2010自考农学类串讲新中国农村改革的历程及经验

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长春中医药大学实验室开放

真菌多糖对环磷酰胺抑制小鼠免疫功能的影响 实验人数 组 数 综合 实验项目 面向专业、年级 08、09、10级中药、制药、药剂、生物科学、生物制药、生物技术 掌握科研思路、手段，为今后的研究工作奠定基础。 实验类别 实验目的 以环磷酰胺抑制小鼠为研究对象，施与真菌多糖，通过检测T淋巴细实验内容 胞增殖能力、IgG、 RBC-ICRR、RBC-C3BRR、T细胞亚群，评价真菌多糖对环磷酰胺抑制小鼠免疫功能的影响. 主要使用 酶标仪、CO2培养箱、恒温恒湿培养箱、显微镜、离心机 仪器设备 开放时间 房间号 指导教师 实验技术人员

一．实验分组、给药：设正常对照组、环磷酰胺组（模型组）、多糖组，以上各组分别给生理盐水、环磷酰

胺、环磷酰胺+真菌多糖。（每组小鼠15只）给药时间：共2W 取材检测时间：4月21、28、5月5日

二．红细胞C3b受体花环及免疫复合物花环试验 操作方法 ：

（1）先将EP管中加入肝素，加入量0.1ml肝素/1ml血液（血液60ul，用微量加样器加肝素6ul）加到EP管的底部。

（2）用左手抓住鼠，拇指和食指尽量将鼠头部皮肤捏紧，使鼠眼球突出。右手取一无钩的眼科弯镊，在鼠右侧眼球根部将眼球摘取，将鼠倒置，头向下，用EP管接取血液大约3滴，迅速震摇。

（3）制备待测红细胞悬液：将肝素抗凝的指血或静脉血用生理盐水洗涤离心3次，2000r/min离心3～5min，计数后配成1.25×107/ml 红细胞悬液备用；

（4）制备酵母菌悬液:将细菌接种沙保培养基，培养16小时后，取菌制备酵母菌悬液。 （5）分离小鼠血清：取小鼠全血，置试管，2500r/min离心10min，分离血清。

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2012年4-5月 动物室、207 郭焱 顾红缨 实验室名称 实验室类别（教学、科研） 教学 16 16 实验学时 实验学时 （6）制备补体致敏的酵母菌试剂:将酵母菌培养皿放入生理盐水小心的将酵母菌落溶解，转移到一次性的试管中用生理盐水洗涤3次后，去出小量的酵母菌放到天平中称量，用差量法称取1g的酵母菌，然后加入100ml的蒸馏水，配成1％悬液，置水浴内煮沸20min，充分混匀。用二层定性滤纸过滤，除去小凝块，在低倍镜下呈单个酵母菌细胞分散状态。测出酵母菌也的体积加等量小白鼠血清，混匀后置37℃水浴致敏15min。用生理盐水洗涤一次，2500r/min离心10min。去尽上清，用生理盐水重混悬。计数后配成1×108/ml补体C3b致敏的酵母菌悬液。 （7）配备瑞氏染液

（8）取两支小试管，每管加待测红细胞悬液100ｕl，第一管再加补体致敏酵母菌悬液100ｕl，第二管加未致敏的酵母菌悬液100ｕl，摇匀放37℃水浴30min； （9）取出用手腕轻轻摇匀，加生理盐水200ｕl； （10）混匀后，再加0.25％戊二醛75μl并轻轻混匀；

（11）取载玻片用玻璃笔在上面画一个圆形。将要图涂的试液滴到中间。 （12）分别取1/3量水平涂片、吹干、加甲醇固定；

（13）用瑞氏法染液滴到上面1min然后加PBS稀释液4分钟然后将器洗掉， （14）油镜下计数。涂片染色后RBC为红色，酵母菌为蓝色；

（15） 分别计数200个红细胞，算出花环阳性细胞百分率。第一管为RBC-C3b受体花环率，第二管为RBC-IC花环率。 三．淋巴细胞转化试验 操作方法 ： 1.制备脾细胞悬液：

①取小鼠，摘眼球取血处死（脱颈），暴露腹腔，无菌取脾。

②将脾放入无菌平皿中，毛玻璃片研碎后，以5mlHanks液冲入无菌平皿中。 ③将16层纱布块置脾细胞悬液上面，以无菌滴管在此进行脾细胞悬液的过滤抽吸。 ④将吸入滴管中的脾细胞悬液置于无菌小试管中。在天平上，两两管对称配平后，

放入离心机中进行离心沉淀洗涤（1500rpm，20min）。

⑤取出后，弃掉上清液，加入3mlIMDM培养液。混合均匀后，以无菌刻度滴管吸

出0.2ml脾细胞悬液放入1.8ml细胞稀释液中。

⑥在显微镜下，（10×）计数脾细胞。（细胞数×104×稀释倍数）。用IMDM调整细

胞浓度为1×106/ml。 2.加板：

对照孔：100μl脾细胞+100μlIMDM

实验1孔：100μl脾细胞+100μlConA 20ug/ml 实验2孔：100μl脾细胞+100μlLPS 10ug/ml

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3.孵育42小时（37℃，CO2培养箱）

4.取出后，加入MTT5mg/ml，每孔10μl，继续放CO2孵育箱6小时。

5.每孔取出100μl上清，加入100μl二甲基亚砜（每孔）。充分震荡后，37℃孵育1小时。 6.用酶标仪在570nm波长下测OD值，计算结果。

SI（刺激指标）=OD加样孔/OD对照孔

7.分析总结：

四．外周血IgG的检测

1.分离血清：选取状态良好的健康小鼠10只，眼球取血0.6 ml,3000 r/min,离心30分钟分离血清,放置- 20 ℃冰箱保存。酶联免疫法( ELISA),168-1000型酶标仪测定[8，9]。 2．准备试剂

1）洗涤液：用双蒸水l：30稀释；

2）标准品配制：使用前每管中加入100μl双蒸水，充分溶解后使用。 3．操作方法：

1）建立标准曲线：在酶标包被板撒谎那个设标准孔10孔，在第一、第二孔中分别加标准品100μl，然后在第一、第二孔中加标准稀释液50μl，混匀；然后在第一、第二孔中各取100μl分别加到第三、第四孔中，先取50μl弃掉，再各取50μl分别加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分别加标准稀释液 50μl，混匀；混匀后从第五、第六孔中各取50μl分别加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分别加标准稀释液50μl，混匀后从第七、第八孔中分别取50μl加到第九、第十孔中，再在第九、第十孔中分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第九、第十孔中各取50μl弃掉。（稀释后各孔加样量都为50μl，浓度分别为480ng/L 320 ng/L 160 ng/L 80 ng/L 40 ng/L）

2）加样：分别设空白孔（空白对照孔吧加样品及酶标试剂，其余各步操作相同），待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5倍）。将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。 3）温育：用封板膜封板后置37℃温育30min。

4）配液：将30（48T的20倍）倍浓缩洗涤液用蒸馏水30（48T的20倍）倍稀释后备用。 5）洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，放置30s后弃去，如此重复5次，拍干。

6）加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。 7）温育：操作同3。 8）洗涤：操作同5。

9）显色：每孔先加入显色剂A 50μl，再加显色剂B 50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15min。

10）终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立即转为黄色）。

11）测定：以空白空凋零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。测定应加在

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终止液后15min以内进行。 4．结果计算与判断

所有0D值均减去空白对照孔的值后计算；以标准品的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上汇出标准曲线，根据样品的OD值用标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或者用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程，将样品的OD值代入方程式，计算出样品的浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。

五．脾脏T细胞亚群的检测

分离脾细胞, 用淋巴细胞分层液分离,然后调整细胞浓度为1×106 个/ mL, 分别加到3个试管中,其中1管为空白对照管, 其余两管分别加单克隆抗体,孵育30 min, 用Hanks 液洗3 遍, 加入FITC标记IgG,孵育30 min, 用Hanks 洗三遍,荧光显微镜下计数荧光细胞, 计算荧光细胞百分率。

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