象具有重要作用。

3、特定氨基酸的修饰。氨基酸侧链的修饰作用包括磷酸化（如核糖体蛋白质）、糖基化（如各种糖蛋白）、甲基化（如组蛋白、鸡肉蛋白质）、乙基化(如组蛋白)、羟基化（如胶原蛋白）和羧基化等。

磷酸化——加入磷酸根至丝氨酸、酪氨酸、苏氨酸或组氨酸。

糖基化——由内质网中的糖基化酶催化，将糖基加入天冬酰胺、羟离氨酸、丝氨酸或苏氨酸，形成糖蛋白。

乙酰化——通常于蛋白质的N末端加入乙酰。 烷基化——加入如甲基或乙基等烷基。

甲基化——烷基化中常见的一种，由细胞质中的N-甲基转移酶催化，在赖氨酸、精氨酸等的侧链氨基上加入甲基，以及Glu和Asp的侧链羧基上加入甲基。

4、切除新生肽链中的非功能片段。一般来说，由多个肽链及其他辅助成分构成的蛋白质，在多肽链合成后还需经过多肽链之间以及多肽链与辅基之间的聚合过程，才能成为有活性的蛋白质。

第五六章：分子生物学研究方法 转化和转染技术

转化：同源或异源的游离DNA分子(质粒和染色体DNA)被自然或人工 感受态细胞摄取，并得到表达的水平方向的基因转移过程。

转染：转染 （transfection）采用与质粒DNA转化受体细胞相似的方法，即宿主菌先经过CaCl2，电穿孔等处理成感受态细菌，再将重组噬菌体DNA直接导入受体细胞，进入感受态细菌的噬菌体DNA可以同样复制和繁殖，这种方式称为转染。转染是转化的一种特殊形式。

同尾酶：切割不同的DNA片段但产生相同的粘性末端的一类限制性内切酶。

同裂酶：有一些来源不同的限制酶识别的是同样的核苷酸序列，这类酶称为同裂酶。同裂酶的切割位点可能不同，识别序列和切割位点都相同的叫同序同切酶，识别序列相同但切割位点不同的叫同序异切酶。

载体要具备的特点:质粒是小型环状DNA分子，在基因工程中作为最常用，最简单的载体，必须包括三部分：遗传标记基因，复制区，目的基因。

1、 是染色质外的双链共价闭合环形DNA，可自然形成超螺旋结构。 2、 能自主复制，是能独立复制的复制子。 3、 质粒对宿主生存并不是必需的。

分子杂交技术：互补的核苷酸序列通过Walson-Crick碱基配对形成稳定的杂合双链分子DNA分子的过程称为杂交。分子杂交是通过各种方法将核酸分子固定在固相支持物上，然后用放射性标记的探针与被固定的分子杂交，经显影后显示出目的DNA或RNA分子所处的位置。 一般分为Southern杂交和Northern杂交两大类。

Southern blotting,Northern blotting,western blotting的比较：

Southern 其基本原理是将待检测的DNA样品固定在固相载体上，与标记的核酸探针进行杂交，在与探针有同源序列的固相DNA的位置上显示出杂交信号。通过Southern杂

交可以判断被检测的DNA样品中是否有与探针同源的片段以及该片段的长度。

Northern杂交其原理是在变性条件下将待检的RNA样品进行琼脂糖凝胶电泳，继而按照同Southern Blot相同的原理进行转膜和用探针进行杂交检测。

Western杂交的原理：SDS-PAGE电泳将蛋白质按分子量大小分离，再把分离的各蛋白质条带原位转移到固相膜，加入特异抗性体（一抗），膜上的目的蛋白与一抗结合后，再加入能与一抗专一性结合的带标记的二抗，最后通过二抗上带标记化合物的特异性反应进行检测。

分子生物学发展重大贡献：一，1941年G.W.比德尔和E.L.塔特姆提出了“一个基因，一个酶”学说，即基因的功能在于决定酶的结构，且一个基因仅决定一个酶的结构。但在当时基因的本质并不清楚。二，1944年O.T.埃弗里等研究细菌中的转化现象，证明了DNA是遗传物质。三，1953年美国科学家J.D.沃森和英国科学家F.H.C.克里克提出了DNA的反向平行双螺旋结构，开创了分子生物学的新纪元。四，1958年Crick在此基础上提出的中心法则，描述了遗传信息从基因到蛋白质结构的流动。五，1961年法国科学家F.雅各布和J.莫诺提出了操纵子的概念，解释了原核基因表达的调控。

基因克隆（gene cloning）:在分子生物学上，人们把外源DNA插入具有复制能力的载体DNA中，转入宿主细胞使之得以永久保存和复制的过程称为基因克隆。基因工程或重组DNA技术则侧重于验证上述过程所获得遗传物质新组合在宿主细胞内的功能表达与功能鉴定。

DNA重组技术（recombinant DNA technology）:将不同的DNA片段按照预先的设计定向连接起来，在特定的受体细胞中与载体同时复制并得到表达，产生影响受体细胞的新的遗传性状的技术。

基因敲除技术（gene knock-out）技术：针对一个序列已知但功能未知的基因，从DNA水平上设计实验，彻底破坏该基因的功能或消除其表达机制，从而推测该基因的生物学功能。

基因组DNA文库（cDNA/genomic DNA library）:是某一生物体全部或部分基因的集合。将某个生物的基因组DNA或cDNA片段与适当载体在体外重组后，转化宿主细胞，所得的菌落或噬菌体的集合即为该生物的基因组DNA或cDNA文库。

聚合酶链反应（polymerase chain reaction,PCR）:是指通过模拟体内DNA复制方式在体外选择性地将DNA某个特定区域扩增出来的技术。

蓝白斑筛选:蓝白斑筛选是一种基因工程常用的重组菌筛选方法。 是根据载体的遗传特征筛选重组子，如α-互补、抗生素基因等。现在使用的许多载体都带有一个大肠杆菌的DNA的短区段，其中有β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控序列和前146个氨基酸的编码信息。在这个编码区中插入了一个多克隆位点（MCS），它并不破坏读框，但可使少数几个氨基酸插入到β-半乳糖苷酶的氨基端而不影响功能，这种载体适用于可编码β-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞。因此，宿主和质粒编码的片段虽都没有酶活性，但它们同时存在时，可形成具有酶学活性的蛋白质。这样，lacZ基因在缺少近操纵基因区段的宿主细胞与带有完整近操纵基因区段的质粒之间实现了互补，称为α-互补。由α-互补而产生的LacZ+细菌在诱导剂IPTG的作用下，在生色底物X-Gal存在时产生蓝色菌落，因而易于识别。然而，当外源DNA插入到质粒的多克隆位点后，几乎不可避免地导致无α-互补能力的氨基端片段，使得带有重组质粒的细菌形成白色菌落。这种重组子的筛选，又称为蓝白斑筛选。如用蓝白斑筛选则经连接产物转化的钙化菌平板37℃温箱倒置培养12-16hr后，有重组质粒的细菌形成白色菌落。

其它

提取或检测DNA时，用到核酸凝胶电泳技术，核酸分子带负电，向正电极方向迁移。

脱氧核糖核酸（DNA，为英文Deoxyribonucleic acid的缩写）。 起始密码子有AUG（编码甲硫氨酸，很容易被切掉），GUG（编码缬氨酸），终止密码子有UAA,UGA,UAG,在线粒体中AGA,AGG也是终止密码子。终止密码子不能编码氨基酸的原因是不能与tRNA的反密码子配对，但能被终止因子或释放因子识，终止肽链的合成。。

限制性内切酶通用的命名原则：第一个字母是细菌属名的首字母，第二三个字母是细菌种名的前两个字母，这些字母都要求斜体；如果同一生物种内又分为不同的血清型和菌株，其菌株名称的第一个字母用正体，并放在第三个字母后面。如果同一菌株中有几种不同的内切酶时，则分别用罗马数字Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ??来表示。

tRNA的结构特点：

1、tRNA一级结构。tRNA是单链分子。

2、tRNA二级结构。tRNA二级结构为三叶草型。存在经过特殊的修饰碱基，tRNA的3＇端都以CCA-OH结束，该位点是tRNA与相应氨基酸结合的位点。由于小片段碱基互补配对，三叶草形tRNA分子上有4条根据它们的结构或已知功能命名的手臂：

①受体臂由7对碱基组成，双螺旋区的3’末端为一个4个碱基的单链区-NCCA-OH 3’，腺苷酸残基的羟基可与氨基酸α羧基结合而携带氨基酸。

②D臂以含有2个稀有碱基二氢尿嘧啶（DHU）而得名。

③反密码子臂是根据位于套索中央的三联反密码子命名的。负责对密码子的识别与配对。

④TψC臂是根据三个核苷酸命名的，其中ψ表示拟尿嘧啶。负责和核糖体上的rRNA识别结合。

3． tRNA的三级结构。tRNA的三级结构为倒L形tRNA三级结构的特点是氨基酸臂与TψC臂构成L的一横，-CCAOH3’末端就在这一横的端点上，是结合氨基酸的部位，而二氢尿嘧啶臂与反密码臂及反密码环共同构成L的一竖，反密码环在一竖的端点上，能与mRNA上对应的密码子识别，二氢尿嘧啶环与TψC环在L的拐角上。形成三级结构的很多氢键与tRNA中不变的核苷酸密切有关，这就使得各种tRNA三级结构都呈倒L形的。在tRNA中碱基堆积力是稳定tRNA构型的主要因素。

mRNA的结构特点

1、原核生物mRNA结构特点。原核生物的mRNA结构简单，往往含有几个功能上相关的蛋白质的编码序列，可翻译出几种蛋白质，为多顺反子。在原核生物mRNA中编码序列之间有间隔序列，可能与核糖体的识别和结合有关。在5’端与3’端有与翻译起始和终止有关的非编码序列，原核生物mRNA中没有修饰碱基，5’端没有帽子结构，3’端没有多聚腺苷酸的尾巴（polyadenylate tail，polyA尾巴）。原核生物的mRNA的半衰期比真核生物的要短得多，现在一般认为，转录后1min，mRNA降解就开始。

2、真核生物mRNA结构特点。真核生物mRNA为单顺反子结构，即一个mRNA分子只包含一条多肽链的信息。在真核生物成熟的mRNA中5’端有m7GpppN的帽子结构，帽子结构可保护mRNA不被核酸外切酶水解，并且能与帽结合蛋白结合识别核糖体并与之结合，与翻译起始有关。3’端有polyA尾巴，其长度为20~250个腺苷酸，其功能可能与mRNA的稳定性有关，少数成熟mRNA没有polyA尾巴，如组蛋白mRNA，它们的半衰期通常较短。

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