植物组织培养 - 考试复习题

植物组织培养

绪论P1

第一章 植物组织培养的基本原理P3 第二章 植物组织培养的基本原理P6 第三章 植物器官和组织培养P11 第四章 胚胎培养及离体授粉P16 第五章 花药和花粉培养P20 第六章 植物细胞培养P24 第八章 原生质体培养P27 第九章 植物离体繁殖P30 第十章 无病毒苗木培育P33 植物组织培养基本操作P35

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绪论

植物组织培养的概念

植物组织培养是在无菌和人工控制的环境条件下，利用适当的培养基，对离体的植物器官、组织、细胞及原生质体进行培养，使其再生成细胞或完整植株的技术。

由于培养的植物材料已脱离母体，又称为植物离体培养（Plant culture in vitro)。 广义：对植物的器官、组织、细胞及原生质体进行离体培养技术 植物组织培养

狭义：对植物的组织（分生组织、表皮组织、薄壁组织等）及培养

产生的愈伤组织进行离体培养。

1. 无菌：使培养器皿、器械、培养基和培养材料等处于无真菌、细菌、病毒等微生物的状态，以保证培养材料在培养器皿中正常生长和发育。

2. 人工控制的环境条件：对光照、温度、湿度、气体等条件进行人工控制，以满足植物培养材料在离体条件下的正常生长和发育。

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3. 外植体：由活体（in vivo)植物体上提取下来的，接种在培养基上的无菌细胞、组织、器官等。（植物组织培养中，使用的各种器官、组织和细胞统称为外植体。）

4. 愈伤组织：外植体因受伤或在离体培养时，其未分化的细胞和已分化的细胞进行活跃的分裂增殖而形成的一种无特定结构和功能的组织。（在人工培养基上由外植体上形成的一团无序生长状态的薄壁细胞。） 植物组织培养的特点

植物组织培养的主要特点是采用微生物学的实验手段来操作植物离体的器官、组织和细胞。 具体特点表现在：

1）组织培养的整个过程都是在无菌条件下进行的，外植体、培养基、接种环境都须经过无菌处理。

2）组织培养在多数情况下是利用成分完全确定的人工培养基进行的，除少数特殊情况（进行营养缺陷型突变细胞的筛选）外，培养基中包含了植物生长所需的水分和一切大量元素、微量元素、有机物和植物激素，培养基的PH和渗透压也是人为设定的。因此，在组织培养中的植物材料不需依靠自身的光合作用制造养分，而是处于完全的异养状态。

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3）组织培养的起始材料可以是植物的器官、组织，也可以是单个的细胞（如小孢子）和三倍体细胞（如胚乳）水平上，即使是去掉了细胞壁的细胞（原生质体）在组织培养条件下也能再生完整植株。

4）组织培养物通过连续继代培养可以不断增殖，形成克隆（clone,也称无性繁殖系），或通过改变培养基成分，特别是其中的植物激素的种类和配比，而达到不同的实验目的，如茎芽增殖或生根。

5）组织培养是在封闭的容器中进行的，容器内气体和环境条件可通过瓶塞或其他封口材料进行交换。容器内的相对湿度在通常情况下几乎是100%。因此，组培苗叶片表面一般都无角质层或蜡质层，且气孔保卫细胞功能缺乏，气孔始终都是张开的。

6）组织培养的环境温度、光照强度和时间等都是人为设定的，找出这些物理因素的最适参数对组培成功也很重要。 植物组织培养的类型

广义的组织培养依外植体不同，可分为：

1、器官培养（organ culture）：对植物体各部分器官及器官原基进行离体培养的方法。 常用的植物器官有：根、茎、叶、花、果实、种子

2、组织培养（tissue culture）：对植物体的各部分组织进行离体培养的方法。

常用的组织有：分生组织、形成层组织、薄壁组织、韧皮部组织等。 茎尖分生组织培养 愈伤组织培养

3、细胞培养(cell culture)对植物单个细胞或较小细胞团进行离体培养的方法。 常用的细胞有：性细胞、叶肉细胞、根尖细胞、韧皮部细胞等。 4、胚胎培养：对植物成熟和未成熟胚以及具胚器官进行离体培养的方法。 常用的材料有：幼胚、成熟胚、胚乳、胚珠、子房等。 5、原生质体培养(protoplast culture)： 植物组织培养的研究任务

植物组织培养的形成与发展

植物组织培养的研究历史可以追溯到19世纪中期，其开拓和发展的理论基础是植物细胞的全能性，即植物的每个核细胞具有母体全部基因，在离体培养下，都有分化、发育成完整植株的潜在能力。

该领域的发展历史可分为开创、奠基和建立三个阶段。

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植物组织培养的形成于发展—开创

1、 1838-1839年，德国科学家Schleide 和Schwann发表了细胞学说，奠定了组织培养的理论基础。

该学说的基本内容是：一切生物都是由细胞构成的，细胞是生物体的基本单位，细胞只能是由细胞分裂而来。

2、1902年，德国植物学家Haberlandt 根据细胞学说，提出单个细胞的植物细胞全能性（totipotency）理论。

他提出：高等植物的器官和组织，可以不断分割，直至单个细胞，这种单个细胞是具有潜在全能性的功能单位，即植物细胞具有全能性。他在论文中写道：虽然经常观察到细胞的明显生长，但从未观察到细胞分裂。

这位先驱者失败的原因是：实验材料高度分化；培养基过于简单。

3、1904年，Hanning 最先成功地培养了萝卜和辣根菜的胚。发现离体胚可以充分发育成熟，并提早萌发形成小苗。 1922年，美国学者Knudson 采用胚培养法获得大量兰花幼苗。 4、1922年，德国学者Kotte和美国学者Robbins进行了豌豆、玉米、棉花的茎尖和根尖离体培养，发现离体培养只能进行有限的生长，未发现培养细胞有形态发生能力。

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5、1925年，Laibach培养亚麻种间杂交幼胚获得成功，证明了胚培养在植物远缘杂交中的可能性。

植物组织培养的形成与发展—奠基

20世纪30-50年代，影响立体培养材料生长和发育的一些重要物质，如天然提取物、B族维生素、生长素(auxin)、细胞分裂素(cytokinin)的发现，促使植物组织培养的研究迅速发展，特别是分裂素与生长素的比例控制器官分化（ differentiation)的激素模式的建立，使植物组织培养技术与理论体系得以形成。

Gautheret (1937,1938)在他培养的柳树形成层的培养基中加入这些物质，使生长大大加快，随后，他用胡萝卜的小外植体培养也获得成功。

1926年，植物生理学家Went首先发现了可以促进子叶鞘生长的物质，1930年证实了这种物质是生长素——吲哚乙酸。

1937年，White又发现了B族维生素和IAA对植物根离体生长的作用，并用3种B族维生素——VB6、VB1及VB5，取代椰汁获得成功，建立了第一个由已知化合物组成的培养基。 1933年，中国学者李继侗和沈同首次报道了利用天然提取物进行组织培养的研究。他们利用加有银杏胚乳提取物的培养基，成功培养了银杏的胚。

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1934年，White 用番茄根尖经继代培养400余天(有的书上说，28年培养了1600代)，建立起第一个活跃生长的无性繁殖系，从而使非胚器官的培养首先获得成功。

1941年，Van Overbeek等将椰乳加入到培养基中，使曼佗罗的心形期胚离体培养成熟，并推测椰乳中含有促进细胞分裂和生长的生理活性物质。

法国的Nobecoort(1937,1938)培养胡萝卜根和马铃薯的块茎薄壁组织，细胞增殖获得成功。不久，White(1939)报到了烟草中间杂种(Nicotianaglauca×N.longsdorffi)幼茎切段原形成层组织的培养，继代培养也获得成功。

在White和Gautheret工作中所确立的植物组织培养的基本方法，成为以后进行各种植物组织培养的基础技术，奠定了植物组织培养的基础。1943年White发表了《植物组织培养手册》(《A Hand Book of Plant Tissue Culture》)的专著，使植物组织培养开始形成一门新兴的学科。

四十年代，Skoog和崔徵(1948)在烟草茎切段和髓培养以及器官形成的研究中，发现腺嘌呤或腺苷可以解除培养基中生长素对芽形成的抑制作用，而诱导形成芽，从而确定了腺嘌呤 /生长素的比例是控制芽和根形成的主要条件之一。这一比例高时产生芽，比例低时产生根，相等时则不分化。

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1956年Miller等发现了激动素，知道激动素可以代替腺嘌呤促进成芽，并且效果约可增加3万倍。确立了控制器官分化的激素模式为激动素/生长素的比例关系。这种器官发生的激素调空模式的建立为植物组织培养中完整植株的再生奠定了理论基础。

1953年，Muir利用往复式摇床的振荡，在液体培养基中进行了万寿菊和烟草愈伤组织的培养，获得了单细胞或密集细胞的悬浮液，并可继代增殖。这既是培养方法上的突破，也是Haberlandt培养单细胞设想的实现。

1958年，英国学者Steward和Reinert几乎同时在胡萝卜根组织的韧皮部单细胞悬浮培养中发现，体细胞在形态上可转变为与合子胚相似的结构，其发育过程也与合子胚类似。由于它是从体细胞分化而来，因而称为体细胞胚或胚状体。这一实验证实了Haberlandt的细胞全能性理论。

植物组织培养的形成于发展—建立

1958年，Wickson和Thimann发现，应用外源细胞分裂素可以打破顶端优势，促使休眠的侧芽启动生长，从而形成微型的多枝多芽小灌木丛状结构。

1960年，Morel提出了利用茎尖离体快速无性繁殖兰花属的方法，该方法繁殖系数极高，并能脱毒，国际上相继形成了“兰花工业”，并实现了试管苗产业化。

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1962年，Murashinge 和Skoog 在烟草培养中筛选出至今仍被广泛使用的MS培养基。 1960年，英国学者Cocking用真菌纤维素酶酶解分离番茄根和烟草叶片，获得了原生质体，开创了原生质体的培养。

1971年，日本学者Nagata和Takebe首次将烟草叶肉原生质体培养的再生植株。 1985年，Fujimura获得了第一例禾谷类作物—水稻原生质体培养的再生植株。 1986年，Spangenberg获得了甘蓝型油菜单个原生质体培养的再生植株。

1972年，Carlson 通过两个种的烟草原生质体融合培养，获得了第一个体细胞杂交的杂种植株。

1974年，Kao利用聚乙二醇进行了大豆和烟草科间原生质体的融合。 1953年，Tulecke首先培养银杏成熟花粉获得了愈伤组织。

1964-1966年，印度科学家Guha 和Maheswari 在曼陀罗花药培养中首次由花粉诱导得到了单倍体植株。

1969年，Kaul发现三角叶薯蓣悬浮培养物可以生产薯蓣皂苷配基，其量为干重的1.5%。 目前，利用组织培养途径生产的次生产物有皂苷类、生物碱、甾醇类、醌类、氨基酸和蛋白质等。

植物组织培养的形成与发展—应用及展望 1、植物离体快繁

运用组织培养的途径，一个单株一年可以繁殖几万到几百万个植株。例如一株葡萄一年繁殖到3万多株，一株兰花一年繁殖到400万株。 2、无病毒苗木培育

针对病毒对农作物造成的严重危害，通过组织培养可以有效地培育出大量的无病毒种苗。已经取得成功的有马铃薯、草莓、香蕉、葡萄等等。 3、次生代谢物的产生

有些极其昂贵的生物制品，如抗癌首选药物--紫杉醇等，可以用大规模培养植物细胞来直接生产。

4、培育新品种或创制新品种

1）培育远缘品种：利用组织培养可以使难度很大的远缘杂交取得成功，从而育成一些罕见的新物种。比如辽宁果树研究所利用这种方法获得苹果与梨的杂交种。

2）离体选择突变体：采用组织培养可以直接诱变和筛选出具抗病、抗盐、高赖氨酸、高蛋白等优良性状的品种。中国林科院用逐步加大培养基中盐的浓度，直接获得耐盐的杨树株

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系。

3）单倍体育种

5、植物种质资源的离体保存 6、人工种子

意义： 1）结构完整、体积小、便于贮藏与运输，可直接播种和机械化操作。2）不受季节和环境限制，利于工厂化生产。3）利于繁殖周期长、自交不亲和、珍贵稀有的植物，也可大量繁殖无病毒材料4）可在人工种子中加入抗生素、菌肥、农药等成分，提高种子品质 5）体细胞胚由无性繁殖体系产生，可固定杂种优势。 7、 基因工程的应用

（1）培育的优质、高产的转基因大豆新品种，蛋白质含量比标准品种提高45%－48%，产量提高10%－20%。（2）将鱼的抗冻基因导入番茄，获得了耐寒、高产的转基因番茄。转基因抗盐马铃薯也获得成功.

第一章 植物组织培养的基本原理

第一节：植物组织培养实验室

一、实验室要求

环境要求：理想的植物组织培养实验室应该建立在安静、清洁、远离污染源的地方，最好在常年主风向的上风方向，尽量减少污染。规模化生产的实验室最好建在交通方便的地方，便于产品的运送。

需考虑两个方面：一、所从事实验的性质 二、实验室规模 实验室设置的基本原则：科学、高效、经济和实用。 二、实验室组成 （一）基本实验室

基本实验室包括准备室、无菌操作室、培养室、缓冲间，是植物组织培养实验所必须具备的基本条件。如进行工厂化生产，年产4万-20万，需3-4间实验用房，总面积60平方米。

实验室必须满足3个基本需要：实验准备（培养基制备、器皿洗涤、培养基和培养器皿灭菌）、无菌操作和控制培养。 1、准备室

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功能：进行一切与实验有关的准备工作：器皿洗涤、培养基配制与分装、培养基和培养器皿的灭菌、培养材料的预处理等。

要求：20平方米左右。要求宽敞明亮、以便于放置多个实验台和相关设备，方便多人同时工作；同时要求通风条件好，便于气体交换；实验室地面应便于清洁，并应进行防滑处理。 设备：准备室应具备工作台、柜橱、水池、仪器、药品等。 分类：

分体式-研究性质实验室，可将准备室分解为药品贮藏室、培养基配制与洗涤室和灭菌室等，功能明确，便于管理，不适于大规模生产。

通间式-规模化实验室，设计成大的通间，试验操作的各个环节在同一房间内按程序完成。便于程序化操作与管理，减少各环节间的衔接时间，提高工作效率。还便于培养基配制、分装和灭菌的自动化操作程序设计，减少规模化生产的人工劳动，更便于无菌条件的控制和标准化操作体系的建立。 2、无菌操作室

功能：也叫接种室，进行材料的离体无菌操作，是植物离体培养研究或生产中最关键的一步。

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要求：房间一般不宜过大，10-20平方米即可。要求封闭性好，干燥清洁，能较长时间保持无菌，因此不宜设在容易受潮的地方；为便于消毒处理，地面及内墙壁都应采用防水和耐腐蚀材料；地面要求平坦无缝，便于清洁；为了保持清洁，无菌室应防止空气对流。 一般新建实验室的无菌室在使用之前应进行灭菌处理，处理方法是甲醛和高锰酸钾熏蒸，并需定期灭菌处理，还可用紫外线照射1-2h/周，或每次使用前照射10-30min。

设备：无菌操作室安装有紫外灯和空调，工作台和搁架，还有超净工作台和整套灭菌接种仪器、药品等。 3、培养室

功能：对接种到培养瓶等器皿中的植物离体材料进行控制条件下的培养，实验材料进行培养的场所。

要求：10-20平方米左右。要求能够控制光照和温度，并保持相对的无菌环境。因此，培养室应保持清洁和适度干燥；为满足植物培养材料生长对气体的需要，还应安装排风窗和换气扇等换气装置；为节省能源和空间，应配置适宜的培养架，并应安装日光灯照明。 研究用实验室，通常可根据光照时间设置成长日照、中日照、短日照培养室，也可以根据温度设置成高温和低温培养室，每一个培养室的空间不宜过大，便于对条件的均匀控制。进行

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精细培养类型如细胞培养和原生质体培养，可采用光照培养箱或人工气候箱代替培养室。 设备：培养架、光照培养箱或人工气候箱、边台用于拍摄培养物生长状况，除湿机、显微镜、温湿度计、空调等。 4、缓冲间

功能：进入无菌室前的缓冲场地，减少人体从外界带入的尘埃等污染物。人员在此换上工作服、拖鞋、口罩，才能进入无菌室和培养室。

要求：3-5平方米，在准备室外或无菌操作室外，应保持清洁无菌；备有鞋架和衣帽挂钩。 设备：1-2盏紫外灯对衣物进行灭菌、灭菌工作服、拖鞋、口罩。 （二）辅助实验室

根据研究或生产的需要而配套设置的专门实验室，主要用于细胞学观察和生理生化分析等。

1、细胞学实验室

功能：对培养材料进行细胞学鉴定和研究， 分为制片室和显微观察室。

制片是获取显微观察数据的基础，制片室配备有切片机、磨刀机、温箱及样品处理和切片染色设备，通风橱和废液处理设施。

显微观察室主要有显微镜和图像拍摄、处理设备。 要求：明亮、清洁、干燥、防止潮湿和灰尘污染。 2、生化分析实验室

培养细胞产物为主要目的实验室，应建立相应的分析化验实验室，随时对培养物成分进行取样检查。大型次生代谢物生产，还需有效分离实验室。

第二节 仪器设备和器皿用具

一、基本设备配置

（一）常规设备 1、天平

植物组织培养实验室需要不同精度的天平。

感量0.001g的天平（分析天平）和感量0.0001g的天平（电子天平）用于称量微量元素

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和一些较高精确度的实验用品。

感量0.01g和0.1g的天平，用于大量元素母液配制和一些用量较大的药品的称量。 2、冰箱

各种维生素和激素类药品以及培养基母液均需低温报存，某些试验还需植物材料进行低温处理，普通冰箱即可。 3、酸度计

用于测定培养基及其它溶液的pH，一般要求可测定pH范围1-14之间，精度0.01即可。 4、离心机

用于细胞、原生质体等活细胞分离，亦用于培养细胞的细胞器、核酸以及蛋白质的分离提取。根据分离物质不同配置不同类型的离心机。

细胞、原生质体等活细胞的分离用低速离心机；核酸、蛋白质分离用高速冷冻离心机；规模化生产次生产物，还需选择大型离心分离系统。 5、加热器

用于培养基的配制。研究性实验室一般选用带磁力搅拌功能的加热器，规模化大型实验室用大功率加热和电动搅拌系统。 6、其它 纯水器、分装设备

（二）灭菌设备

维持相对的无菌环境是植物组织培养实验室的基本要求。 1、高压灭菌锅

用于培养基、玻璃器皿以及其它可高温灭菌用品的灭菌，根据规模大小有手提式、立式、卧式等不同规格。 2、干热消毒柜

用于金属工具如镊子、剪刀、解剖刀，以及玻璃器皿的灭菌。一般选用200℃左右的普通或远红外消毒柜。 3、过滤灭菌器

用于一些酶制剂、激素以及某些维生素等不能高压灭菌试剂的灭菌，主要有真空抽滤式和注射器式。 4、紫外灯

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方便经济的控制无菌环境的装置，缓冲间、接种室和培养室必备。

（三）无菌操作设备

1、接种箱

使用较早的最简单的无菌装置，主体为玻璃箱罩、入口有袖罩，内装紫外灯和日光灯，使用时对无菌室要求较高。 2、净化工作台

其操作台面是半开放区，具方便、操作舒适优点，通过过滤的空气连续不断吹出，大于0.03um直径的微生物很难在工作台的操作空间停留，保持了较好的无菌环境。由于过滤器吸附微生物，使用一段时间后过滤网易堵塞，因此应定期更换。

（四）培养设备

指根据需要所选用的不同规格和控制精度的用于植物细胞、组织和器官培养的设施和设备。 1、培养架

目前植物组织培养实验室植株繁殖培养的通用设施。成本低、设计灵活、充分利用培养空间。一般有4-5层，层间间隔40-50cm，光照强度可根据培养植物特性来确定，一般每架上配备2-4盏日光灯。 2、培养箱

细胞培养、原生质体培养等要求精确培养的实验，可用光照培养箱、CO2培养箱、湿度控制培养箱等培养。

3、摇床：进行液体培养时，为改善通气状况，可用振荡培养箱或摇床。 4、生物反应器：进行植物细胞生产次生产物的实验室，还需生物反应器。

（五）其他设备

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时间程序控制器、温度控制系统或空调、实体显微镜、倒置式生物显微镜及配套的摄影、录像和图像处理设备、电泳仪、萃取和层析设备、紫外分光光度计、高效液相色谱仪、气相

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色谱仪、酶联免疫测定系统。

二、培养容器与用具

（一）培养容器：包括各种规格的培养皿、三角瓶、试管、培养瓶。一般分为： 玻璃容器—一般用无色并不产生颜色折射的硼硅酸盐玻璃材质。

塑料容器—材质轻、不易破碎、制作方便，广泛使用。一般为聚丙烯、聚碳酸酯材料的培养容器

（二）金属用具

1、镊子：植物组织解剖用小的尖头镊子，分株转移繁殖转接用枪型镊子，16-22cm长。 2、剪刀：不锈钢医用弯头剪，做取材和切段转移繁殖，14-22cm长。 3、解剖刀：进行组织切段，多用短柄可换刀片的医用不锈钢解剖刀。 4、其他用具：接种铲、接种针在花药培养、花粉培养中有用。

三）塑料用具：各种封口膜、盖、塑料盘及其它实验用具。

第三节：基本操作 一、洗涤

（一）重铬酸钾洗涤法

饱和重铬酸钾洗液的配制方法是：将43g重铬酸钾溶与1000ml蒸馏水（20℃可以达到饱和状态），制成重铬酸钾饱和水溶液。然后缓慢加入浓硫酸，最后使重铬酸钾饱和水溶液以浓硫酸比例达到1：1。在配制过程中，只能把浓硫酸缓慢加入进去，决不可把重铬酸钾水溶液加入浓硫酸中，因会产生大量热量而来不及扩散，从而引起浓硫酸溅出。 洗涤方法：

一般用具：用水洗净玻璃器皿，晾干后放入重铬酸钾洗涤液中，浸泡1夜，第二天取出，用自来水冲洗，然后用蒸馏水洗两次。干燥后备用。 小的玻璃制品法：

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吸管：先用自来水冲洗，放在特制的防腐不锈钢网筒内，用重铬酸钾浸泡一夜，再将网筒放入虹吸式自动冲洗装置中，用自来水冲洗数十次，最后用蒸馏水冲洗，干燥后备用。 （二）洗涤剂洗净法

重铬酸钾洗液的最大缺点是铬离子会造成环境污染，因此，应尽量避免使用。 普通无磷中性洗涤剂，是理想的选择。 （三）超声波洗净法

这是一种物理的洗净法，对环境无任何污染，而且对比较顽固的污垢也十分有效，但超声波发生器容量有限，因此，常用来清洗较小的玻璃仪器和器械。

方法：将玻璃制品放入超声波洗净器中，注入自来水，设定时间，然后进行处理，拿出用自来水冲净，蒸馏水冲洗。 （四）玻璃器皿的清洗

新购置的玻璃器皿：带有游离的碱性物质，先用1%的稀盐酸浸泡1夜，再用肥皂水洗净，清水冲洗，蒸馏水冲淋，烘干。

已用过的培养器皿：去掉培养基，洗涤剂溶液浸泡，刷子刷洗，自来水冲洗，蒸馏水冲洗。 较脏的玻璃器皿：洗衣粉或洗洁精刷洗，冲净，浸入洗涤液中，按 上面方法洗涤，浸泡时间根据脏的程度定。

被污染的玻璃器皿：121高压蒸汽灭菌后，用洗涤剂刷掉污染物，冲洗，重铬酸钾洗涤液浸泡，2h后取出，自来水冲洗，蒸馏水冲淋。

用过的吸管或滴管：在洗涤液中浸泡2h以上，取出冲洗干净。 洗净后的玻璃器皿应透明发亮，内外壁水膜均匀，不挂水珠。

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第二章 植物组织培养的基本原理

植物细胞全能性理论是植物组织培养的核心理论。

离体细胞具有生命的特征属性，在全能性的基础上，提供合适的营养和环境条件，离体细胞经历脱分化和再分化过程

第一节：植物细胞全能性和细胞分化

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植物细胞的全能性（totipotent)：植物细胞具有该植物体全部遗传的可能性，在一定条件下具有发育成完整植物体的潜在能力。

原理：生物体的每一个细胞都包含有该物种所特有的全套遗传物质，都有发育成为完整个体所必需的全部基因，从理论上讲，生物体的每一个活细胞都应该具有全能性。

差异：（1） 受精卵的全能性最高 （2） 受精卵分化后的细胞中，体细胞的全能性比生殖细胞的低。

潜在全能性的原因：基因表达的选择性

科学研究表明，处于离体状态的植物活细胞，在一定的营养物质、激素和其他外界条件的作用下，就可能表现出全能性，发育成完整的植株。 人工条件下实现的这一过程，就是植物组织培养。

分化：植物体各个部分出现异质性的现象，可以在细胞水平、组织水平或器官水平上表现出来。

细胞分化：导致细胞形成不同结构，引起功能改变或潜在的发育方式改变的过程。 细胞分化是组织分化和器官分化的基础，是离体培养再分化和植株再生得以实现的基础。

第二节：离体条件下植物器官的发生

脱分化（dedifferentiation)：将来自已分化组织的已停止分裂的细胞从植物体部分的抑制性影响下解脱出来，恢复细胞的分裂活性。

再分化（redifferentiation):离体培养的植物细胞和组织可以由脱分化状态重新进行分化，形成另一种或几种类型的细胞、组织、器官，甚至形成完整植株，这个过程称为再分化。 一、脱分化和再分化

类型：（1）细胞水平的再分化 （2）组织水平的再分化（3）器官水平的再分化：器官型和器官发生型（4）植株再生：先芽后根、先根后芽、芽根同时 二、影响细胞脱分化和再分化的因素 （一）影响细胞脱分化的因素

1、损伤2、生长调节剂3、光照 4、细胞位置5、外植体的生理状态6、植物种类差异 （二）影响细胞再分化的因素 因素：（同上）

原因：1、不同植物种类再分化能力差异很大2、对某些植物的植物再生条件还没有完

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全掌握

三 愈伤组织培养

（一）愈伤组织形成、生长和保持 1、愈伤组织的形成

在脱分化过程中，大多数情况下形成愈伤组织。愈伤组织的结构往往是异质的，无明显极性，其形成过程可分为诱导期、分裂期和分化期。

1）诱导期（启动期）：是愈伤组织形成的起点。 是指细胞准备进行分裂的时期。 2）分裂期：外植体的外层细胞出现了分裂，中间细胞常不分裂，故形成一个小芯。由于外层细胞迅速分裂使得这些细胞的体积缩小并逐渐恢复到分生组织状态，细胞进行脱分化。 特征：细胞分裂快，结构疏松，缺少有组织的结构，颜色浅而透明。

3）分化期：停止分裂的细胞发生生理代谢变化而形成由不同形态和功能的细胞组成的愈伤组织，在细胞分裂末期，细胞内开始发生一系列形态和生理变化，导致细胞在形态和生理功能上的分化，出现形态和功能各异的细胞。 2、愈伤组织的生长

诱导期后，外植体外层细胞开始出现分裂，在组织受伤表面形成一种创伤形成层，愈伤组织的细胞数目迅速增多。

愈伤组织在生长过程中的生理生化变化：

1）在诱导期和分裂始期，每个分裂细胞中的RNA含量迅速增加，并达到一个高峰，但在继续分裂的过程中，RNA的含量减少。2）同工酶谱发生变化。3）连续继代培养可能改变次生物质的积累水平或能力。4）延长培养期可能使愈伤组织对生长素的需求发生变化，导致生长素的自给和自养，出现驯化现象.

愈伤组织的质地明显不同，有松脆和致密两种类型，但它们之间是可以相互转变的。 一般加入较高浓度生长素，可使致密的愈伤组织变的松脆；而降低或去除生长素或加入高浓度的细胞分裂素，往往使愈伤组织变的致密。 3、愈伤组织的保持

大多数情况下，随继代培养代数的增加和培养时间的延长，愈伤组织表现出生长势下降、褐变、分化和形态发生能力逐渐降低甚至死亡或形态发生能力完全丧失。

这种情况的发生主要是遗传和生理因素所致。前者包括染色体畸变、基因突变等；后者是细胞或组织内激素平衡的改变或细胞对外源生长物质的敏感性的改变。因生理因素导致的形态发生能力下降可通过改变培养条件而得以改善。

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由愈伤组织再分化的形态发生方式也有体细胞胚胎发生和器官发生两种，后者具体包括:先芽后根；先根后芽；在愈伤组织不同部位形成芽和根，然后芽、根的维管束接通形成完整植株；仅形成芽或根。

第三节 植物体细胞胚胎发生

体细胞胚胎发生：植物离体培养细胞产生胚状体的过程。

一、植物体细胞胚胎发生过程

（一）体细胞胚胎发生过程

不同种类的植物体细胞胚胎发生的主要发育阶段的划分是不一致的，但一般可分为胚性愈伤组织诱导、体细胞胚胎诱导、体细胞胚胎早期分化发育、体细胞胚胎成熟、体细胞胚胎萌发和成苗五个阶段。

在双子叶植物上，体细胞胚胎发生经过原胚、球形胚、心形胚、鱼雷形胚和成熟胚阶段。 在禾本科植物的成熟体细胞胚上，可以清楚看到胚特有的结构，即盾片、胚芽鞘和胚根等。

（二）胚性和非胚性细胞或愈伤组织生理状态的差异

胚性细胞与分生组织类似，通常较小，近圆形，具有较大的核和核仁并能高度染色，胞质浓厚。

典型的胚性愈伤组织外表呈松脆颗粒状。与非胚性细胞或愈伤组织组织相比，DNA、RNA以及蛋白质的合成更为活跃，表现为含量和种类的增加、淀粉和可溶性糖含量增加、内源多胺含量升高、活性氧水平提高、同工酶谱和内源激素合成有明显变化等。 （三）体细胞胚胎发生的基因表达机理（略）

二、植物体细胞胚胎发生途径

（一）体细胞胚胎发生的方式

由外植体诱导体细胞胚胎发生的途径有两种：直接途径和间接途径。

直接途径：从外植体某些部位的胚性细胞直接诱导分化出体细胞胚胎。这种“胚性细胞”

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是在胚胎发生之前就已决定了的。

间接途径：外植体先脱分化形成愈伤组织，在从愈伤组织的某些细胞，即重新决定为胚性细胞的细胞分化出体细胞胚胎，多数体细胞胚胎的形成是通过间接途径产生的。 分两个阶段完成：

1）胚胎发生丛（EC）的形成:愈伤组织中常含有两种类型的细胞，一种具有大液泡的细胞，通常失去胚胎发生潜能，在培养基中易散开；另一种液泡小、细胞质浓的小细胞，这种小细胞聚集为丛状。被称为EC。EC表面是高度分生组织化的细胞，一个EC表面可产生大量的胚状体。

2）胚状体的发育：EC通常在原培养基上不能使其表面的胚状体发育，但EC可以增殖、崩溃而不衰。EC崩溃是由于EC 中心的细胞增加，并膨胀使EC崩溃，崩溃后分生性的表面细胞结合成群，又形成新的EC。EC在转入降低或去除生长素、降低还原氮的培养基后，才能完成胚状体发育。

（二）体细胞胚胎的起源（略）

三、植物体细胞胚胎发生的极性和生理隔离

体细胞胚胎具有两个明显特点： 1、双极性

2、与母体组织或外植体的维管束系统无直接联系，处于较为孤立的状态，即存在生理隔离。 （一）体细胞胚胎发生的极性

单个胚性细胞与合子胚一样，具有明显的极性，第一次分裂多为不均等分裂，顶细胞继续分裂形成多细胞原胚，基细胞进行少数几次分裂形成胚柄。 （二）体细胞胚胎发生的生理隔离

被子植物的胚囊减数分裂后，形成的大孢子与周围细胞处于分开的状态。在小孢子发生时，小孢子母细胞在减数分裂前期也与绒毡层的细胞间没有联系。

在多数植物中都观察到，早期的胚性细胞与周围细胞还存在胞间连丝，但随着胚性细胞的发育，细胞壁加厚，胞间连丝消失或被堵塞。胚性细胞开始分裂，从二细胞原胚到多细胞原胚始终被厚壁包围，与周围细胞形成明显的界限。

第四节、影响植物离体形态发生的因素

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植物离体培养中，外植体的基因型和生理状态、培养基、培养条件等是影响离体形态发生的主要因素。

一、植物种类和基因型

不同物种和同一物种不同基因型，其形态发生能力往往有巨大差异。

二、培养材料的生理状态

1、植物的发育年龄 2、培养器官或组织类型：

1）种子、幼胚和下胚轴易形成胚状体，茎段、叶片比较困难；双子叶植物形态发生常用的外植体依次为叶、茎、胚轴、子叶等；单子叶植物特别是禾本科植物，细胞分裂旺盛的分生组织或器官，如叶基部、茎尖、幼胚、胚珠、幼花序轴等是极好的外植体。

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2）同一器官不同部位的组织，其再生器官能力也不同。3）外 植体的大小对器官再生有影响。4）不同季节来源的外植体，其形态发生的能力也有差异。 5）供体植物的生长环境也影响外植体的生理状态。 3、培养时间和细胞倍性：

愈伤组织培养时间过长或继代培养次数太多，往往会推迟或降低形态发生的能力，所以一般均取处于旺盛生长期的愈伤组织材料来诱导器官的形成。但是对于某些植物的胚状体发生，往往需要愈伤组织培养较长时间或多次继代培养。

细胞倍性也影响形态发生能力。高渗透压条件下，容易启动花粉粒单倍性细胞生长和分化，容易得到花粉胚状体，而花药壁来源的二倍体细胞的生长和分化都受到明显抑制。

三、培养基

1、植物营养

1）一般认为，培养基中的铵态氮和K+有利于胚状体形成，提高无机磷的含量可促进器官发生，不加还原氮有利于根的形成等。

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用于茎尖培养和芽诱导的培养基主要是MS及其修改的配方和B5培养基。 2）碳水化合物种类及浓度对体胚发育有重要作用，缺糖或低糖常无法形成胚状体。 3）其他物质如氨基酸、天然复合物常不同程度地促进器官和胚状体发生。

2、物理性质：固态或液态、渗透压以及PH等，对器官或胚状体的形成及发育也有明显影响。 3、植物生长调节剂

植物生长调节剂是影响植物离体形态发生的最关键因素。

1）生长素：植物离体形态发生过程中，生长素促进外植体生长、生根，并与细胞分裂素共同作用诱导不定芽分化及侧芽的萌发与生长。

由于植物外植体中原来有的内源激素种类和浓度不同，需添加的激素种类及浓度也就不同。有些外植体诱导芽或无根苗形成时，需补加一定量的生长素，或与分裂素一起补加才显出作用。

3、植物生长调节剂

2）细胞分裂素：促进分化和芽形成，抑制根发育与衰老。分裂素可促进也可抑制体胚发生，这主要取决于植物的种类及基因型。

3）赤霉素：促进茎的伸长，打破休眠，对芽的诱导和形成有促进作用。 4）乙烯：对芽的诱导和形成有促进或抑制作用，这与植物种类及处理时间有关。 5）脱落酸：增强胚性愈伤组织的形成和体胚发生，防止畸形胚形成，抑制体胚过早萌发，促进胚中贮藏成分。

四、培养条件 1、光

1）光照强度：不同植物及不同材料对光照强度要求不同。一般情况下，植物所需的光照强度为1000-5000lx。光照强度对培养物的增殖、器官分化、胚状体形成都有重大影响。 2）光照长度：一般情况下，植物每日所需的光照时间为10-16小时。

3）光质：不同波长的光对细胞分裂和器官分化有影响。对苗再生最有利的光谱是蓝光区，根的发生则是红光区较有利。 2、温度

不同植物要求的最适温度不同。一般园艺植物的生长适温为：文竹17℃，百合20℃，杜鹃25℃，石刁柏26℃，月季25-27℃，葡萄28℃，番茄28℃。

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植物愈伤组织的培养

愈伤组织培养是指将母体植株上的各个部分切下，形成外植体，接种到无菌的培养基上，进行愈伤组织诱导、生长和发育的一门技术。

一般情况下，植物组织均能诱发形成愈伤组织，由外植体形成愈伤组织，标志着植物离体培养的开始。

一 愈伤组织的诱导

（一）诱导原理

1、细胞全能性

植物每一细胞具有全套遗传信息，在特定环境下能进行表达，而产生一个独立完整的个体。 只要有一个完整的膜系统和一个有生命力的核，即使已经是高度分化的植物细胞，也还保持恢复到分生状态的能力。其恢复能力取决于该细胞原来所处的部位和生理状态。 2、脱分化现象

一个已经停止分裂的成熟细胞转变为分生状态，并形成未分化的愈伤组织的现象。 植物离体培养中的脱分化过程:植物离体培养利用特定的条件，促进细胞脱分化，使原已分化并具有一定功能的细胞脱离原轨道，失去其原有状态和功能，而恢复到未分化的愈伤组织状态。 3、诱导程度

双子叶植物比单子叶植物容易 幼年细胞组织比成年细胞组织容易 二倍体细胞比单倍体细胞容易

（二）诱导方法

1、根据不同的培养目的，获取不同的外植体。

植株茎的切段、叶、根、花和种子，或某些组织切成片或块状，均可接种到培养基上。 接种时需考虑材料的一致性，来源、产地、大小、形状、生理部位。常选组织块较大的材料。 2、操作程序

获取外植体材料－消毒处理－修整除去坏死组织－切成5mm的圆柱形或方形小块－直放或

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