生物医用材料专题2组织工程材料与人工器官 - - 软组织修复与重建

专题六 组织工程材料与人工器官---软组织修复与重建

组织工程是指用生命科学与工程的原理构建一个生物装置来维护、增进人体细胞和组织的生长，以恢复受损组织或器官的功能。

传统材料如金属、陶瓷、高分子，植入体内存在着磨损、性能下降、安全性等问题；即使是暂时性植入材料，也存在着力学性能匹配、生物相容性、代谢途径等问题。组织工程学的出现，为人们寻找更为理想的体内植入材料开辟了一条新的途径。

器官移植会产生排斥作用，必须服用药物，这样又会破坏人体的免疫平衡，可能导致肿瘤。组织工程给组织器官的替代修复带来了新的曙光。

一、 组织工程的基本原理和方法

组织工程三要素：种子细胞、支架材料、生长信息分子

支架材料：支架为细胞提供一个生存的三维空间，利于细胞获得营养物质，排除废物，支架应为一种有良好生物相容性，可被人体逐步降解吸收的生物材料。 方法简介：提取组织细胞---体外培养---吸附扩增于三维支架材料上---细胞在预先设计的三维支架上生长---细胞/支架复合体植入病损部位---支架材料逐步降解吸收的同时，种植的细胞继续增殖并分泌基质，形成新的组织器官---新生组织器官成熟后，支架降解排出体外。这种具有生命力的活体组织能对病损组织进行重建并永久替代。

二、组织工程材料—软组织修复与重建 1、组织工程材料应具备的条件

(1)材料能够促进组织的生长，使细胞之间能够沟通，并最大限度地获取营养物、生长因子和活性药物分子；

(2)在某些场合能防止细胞激活(如外科手术、防粘连的场合)；

(3)指导和控制组织的反应(促进某一组织反应，抑制其他反应) (4)促进细胞粘附及激活细胞(皮肤修复中成纤维细胞的粘附和增殖) (5)抑制细胞的粘附和激活细胞(防止血小板粘附在血管上)：

(6)防止某一生物反应的攻布(在器官移植中，阻止抗体攻击同种或异种细

胞)。

(7)易于加工成三维多孔支架：

(8)支架要有一定力学强度以支持新生组织的生长，并待成熟后能自行降解； (9)低毒、无毒、可消毒；

(10)能够释放药物或活性物质如生长激素等。

组织工程材料按件质和应用大致分为生物降解材料、组织引导材料、组织诱导材料和组织隔离材料。下面分别介绍一些近年研究的组织工程材料。

2、生物降解材料：生物降解材料通常分为天然生物降解材料与合成生物降解材料。

天然生物降解材料：与细胞的相容性比较好 1)Ⅰ型胶原

胶原是哺乳动物体内结缔组织的主要成分，共有14种， I型最丰富，且性质优良，因此被广泛用作生物医用材料。

胶原的结构、性能和制备已有详细研究。最基本的胶原结构由3股螺旋多肽链结构组成。直径为1～1.5nm，长约3000nm，每条肽链都具有左手螺旋二级结构。胶原分子的两端存在两个小的短链肽，称为端肽，不参与三股螺旋绳状结构。端肽是免疫原性识别点，可通过酶解将其除去。除去端肽的胶原称为不全胶原，可用作生物医学材料。

胶原在应用时必须交联，以控制其物理性质和生物可吸收性。戊二醛和环氧化合物是常用的交联剂。残留的戊二醛会引起生理毒性反应，因此必须注意使交联反应完全。胶原交联以后，酶降解速度显著下降。

在细胞培养中，多数细胞是粘壁依赖性的，欲使细胞生长、分化、生殖和进行代谢，需要有一个结合位点。胶原分子能提供这样的结合点。例如，成纤维细胞在胶原上生长时，代谢和形态与其在体内生长极为相似，因此胶原分子可以作为组织修复的支架材料。此外，胶原基质能促进新组织的生长。Yannas等人用胶原-硫酸软骨素多孔交联的支架成功地制得人工皮肤。这种人工皮肤能治疗严重烧伤的病人。

明胶是经高温加热变性的胶原，通常由动物的骨骼或皮肤经过蒸煮、过滤、蒸发干燥后获得。明胶在冷水中溶胀而不溶解，但可溶于热水中形成粘稠溶液，冷却后冻成凝胶状态。纯化的医用级明胶比胶原成本低，在机械强度要求较低时可以替代胶原用于生物医学领域。

明胶可以制成多种医用制品，如膜、管。明胶溶于热水，在60～80℃水浴中制备浓度为5％～20％的溶液，如果要得到 25％～35％的浓溶液，则需要加热至 90～100℃。为了使制品具有适当的机械性能，可加入甘油或山梨糖醇作为增塑剂。用戊二醛和环氧化合物作交联剂可以延长降解吸收时间。

2)氨基葡聚糖

氨基葡聚糖是几种由双糖重复单位聚合成高分子直链的杂多糖，一般包括一个醛酸部分(己糖醛酸)和一个胺基糖部分(N-乙酰氨基己糖)。这类化合物有硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸乙酰肝素、肝素、硫酸角质素和透明质酸，后者是氨基葡聚糖的主要成分。和胶原相似，透明质酸容易进行化学修饰，使羧基变成酯基，降低亲水性，增加粘度。透明质酸无免疫原性，不产生炎症或免疫排斥反应，因此成为令人感兴趣的生物材料，主要缺点是强度和稳定性较差。

目前，对透明质酸和氨基葡聚糖中其他—些组分作为组织修复的基本原料尚有争论(认为修复作用不大)，但透明质酸易分离和修饰并能制成效硬的骨架，在医疗装置上已获得应用。

3)壳聚糖

壳聚糖是生物合成的多糖。每年海洋产甲壳达10亿吨，是价格低的物质。取向的壳聚糖纤维具有很强的湿拉力(120 MPa)。与透明质酸一样，它不具有免疫原性，因此也是很好的植入材料。壳聚糖是智能性材料，利用它的带电性能可以调节和控制产品的物理和化学性质。用它制成的凝胶、膜、粉和纤维可作为包埋材料、膜屏蔽材料、接触镜、细胞培养抗凝剂及血液抗凝剂。

4)聚羟基烷基酸酯

聚羟基烷基酸酯是生物降解和生物相容的热塑性材料。其代表结构如下：

它是由微生物制成的，随生长条件不同，分子量可由一万到十几万。 ici公司采用菌种糖液发酵成功地制备了聚羟基丁酸，并巳进行生产。羟基丁酸均聚物具有高度结晶性，特别脆，并且是憎水的。它的降解速度以年计算。为改进聚羟基丁酸性质，使之与30％的羟基戊酸共聚，降低产品结晶度，因此结构变得柔顺、易于加工。聚羟基丁酸是低毒材料，在体内降解成D-3羟基丁酸，是人血液的一种成分。这类材料目前已用于药物控释、缝合线和人工皮。

5)发展中的可降解材料

合成生物分子近年来在医药中受到重视。利用多肽化合物和工程菌，合成一些有类似弹性蛋白结构的聚合物。其共聚物己用于肌骨骼修复。这类具有重复多肽结构的蛋白质聚合物是一类新兴的材料。

3、合成生物降解材料

天然降解材料虽然具有某些优良性能，但存在一些不足，如力学强度较差，性能随批次不同有差异。合成降解材料则具有强度高、来源充足、易于加工等优点，被广泛应用于组织工程领域。关于合成降解材料的结构和性能自查资料或另行介绍，本节只从应用角度介绍。

1) 聚羟基乙酸及其共聚物

聚羟基乙酸(也称聚乙交酯)、聚羟基丙酸(也称聚乳酸丙交酯，聚丙交酯)及其共聚物是合成降解聚合物在医药部门应用最广的材料之一。聚羟基乙酸结晶度高、熔点高、溶解度低，是第—个全合成、可降解的缝合线。由于它的亲水性，植入的纤维在2---4周即失去力学强度。为使聚合物具有更好的性质，人们制得了羟基乙酸与乳酸(也称丙交酯)的共聚物。由于共聚体结晶性下降，产物更易降解。一般应用L型聚合物，因为水解产物是自然界中存在的L型乳酸。L型聚合物为部分结晶高分子，有较强的力学性能，常用于制造纤维和矫形装置。关于矫形装置的应用存在一些争论，因植入体后期会引起无菌性炎症反应，这可能与酸性降解产物有关。为了解决这—问题，需寻找比上述聚合物降解更慢而又不释放酸性产物的材料。用不同比例的羟基乙酸与乳酸进行共聚，可调节聚合物的降解速度(从几个星期到数年)。近年来将细胞植入该共聚物的多孔支架，已应用于骨组织的修复。

2)聚ε-己内酯

聚ε-己内酯是一种脂肪酸酯，与聚羟基乙酸或聚乳

酸相比，它的水解或降解速度要低，因此适合做长期植入装置。它的特点是熔点低，只有57℃。聚ε-己内酯无毒，是生物相容性材料，它具有良好的药物通透性，常用于药物释放载体。

3)聚原酸酯和聚酐

聚原酸酯是一族合成降解物，可以水解，用它制成的装置可通过“表面溶蚀”进行降解。它能从表面开始降解，慢慢变成越来越薄的片状物，而不是像一般材料降解成碎块，因此常用于药物控制释放。

4)聚磷腈

聚磷腈是以磷、氮为骨架的无机聚合物。磷-氮骨架水解时形成磷酸和氨盐，同时释放出具有侧链的基团化合物。具有医药用途的聚磷腈带有氨基和活化醇基。聚合物对组织反应很弱。利用微囊化技术可使聚磷腈包埋杂交瘤制备单克隆抗体。它的衍生物具有良好的血液相容性和药物释放作用。（杂交瘤抗体技术的基本原理是通过融合两种细胞而同时保持两者的主要特征。）

5)聚氨基酸

蛋白质是由氯基酸组成的，聚氨基酸作为生物材料有很多优点； ①品种多；②支链能够与小肽、药物或交联剂等连接，制成各种不同性能的产物；③由于聚合物降解成氨基酸，毒性很低，因此可做缝合线、人工皮肤和药物释放载体。但制备聚氨基酸的原料较昂贵，生产时不易操作，使实际应用受到限制。聚氨基酸为肽键连接，与蛋白质类似，具有一定免疫原性，只有少数聚谷氨酸衍生物才能作为植入材料。为解决这一问题，曾制备了—系列“假” 聚氨基酸。所谓“假” 聚氨基酸，是避免氦基酸之间的肽键连接，而改用酯键或脲键将氨基酸连接，这样形成的聚合物性能有较大改进。

4、组织引导材料

组织引导材料主要是引导组织的再生，例如皮肤创伤的修复和神经的再生。

皮肤的修复有时伴随生成大量的疤痕细胞，有时还会产生组织收缩。人体皮肤的愈合是靠纤维蛋白支架。人工制作和研究这种支架是组织工程的任务。利用这种支架可以引导组织的生长，从而控制新生组织或皮肤的质量。 Yannas用以胶原为主的生物高分子制作人工支架，成功地应用于皮肤和神经的修复。他主要研究了胶原和蛋白多糖的接枝共聚物，采用物理和化学的方法控制材料的多孔性及用戊二醛来调控支架的稳定性和吸收性能，并成功地在材料内部制造了线形孔道。这对神经切除的修复十分重要，使被切除10 mm以上的神经可以再生。

5、组织诱导材料

很多细胞和组织的应答反应在体外很难重现，但是生物活性的生物医用材料可以对这些反应起诱导作用，方法是在材料表面连接活性配体，让材料释放生物活性信息分子；或者将细胞贴附在材料表面，并释放生物信息来达到目的。让蛋白质吸附在材料表面，或者把三肽分子固定到材料表面上时，就可以诱导细胞粘附于材料表面。细胞悬浮状态易于死亡，但利用材料的诱导作用将细胞吸附于材料表面，就可以使细胞存活并表现出解毒和合成功能。在对肝细胞进行培养时，由于它的迅速脱分化作用，因而失去肝细胞的某些功能。利用生物材料的诱导作用，可以恢复或延缓肝细胞功能。利用材料的诱导作用也可使内皮细胞在几何形状固定的装置中形成毛细管状物。

利用生物材料释放活性因子或与细胞结合，可以诱导细胞的聚集和应答反应。例如成纤维细胞生长因子的缓慢控释可诱导支架构料内部的血管化以促进细胞移植。

同理，从羟基乙酸和羟基丙酸共聚物中释放骨形态蛋白可诱导骨的生长和

促进骨的修复，将上述原理进一步延伸，例如将细胞植入半透管中中诱导神经修复比不用该细胞效果要好得多。

6、组织隔离材料

组织隔离材料是组织工程材料的另一重要方而。组织的正常应答反应是免疫排斥，很多疾病(如糖尿病)的治疗都与植入细胞免疫隔离有关。当同种或异种细胞植入宿主时，首先遇到的是异体排斥，利用生物材料将细胞与宿主隔离，就可以顺利地解决这一难题。

例如将植入的细胞(如肝细胞)用一个很薄的聚合物半透膜包封起来制成微囊。一方面，半透膜将囊内细胞与外界隔离开，避免了免疫排斥作用；另一方面由于膜的通透性允许小分子营养物或产物自由穿透半透膜。所产生的氨、酚、硫醇等毒物，可通过半透膜进入囊内与正常肝细胞接触达到解毒的效果。生成的产物(细胞代谢物)由囊中排出。具有上述性能的微囊膜材料由海藻酸钙与聚赖氨酸组成。利用这一微囊技术，sun等人将胰岛细胞进行包埋，植入糖尿病动

物体内，成功地使血糖恢复到正常，从而为治疗糖尿病开辟了一个新途径，目前已进入临床前的研究。

根据上述同一原理，可利用中空纤维作为隔离膜包埋肝细胞，挽救肝衰病人的生命。同样用牛嗜铬细胞可以抑制晚期癌症难以控制的疼痛。

隔离膜对解决免疫排斥反应是非常有效的，但存在一些不足。如膜强度需进一步提高、对截留物质选择性不够强，目前只能通过控制膜上孔径大小来隔离不同分子量的物质。

三、组织工程支架的研究与制备方法

组织工程制成的器官常常需要制备一个临时的多孔支架。支架的功能是指导种植的细胞或者迁移到支架周围的细胞生长或增殖。因此支架应该首先是能够使细胞粘附、分化、增殖、迁移的底物。通常选择生物降解材料。天然的胶原或合成的聚α-羟基酸或酸酐都是很好的降解材料。聚α羟基酸如丙交酯-乙交酯共聚体(PLGA)、聚乙交酯(PGA)均为线形非交联聚合物，它们是生物相容性的，这些材料可使某些细胞粘附、增殖、保留分化功能。支架的多孔性是非常重要的，因为它能使细胞迁移或增殖。孔径大小影响细胞的长入和支架的内表而积。较大内表面积的支架可培养更多细胞，为再生器官提供足够的细胞。支架的强度对修复硬组织(如软骨或骨)尤为重要。支架的拉伸强度、不规则的三维几何形状及支架对生物活性物质的释放，都是设计研究中应考虑的重要因素。

聚合物支架的制备和加工质量直接关系到器官功能的优劣。近年来发展了很多制备和加工方法。每一方法均有其特点和优势，但没有一个是通用的，还需研究新的方法以满足不同器官的特殊需要。 以下介绍组织工程支架的几种制备方法：

1)纤维连结法

利用聚合物的溶解或熔融，将聚乳酸／二氯甲烷溶液灌注到聚乙交酯网状纤维上，经热处理后，制成聚乙交酯增强的网状支架。这个方法制成的支架有较好的强度和高比表面积，但无法调节和控制孔隙率。 2)溶剂浇铸和孔隙制取法

将细粉状氯化钠分散到聚乳酸氯仿溶液中，然后在玻璃板上浇铸，溶剂挥发后成膜，用水将氯化钠溶解提取出来，留下孔隙，得到多孔膜。膜的结晶度通过热处理调控。用此法制备膜时可以控制孔隙率(一般大于90％)和孔径，这对制备支架是非常重要的。本法的缺点是只能制作膜材，无法获得三维空间支架（但可以层叠，见下法）。 3)层压膜法

软骨或骨的修复需要三维空间支架。用溶剂浇铸法制成多孔膜后，再将其层压成具有三绝空间的支架，然后按设计的几何形状切割，即按解剖学要求制成可降解的聚乳酸或其共聚物支架。 4)熔融膜压法

熔融膜压法是将聚合物加热熔融后加压制成膜材。

聚乙丙交酯共聚物用熔融膜压法制三维多孔性支架时所用的致孔剂为明胶微球或其他水溶性物质，用水提取致孔剂后可得到多孔性支架。此法可用于聚乙交酯或聚乳酸为原料的支架制备。 5)纤维增强法

设计骨再生支架，首先要设计三维多孔性、形状不规则的聚合物支架；其次要求其具有高强度，能承受受损骨应力，直到长出新骨。聚α羟基酸酯用于骨的矫形，但制成的多孔性材料强度不够好。将羟基磷灰石的短纤维均匀混入聚

合物中可提高强度。但是把无机纤维与有机聚合物混合均匀是非常困难的。可用溶剂浇铸法将羟基磷灰石与致孔剂和聚合物溶液混合均匀。然后将溶剂挥发，制成增强的多孔膜，再经层压形成三维多孔结构。用羟基磷灰石纤维增强的聚合物多孔支架与末增强的材料相比，其抗压强度显著增加。 6)相分离法

支架中引入的活性物质植入人体后进行释放，对组织的生长和细胞的功能都有巨大作用。制造多孔聚乳酸支架时为了使活性物质避免化学、高温的恶劣环境，可采用相分离法。将聚合物溶于溶剂，加入活性分子，冷却后形成液—液相，急冷，固化，再升华除去溶剂，得到含有活性因子的多孔支架。这种方法对小分于药物释放是有效的，但对大分子蛋白还需研究解决通透问题。 7)原位聚合法

上述方法都是在体外预先制成支架，然后植入人体内。有些情况下(如手术进行中)需要修补损伤部位，这时可用原位聚合的方法实现，将单体置于损伤处进行聚合。例如，聚富马酸丙烯酯的线形粘稠液体经与N-乙烯毗咯烷酮交联，可直接固定在骨损伤部位。为了制成多孔固化材料，可以在聚合交联时加入氯化钠，形成的孔道能使组织长入。为了促进骨的生长，可加入β-三磷酸钙或其他骨诱导剂。聚富马酸丙烯酯是生物降解材料，新骨生长后材料逐渐降解，并从体内排出。

组织工程支架的制备工艺是多种多样的。有的支架材料具有多孔性、高强度，有些材料可释放生物活性因子，但目前尚无理想的通用支架。

如何制备高强度聚合物支架，以解决硬组织所承受的应力，同时能释放出蛋白和生长因子，促进细胞生长，是今后研究的课题。发现新型支架材料，发展制备方法，将是开发新一代人工器官的基础。

四、细胞与材料的界面反应 1、细胞与材料界面反应的评价方法

通常是在体外用细胞培养的方法来评价细胞与聚合物界面的反应状况。将细胞置于聚合物表面，在细胞培养条件下测定细胞粘附、扩散、生存、功能、死亡等参数。

1)细胞的粘附和扩散

人体多数细胞是贴壁细胞，生长过程中需贴附于固体表面。在组织工程中细胞的贴壁非常重要，因为贴壁后细胞才能扩散、迁移或分化。很多因素影响细胞贴壁。

最简单的测定方法分三步： ①将细胞分散到聚合物表面； ②进行细胞培养；

③在一定作用力下脱附那些贴附较弱的细胞，最后统计贴壁的细胞数。 2)细胞的迁移

细胞迁移在组织工程中同样是重要的，因为关系到新组织的形成和修复。细胞迁移不易测定，尤其在复杂环境中。在某些特殊条件下，可用种群技术测定细胞的迁移。 3)细胞的聚集

细胞聚集是研究组织形成的重要途径，它可以提高杂化人工器官的功能及植入组织的重建。某些特定技术可以制取细胞聚集体。最近报道，将细胞结合肽接到聚乙二醇上能促进细胞的聚集。用聚集体的形成和动力学来评价细胞与材料界面反应是一个重要的方法。

4)细胞的功能

在组织工程研究中往往希望提高某种细胞的特殊功能，如提高肝细胞的蛋白分泌和解毒功能。在软骨细胞、成骨细胞和成纤维细胞中，生成细胞外间质蛋白是重要的生理现象。提高细胞功能是组织工程非常关注的问题，由于细胞功能与材料有着密切关系，所以用细胞功能优劣可评价细胞与材料的界面反应。

2、材料化学表面对细胞的影响

聚合物表面的化学组成对细胞的贴附和扩散有重要影响。例如，将不同浓度的聚甲基丙烯酸羟乙酯沉积到聚苯乙烯表面，随着沉积量的增多，细胞的贴附能力提高，细胞的扩散也加快，直接影响了细胞的生长和增殖。研究表明，聚合物表面化学组成由苯乙烯变成甲基丙烯酸羟乙酯，由亲油性变为亲水性时，贴附的细胞功能改变了。这一点对组织工程是非常重要的。聚合物表面有亲水基团有利于细胞的贴附和生长。

聚苯乙烯表面常用硫酸或等离子体处理，以增加表面带电基团，从而改善细胞的附着。成纤维细胞、内皮细胞和角膜内皮细胞与聚合物表面的作用都说明了上述规律。有人指出，羟基、羰基等都对细胞的贴附和生长有影响。 目前尚无完整理论来指导或预见聚合物表面性质对不同种类细胞贴附、扩散和生长的影响。聚合物表面性质（如羟基的密度、表面能、成纤维蛋白的吸附量及含水量等）对某些个别细胞的影响已有报道。只有对聚合物表面和本体全面深入了解，才能揭示细胞与材料界面反应的本质。虽然很难观察到界面反应对植入体的影响，但聚合物表面不同官能团对细胞确实存在重要作用。例如巨噬细胞在水凝胶表面形成多核巨大细胞时，巨噬细胞的融合作用随着下面官能团的顺序而下降：

3、降解材料及一般聚合物表面修饰对细胞的影响

聚乙、丙交酯及其共聚物制成的纤维已用于临床研究。软骨细胞在聚乙交酯或聚丙交酯多孔网状支架上能够增殖，并分泌氨基葡聚糖；鼠的肝细胞在聚乙、丙交酯共混聚合物上，能连续5天分泌白蛋白。骨细胞附着在聚磷腈聚合物上，用不同衍生物可调控细胞生长与材料降解速度之间的关系。

一般合成聚合物通过表面修饰可促使细胞粘附，在材料表面吸附一层蛋白，细胞就可以在上面贴附、迁移、生长。

将胶原、短序列氨基酸、多糖、糖酯固定在聚合物表面，能改变材料的表面性能。

某些短肽在细胞表面与受体相联，也能提高细胞的贴附功能。例如，在纤维蛋白中，三肽(精氨酸—甘氨酸—天冬酰氨)能起粘附作用。研究发现，将这个序列的氨基酸固定到聚合物(聚四氟乙烯、聚乙二醇、聚乙烯醇、聚丙交酯)表面，取得了较好的效果。

除了细胞结合多肽，其他生物活性物质(如聚赖氨酸、聚鸟氨酸)，吸附到聚合物表面都能提高材料对细胞的粘附能力。

此外，共价连接的氨基、固定化的多糖，也对细胞有粘附作用。鼠肝细胞能很好地粘附到含有乳糖改性的聚合物表面，而且细胞的功能也提高了。

4、材料物理表面对细胞的影响

植入体微观形态对细胞生长有重要影响。研究表明，多孔性聚合物膜含有小于5微米的孔能促进新细胞的生长。细胞在棱角、沟纹上与在乎面上的表现

是不一样的。多数情况下，细胞沿着纤维或螺纹处取向或迁移，取向程度取决于螺纹深度。聚砜表面具有4平方微米或25平方微米的平台时比有100 平方微米的平台效果要好。因此，人们设计制作了不同大小的“岛屿”，使材料表面有便于细胞贴附的地方(也有某些区域不长细胞)。较大的岛屿(10000平方微米)能促进肝细胞生长，较小的岛屿(1600 平方微米)能提高白蛋白分泌。近年来有人在金的表面自组装了一些分子，比较精确地研究了某一种物质表面对细胞生长的影响。总之，不同形态和组成的表面对细胞的生长有不同的影响。

5、细胞与悬浮聚合物的影响

在组织工程中，有时需要贴壁细胞附着在聚合物微载体上：在人工肝支持装置中，微载体的表面性质对细胞生长具有重要影响。

组织工程另一重要研究领域是将细胞悬浮在微囊里，用囊膜来保护细胞不受抗体的攻击，这一方法己用于人工胰。

如果成膜条件温和，就可以用于细胞的微囊化。界面沉淀和界面聚合是包埋细胞的另一先进技术。中空纤维是当前常用的一种材料，肝细胞在中空纤维中循环，可以发挥肝细胞的解毒和合成蛋白质的功能，是人工肝支持装置的生物反应器。壳聚糖、胶原和海藻酸钠等加到中空纤维内腔中作为细胞的基质，以提高细胞的生长和功能。

总之，细胞与材料表面之间的反应十分复杂，只有深刻了解两者的关系，才能改进现有聚合物，并设计出性能更为优异的新型组织工程材料。

五、组织与细胞的微环境

构建完善的组织工程装置，不仅要研究聚合物材料的性质，还需探讨组织

生长的最佳微环境，给细胞提供一个能够生长、增殖、分化的良好环境。组织生长是复杂的调控过程，涉及一些生长因子和周围的细胞外基质。它们之间的相互作用决定了细胞的定位、迁移和生长，人们认识这种相互作用对于组织工程来说至关重要，因为常要对这些物质进行仿生或模拟，使生物材料界面更好地与细胞相容。生长发育的组织细胞会和一系列不同的调节剂相互作用，每一作用都和特异的受体-配体相联系，这些相互作用可刺激细胞的增殖或死亡。例如，化学变化或细胞外基质梯度的变化会发出信号，让细胞沿着轨道到达某一个区域，然后另外一组信号令细胞停止走动而固定下来。这些终止或辨认细胞的信号是十分复杂的。在造血细胞生长系统里，细胞活素复合物和胞外基质的相互作用是初期发育细胞的固定化信号。在其他发育系统里也同样存在这种细胞-基质-细胞活素之间的相互作用，可见，细胞经过调控最终形成组织是一个复杂的过程。

组织微环境主要涉及三个方面，即：细胞要素、可溶性生长因子、胞外基质。

1、细胞要素

细胞的发育是按照明确的层次进行的。在个体发育中，任何器官细胞都迁移到一个适合组织生长的区域，然后进行快速的增殖和分化。某些有增殖能力的细胞，如骨髓细胞、肝细胞、皮细胞等，都按一定层次进行增殖。例如在造血系统中，不断生成血细胞，在人一生中大约能生成70倍体重的血细胞。这里有一种可再生的细胞，称为干细胞。它除了具有增殖再生能力，还能生成子代细胞。骨细胞的生长是通过细胞之间的胞内信号相互作用进行的。与其他系统一样，胞外信号由细胞活素和胞外基质分子传递到相应的细胞表面受体，从而形成骨组织。

2、可溶性生长因子

可溶性特异生长因子是细胞增殖和分化不可少的物质。它与内分泌激素(如促蛋白合成类固醇或生长激素)不同。内分泌激素主要对细胞功能和组织的形成起重要作用，是调节体内平衡的；可溶性生长因子则指导细胞分化。研究表明，生长因子能诱导或直接作用于基因表达，从而作用于细胞的增殖和分化。

3、胞外基质

胞外基质（ECM）是由蛋白质和糖胺聚糖经化学和物理交联形成的复合物。它的主要成分是胶原、蛋白多糖和一些糖蛋白。研究表明，这些成分对内皮细胞的生长、增殖和分化均有重要影响。在造血细胞的微环境中，胞外基质、可溶性因子(生长素)等都是不可缺少的物质，它们可以保证骨髓中颗粒白细胞占优势，红细胞在脾脏中占优势。胞外基质如纤维结合素、各种胶原和蛋白多糖都能促进生血细胞的增殖。 1)蛋白多糖和糖胺聚糖

蛋白多糖对细胞的增殖和分化起重要作用。在造血系统里，由于蛋白多糖和糖胺聚糖的刺激作用，加快了造血细胞的增殖，从而促进了器官的生长。从骨髓胞外基质中提取的蛋白多糖，能刺激人体前髓细胞分化；从皮肤成纤维细胞的胞外基质中分离出来的蛋白多糖却没有这个功能。对血液前体细胞的研究也发现类似情况，说明这种蛋白的刺激作用有专一性。蛋白多糖还能使生长因子定位，例如在造血细胞增殖过程中，发现有糖胺聚糖结合的生长因子。这个结果表明，胞外基质与生长因子共同作用于某一器官的生长。 2)血小板反应蛋白

血小板反应蛋白是二硫键连接的糖蛋白三聚体，分子量为450000。它的主要功能是促使细胞结合，以及结合胞外基质中的其他的蛋白分子。研究发现，多数细胞均能合成血小板反应蛋白，并分泌到胞外基质中。固定化的血小板反应蛋白不仅能粘附细胞，而且能促进细胞生长并防止癌细胞的攻击。 3)纤维结合素

纤维结合素是球形蛋白，普遍存在于胞外基质中，能促使细胞与细胞的粘连。造血细胞能合成纤维结合素，并与其粘连。研究表明，纤维结合素可将淋巴细胞前体与其他表型相同的细胞粘连到一起。粘连是通过纤维结合素分子中两个区域进行的。一是含有RGD系列氨基酸；另一是分子中的末端羧基。纤维结合素多数通过纤维结合素受体与细胞进行反应。 4)胶原蛋白

胶原蛋白是组织细胞的结构蛋白。它以多种形式存在于胞外基质中，很多蛋白都与它连接，并与整合素直接相连。骨髓细胞在体外培养能分泌出Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型胶原．说明生血细胞生存时，在胞外基质中需要有上述几种胶原。Ⅰ型胶原由骨组织中90％的蛋白组成。

4、胞外基质对细胞功能的调控

例如，肝细胞在体外培养数日后逐渐失去合成和分泌白蛋白的功能，这可能与胞外基质的作用有关。其他详述略

六、组织工程中的人工器官 组织工程可以分为两个方面：

第一方面，在体外用分离的细胞建造人工组织；

第二方面，在体内调整细胞的生长和功能，例如植入聚合物导管促使损伤的神经细胞生长并连接。

1、 人工皮肤

人造皮肤

第一个用组织工程技术制作成功并用于临床的器官是人工皮肤，由于组织来源是别人的或自体的皮肤，在体外培养植入创伤面，故无异体排斥作用，具有人体皮肤的全部功能。

常规制皮的方法是，在培养皿中，用非转化的细胞制成二维薄层，这些单层细胞不具有三维立体的组织性能，所以没有分化功能。

组织工程技术，则是在体外制备三维的、具有生命活性的基质细胞，三维支架可以使细胞像在体内一样生长和组装。

人体皮肤细胞在体内的生长，借助结缔组织形成的三维基质作为骨架，骨架含有各种生长因子，供组织细胞分化和构建。

组织工程技术是这样模拟的：将人体成纤维细胞种植到尼龙网上，铺在薄的硅橡胶膜上，尼龙网起三维支架的作用，硅膜保持供给营养液；随着细胞的生长释放出蛋白和生长因子，最后长成三维的皮组织。因为成纤维细胞无免疫原件，所以不会产生异体排斥作用，细胞植到网状支架上很快就进行扩散和伸展。

组织工程皮肤除了能代替人体受损伤的皮肤外，还能作为化学药品毒性测定的模型。

2、人工肝支持装置

人工肝支持装置是利用组织工程原理设计的一种能够代替人体肝脏功能的体外装置。随着细胞生物学、组织工程学、生物材料学的发展，由单一地清除血中毒物，发展到全面替代肝功能。

组织工程人工肝的核心部分是细胞反应器。它的功能是在一个较小的体积内保持大量肝细胞的活性和生理功能。人们普遍认为，人工肝具有正常肝脏10％的解毒功能与合成蛋白的功能，就能够满足人体生理需要的最低要求。能够完成这一要求的细胞数约为1010数量级。这个指标通常是评价反应器能否用于临床试验的客观标限。在诸多的反应器或装置中，有四种研究得较多，下而简略介绍其中一种。 第四种细胞反应器

这是Dixit研究的两组中空纤维反应器。第一组由聚砜制成中空纤维，孔径为2微米；第二组由醋酸纤维素制成，分子量截留是(150---200)干道尔顿，肝细胞附在管外。为了调节细胞对材料的粘附能力，醋酸纤维素管需经荧光处理和纤连蛋白修饰。营养物通过管内提供给细胞，血液通过聚砜中空纤维，这样就构成一个与肝生理状态相似的循环。

3、人工血液

由于医疗中血液的需求日益增多，而且大量血液的来源困难，因此急救输血受到了限制。此外，输血易感染肝炎、艾滋病等，使输血疗法面临重大威胁。人工血液不存在免疫反应、感染疾病的问题，贮存时间长、产量大，因此具有巨大的应用前景。美国、加拿大、日本等国投入巨资研究开发人工血液，使这一领域的研究迅猛发展。

早期的血液代用品以氟碳化合物为主，实现了临床应用。但是氟碳化合物在体内的代谢对人体有毒副作用。随后发展起来的以血红蛋白(Hb)为基础的人工血液具有广阔前景。

直接使用天然血红蛋白，肾脏会产生严重毒性。这是因为在提取过程中，血红蛋白由原来的四聚体裂解为二聚体，分子量减小，所以必须对天然血红蛋白进行修饰，将天然血红蛋白交联成聚合体，同时进行修饰，才能成为血液代

用品。血红蛋白的分子修饰大体有三种方法： ① 血红蛋白分子间交联，成为聚合血红蛋白； ② 重组血红蛋白； ③ 结合血红蛋白。

修饰血红蛋白血液代用品的研究可分为第一代、第二代、第三代三个阶段。具体方法可以自查资料。

4、 人工神经

组织工程近年的研究表明，神经细胞不能分裂但可以修复。受损神经的两个断端能借助管状导管(通常称神经导管)的引导、促进和导向，使神经细胞生长和修复。早期的神经导管是用硅橡胶制成的。

众多的聚合物可用来做神经导管，但至今仍处于研究阶段。

微环境对神经的修复再生十分重要。具有一定通透性的导管(如聚丙烯腈—氯乙烯聚合物导管)可使新生神经的形态比无通透性的导管更规整。通透性分子量截留在5万道尔顿效果最佳。这可能因为分化的微环境对细胞生长更为有利。 营养或生长因子对神经的修复和细胞的生长起着重要作用。在导管中，由于释放生长因子，能将较长距离的神经断头(15mm间隙)慢慢吻合起来。神经营养因子可从缓释材料中获得。研灾发现，许旺细胞种植在导管中分泌出多种营养物质，而正还可分泌细胞粘连分子，促进细胞生长，因此目前神经导管中均种植许旺细胞。（许旺细胞(Schwann cells)由德国生理学家Theodor Schwann发现。许旺细胞出现在周边神经系统，形成髓鞘，将周边神经系统的神经元伸出的轴突进行绝缘包覆，使神经讯号的传导速度加快。）

电荷对神经细胞修复具有促进作用。研究发现，将电极放在硅橡胶管的两端，细胞生长速度加快；驻极体聚四氟乙烯导管，对细胞的修复有促进作用。 选择可降解导管的一个重要原则是使神经生长速度与导管降解速度匹配。

5、人工血管

A、国际上的研究主要集中在制作小口径血管(小于6mm)及心脏瓣膜。将细胞贴附在聚合物支架上植入体内，愈合成机体的一部分，发挥正常的生理功能。支架一般是多孔的，新生组织能够长入孔内。可选材料有涤纶、特氟隆等

纤维编织物。

编织的聚酯纤维管是常用的人造血管材料，这种人工血管仅限6mm以上直径。小于4mm时，常用嵌段聚氨酯，但由于降解、破裂，不能长期用于小直径的人工血管。为改进嵌段聚氨酯的血液相容性，进行了多方面研究。日本科学家用甲基丙烯酸乙基磷酸胆碱酯(MPc)对嵌段聚氨酯表面进行改性，降低蛋白质和血小板的吸附，应用于小直径人工血管，取得较好的效果。

将抗凝剂(如肝素)或内皮细胞植入材料表面，可提高材料的抗凝血性。 B、人工血管今后的研究力向是从材料角度选择、设计、制作支架材料，使其不仅具有血液相容性，而且能够促进受损血管迅速修复和生长，待支架完成使命后从体内降解消除。

从组织工程角度看选用体内稳定材料不如选用可吸收材料，可吸收材料可以避免长期残留在体内带来不良生物学反应。目前报道的可降解生物材料已有20余种，但实际应用的只有聚乳酸、聚乙交酯及其共聚物。

支架生物材料与血管内皮细胞之间的粘附是细胞生存扩展和增殖的重要和必要条件。一般来说，细胞的粘附能力都不高，细胞增殖到一定程度就会脱落。 提高内皮细胞在材料表面粘附的常用方法是在材料表面吸附或固定纤连蛋白、层粘连蛋白或玻连蛋白。

组织工程对材料的另一要求是，在植入后能缓释各种活性物质，如血管生长因子、血小板活化因子和抗凝因子等，使新生组织很快长入支架多孔材料，形成新的血管。目前临床应用的主要是涤纶和特氟隆制成的血管。研究方向是向“生物化”发展，防止发生凝血。用内皮细胞改善材料表面与血液的相容性，使血管支架释放生长因子。此外，用可吸收支架诱导组织向人工血管内部生长，也是目前研究的重要课题。

6、人工胰

人工胰的作用是使糖尿病患者血糖维持正常水平，防止小血管疾病和其他并发症的发生发展；人工胰分为机械型和生物型两大类。生物型人工胰是基于免疫隔离原理，把植入的细胞借助一个半透膜与宿主隔开。分子量小的营养物、电解质、氧、分泌的活性物质，可以在半透膜的两侧进行交换；而免疫细胞、抗体等则被隔开。生物型人工胰有三种装置： ①动静脉短路装置：胰岛细胞分散在半透膜之间

②扩散室装置：将胰岛细胞植入聚丙烯等制成的管状扩散室中，再植入体内 ③微囊化胰细胞：用超薄膜(8微米)将胰岛细胞进行包埋，微囊化胰岛细胞具有很大的比表面，易于植入体内(用针头注射)，所以发展较快。

7、组织工程材料研究方向探讨

近年来组织工程的发展对医用材料提出了更高的要求：材料不应只是“惰性”植入体，还要能引导和诱导细胞组织器官修复再生。为实现这一目标，需要进行以下方面的研究：

(1)新型可降解材料并控制其降解速度，降解产物不含毒性，具有不同强度、不同孔径结构，并能释放各种生物活件物质；

(2)用物理、化学和生物方法改造和修饰原有材料，使其具备生物功能； (3)研究材料与细胞之间的反应机制和促进细胞再生的规律和原理 (4)研究细胞基质的作用和原理，研制生物功能的三维支架； (5)研制具有选择通透性的膜材

(6)用自组装方法制备无机、有机结构交替的仿天然材料；

(7)利用智能高分子材料传导细胞与材料之间的应答反应；

(8)大力发展对细胞和组织具有诱导作用的材料，促进受损器官的修复和再生；

(9)用基因工程手段改造细胞，使其具有特殊功能； (10)在体外大量培养、增殖、储存和运输细胞及其复合物。

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