土壤酶活性测定的实验步骤

土壤酶的测定

1． 三角瓶用稀HNO3（3-5%）或用洗衣粉浸泡24h，后刷洗，然后再用蒸馏水润洗，晾干。 2． 土样研磨精细后分袋装好。土量需2g+2.5g+5g+5g=14.5g ，重复一次，14.5×2=29g。

一、过氧化氢酶（容量法）（关松荫P323）

1．试剂配制：

(1)0.3%过氧化氢溶液：

①（1：100 30%的H2O2和水） ②（0.5molH2O2+49.5ml蒸馏水） ③（1ml30% H2O2+99ml蒸馏水） (2)3N硫酸：（10ml硫酸+50ml水） (3)0.1N高锰酸钾溶液 ：（1.58gKMnO4+100ml蒸馏水）

2．操作步骤：

2g风干土置100三角烧瓶→注入40ml蒸馏水和5ml 0.3%过氧化氢（现配）→在往复式振荡机上振荡20min→加入5ml3N硫酸（以稳定未分解的H2O2）→用慢速型滤纸过滤，→吸取25ml滤液，用0.1N高锰酸钾的滴定至淡粉红色

3．结果计算

过氧化氢酶的活性（M），以20min后1g土壤的0.1N KMnO4的毫升数表示： M=（A－B）×T 式中：

A：空白消耗的0.1N KMnO4 毫升数

B：滤液消耗的0.1 N KMnO4 毫升数 T：KMnO4滴定度的校正值

备注：

以容量法测H2O2的酶活：Kappen（1913）首先介绍硫酸存在下用高锰酸钾滴定剩余的过氧化氢测定酶活。此法根据H2O2与土壤相互作用时，未分解的H2O2的数量用容量法（常用高锰酸钾滴定未分解的H2O2）测定H2O2的酶活 2 KMnO4＋5H2O2＋3H2SO4→2MnSO4＋K2SO4＋8H2O＋5O2

土壤H2O2酶促过氧化氢的分解有利于防止它对生物体的毒害作用

二、蔗糖酶（P278）滴定法

1.试剂配制：

(1)20％蔗糖：（20g蔗糖＋80ml水或12.5g蔗糖＋50ml水） (2)甲苯(分析纯)

(3)PH5.5醋酸盐－磷酸盐缓冲液

0.5ml磷酸氢二钠·12 H2O(1/15M) + 9.5ml 磷酸二氢钾（1/15M）

磷酸氢二钠·12H2O(1/15M) ：23.88g Na2HPO4,，加H2O溶解，定容至100ml。 磷酸二氢钾（1/15M）：9.072g KH2PO4，加H2O溶解，定容至1000ml。 (4)33%KI溶液（4.925g+10ml水）现配，冰箱遮光 (5) H2SO4（1：3）（体积比）：15ml 98%H2SO4 + 45ml蒸馏水 (6)淀粉指示剂

取0.5g淀粉溶于少许水中，加10ml煮沸的2.5%NaCl液煮沸1min。 （2.5%NaCl：2.5g NaCl加97.5ml蒸馏水。） (7)0.1NNaS2O3 滴定液

取25克-----溶解于刚煮沸而冷却的蒸馏水中，加入少量的碳酸钠，稀释至1升。 (8)菲林溶液

取3.464克CuSO4· 5H2O溶于蒸馏水，并稀释至50ml（a）,取17.3g酒石酸钾钠和5gNaOH溶于蒸馏水，并稀释至50ml（b），使用前将（a）（b）按1：1混合。

2.操作步骤

取2.5g土置于100ml三角瓶→用0.375ml甲苯处理15min。加2.5ml 20％蔗糖和2.5mlPH5.5醋酸铅－磷酸盐缓冲液摇匀后放在37度恒温箱中培养24h。

培养结束后，加12.5ml蒸馏水。

摇荡后过滤，取5ml的滤液移入100ml三角瓶中，加2.5ml的菲林溶液，在沸水浴上放置10min，冷却至室温后，再加0.75ml 33%KI溶液和1ml H2SO4（1：3）。加入淀粉指示剂2滴，然后用0.1NNaS2O3 滴定。

颜色：棕色→棕蓝色→乳白色（滴定结束）

注意：减量滴定，一般取5ml即可，滴定需NaS2O3溶液（大量） 空白对照：30.15ml（取5ml时）

3． 结果计算：

蔗糖酶活性（M），用对照与试验的0.1NNaS2O3滴定量毫升数之差表示。试验应设以水20毫升代替基质。

M=（A－B）×T×17.875/5/2.5 式中：

A：对照所消耗的0.1NNaS2O3 毫升数 B：滤液所消耗的0.1NNaS2O3毫升数 T：NaS2O3 滴定度的校正值

×17.875/5/2.5：换算成1g 土消耗的0.1NNaS2O3 量

三、脲酶

1.试剂配制

(1)PH=6.7柠檬酸盐缓冲液

取3.68g柠檬酸溶液于6ml蒸馏水中，另取2.95g氢氧化钾溶于水，再将两种溶液合并，用1N氢氧化钠将PH调至6.7，并将水稀释至20ml 。 (2)苯酚钠溶液

称62.5g苯酚溶于少量乙醇中，加2ml甲醇和18.5ml丙酮，然后用乙醇稀释至100ml（A液），存于冰箱中。

称27gNaOH溶于100ml水中（B液），存于冰箱中。

使用前，取A,B两液各20ml混合，并用蒸馏水稀释至100ml备用。 (3)次氯酸钠溶液

用水稀释制剂，至活性氯的浓度为0.9%，溶液稳定。 （17.3mlNaClO定容至100ml）。 (4)10%尿素液

10g尿素＋90ml水 50g尿素＋450ml水

(5)甲苯

(6)氮的标准溶液（不要配）

精确称取0.4717g硫酸铵溶于水并稀释至1000ml，则得1ml含0.1mg氮的标准液。绘制氮的标准曲线时，可将此液稀释10倍供用。

2.操作步骤

取5g风干土，至于50ml三角瓶中，加1ml甲苯。15min加10ml 10%尿素液和20mlPH6.7柠檬酸缓冲液。摇匀后在37℃恒温箱中培养24h。

过滤后取3ml滤液注入50ml锥形瓶中，然后加蒸馏水20ml，再加4ml苯酚钠溶液和3ml次氯酸钠溶液，边加边摇匀。

20min后显色，定容50ml：1h内在分光光度计上于波长578nm处比色。然后按绘制标准曲线（显色方法）进行比色测定。

3．结果计算：

脲酶活性（M）以24h后1g土壤中NH3－N的毫克数表示 M=x×31/3/5

标准曲线：y=0.0268x+0.001804

即：M=（0.001804-y）×31/3/5/0.0268 式中：

x：从标准曲线查得的NH3－N毫克数 y：578nm处吸光度

×31/3/5：换算成1g土的系数

四、磷酸酶

1.试剂配制

(1)PH=9.8氯化铵－氢氧化钠缓冲液

取20g NaOH溶于100mlNH4OH中 (2)8%铁氰化钾液

称8g铁氰化钾，溶于蒸馏水中稀释至100ml（仅在同一周内存放） (3) 2% 4－氨基安替比林液

取1g 4－氨基安替比林溶于水中，稀释至50ml（仅在同一周内存放） (4)0.5%磷酸苯二钠溶液 取1g溶于200ml水中 (5) 酚的标准溶液（不要配）

酚原溶液的配制及酚工作液的稀释浓度同磷酸苯二钠法

酚原液：取1g重蒸酚溶于水中，稀释至1L存于棕色瓶中

酚工作液：取10ml酚原液稀释至1L（0.01mg/ml酚） (6) 甲苯

标准曲线绘制

吸取1,3,5,7,9,11,13ml酚工作液，分置50ml的容量瓶中，分别加20ml蒸馏水，再加0.25ml缓冲液，0.5ml4－氨基安替比林液，0.5ml铁氰化钾液，每次充分摇动。最后定容至50ml，15min内在分光光度计上于波长510nm处比色。根据光密度值于溶液浓度绘制标准曲线。

50－（20＋2＋0.5＋0.5＋0.25）=26.75ml蒸馏水

2.操作步骤

取5g风干土，至于50ml三角瓶中，加5滴甲苯。20ml 0.5%磷酸苯二钠，充分振荡后在37℃恒温箱中培养2h。

取培养后滤液5ml，分置50ml的锥形瓶中，加20ml蒸馏水，再加0.25ml缓冲液，0.5ml 4－氨基安替比林液，0.5ml铁氰化钾液，每次充分摇动。最后定容至50ml，15min内在分光光度计上于波长510nm处比色。

3．计算

磷酸酶的活性（M），以2h后100g土壤中P2O5的毫克数表示 M＝x×80×0.32×2.29

标准曲线：y=0.002161x-0.000839

即：M=（y+0.000839）×80×0.32×2.29/0.002161 式中：

x：从标准曲线查得5ml滤液中酚的完整数 y：510nm处吸光度

80：换算为100g土壤的余数

0.32：在磷酸苯二钠中，1个重量单位的酚相当于0.32g重量单位的磷 2.29：将P换算为P2O5的系数

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