基因敲除知识补充

7.19

同源臂通常是指打靶载体上待插入的外源序列两侧的与基因组序列完全一致的侧翼序列，用于识别并发生重组的区域

同源序列是指在同一物种不同个体间或不同物种间相同或相似的DNA序列，而同源臂是指一段同源序列，类似于tRNA氨基酸臂的结构，所谓臂，指的是手臂样结构。

T载体的定义：

T载体（T-Vector）是一种高效克隆 PCR 产物（TA克隆）的专用质粒载体，为线性化载体，无需酶切可直接与具有A末端的PCR产物连接，属于非定向克隆。

T载体的作用原理：

大部分耐热性DNA聚合酶进行PCR反应时都具有在PCR产 物的3’末端添加一个“A”的特性（下图红色框内所示位置）。因此，人们在线性化平末端载体的两端分别又人工加上一个额外的T碱基（下图两个红色箭头所示），从而可与PCR克隆产物的A末端互补配对，提高了PCR产物连接和克隆的效率。

T载体进行TA克隆的优势：

相对于另一种非定向克隆——平末端克隆，使用T载体进行TA克隆是一种快速、高效、一步到位的非定向克隆法。有研究曾证明，平末端克隆的连接效率仅为粘端连接的1/50，且自身环化率高。

T载体的制备：

?

商业化T载体：

一般来说，商业化的T载体多是先使用平端限制性内切酶（如EcoRV）将克隆载体进行线性化，然后再单独加入dTTP和Taq酶72～75℃反应，进行末端的加T。[1]

? 自制T载体：

一种常见的自制方法是利用限制性内切酶制造出具有单个T末端突出的片段，最常用的内切酶为XcmI[2]，其识别和切割特点如下：

其中XcmI的识别序列分别为两端的CCA和TGG，而切割序列则为中间三角箭头所指的N（N代表任意碱基）。由于N可以是任意碱基，所以如果将切割位置的N设置为T，那么在该酶的切割下，就可以产生一个3’ T末端。相似的，在其互补链上设置另一个相同或者类似的XcmI酶切位点（保证切割位点为T即可）就可以产生另一个T末端。一般可以在商业化的T载体基础上进行改造，通过PCR或者合成Oligo的方式插入上述两个XcmI位点。连接成功的质粒可按需要自行扩增和保存，使用时用XcmI进行完全酶切（这里的酶切必须保证完全，否则载体易自连，所以XcmI酶最好过量，或者适当延长消化时间），就可以制备得到T载体。[3]

常见T载体及序列：

虽然上面提到可以自制T-Vector，但实际上现在的商业化载体已经做到比较便宜，而且批次间稳定性保持的不错。最常见的T-Vector要属Takara公司的pMD系列（pMD18-T、pMD19-T、pMD20-T以及对应的去除多克隆酶切位点的Simple载体，如pMD19-T-Simple[4]）和Promega公司的pGEM系列（pGEM-T和pGEM-T Easy）[5]。

载体：zài tǐ

英文单词vector ，在基因工程重组DNA技术中将DNA片段（目的基因）转移至受体细胞的一种能自我复制的DNA分子。三种最常用的载体是细菌质粒、噬菌体和细菌病毒和动植物病毒。 运载体

在基因操作过程中使用运载体有两个目的：一是用它作为运载工具，将目的基因转移到宿主细胞中去；二是利用它在宿主细胞内对目的基因进行大量的复制(称为克隆)。现在所用的运载体主要有两类：一类是细菌细胞质的质粒，它是一种相对分子质量较小、独立于染色体DNA之外的环状DNA(一般有1～200 kb左右，kb为千碱基对)，有的一个细菌中有一个，有的一个细菌中有多个。质粒能通过细菌间的接合由一个细菌向另一个细菌转移，可以独立复制，也可整合到细菌染色体DNA中，随着染色体DNA的复制而复制。另一类运载体是噬菌体或某些病毒等。现在人们还在不断寻找新的运载体，如叶绿体或线粒体DNA等也有可能成为运载体。 作为运载体必须具有四个条件：①在宿主细胞中能保存下来并能大量复制；②有多个限制酶切点，而且每种酶的切点最好只有一个，如大肠杆菌pBR322就有多种限制酶的单一识别位点，可适于多种限制酶切割的DNA插入；③ 含有复制起始位点，能够独立复制；④有一定的标记基因，便于进行筛选。如大肠杆菌的pBR322质粒携带氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性基因，就可以作为筛选的标记基因。一般来说，天然运载体往往不能满足上述要求，因此需要根据不同的目的和需要，对运载体进行人工改建。现在所使用的质粒载体几乎都是经过改建的。

基因克隆的载体类型：质粒载体，噬菌体载体，柯斯质粒载体，M13噬菌体载体，噬菌粒载体

t载体就是一种常用的克隆载体，既然是克隆载体当然是用来克隆目的基因片段的

Taq DNA酶扩增的PCR产物，其DNA双链前后末端都有一个游离的A碱基，可以与t载体 末端游离的T碱基互补形成环状重组T质粒。

关于菌株的几个概念：

野生型菌株：从自然界分离到的微生物在其发生突变前的原始状态。

营养缺陷型：野生型菌株经过人工诱变或自然突变失去合成某种营养的能力，只有在基本培养基中补充所缺乏的营养因子才能生长。

原养型：营养缺陷型菌株经回复突变或重组后产生的菌株，其营养要求在表型上和野生型相同 关于培养基：

基本培养基（minimal medium，MM）：仅能满足微生物野生型菌株生长需要的培养基，用[－]来表示。 完全培养基（complete medium，CM）：凡可满足一切营养缺陷型菌株营养需要的天然或半组合培养基。用[＋]来表示。

补充培养基（supplemental medium，SM）：凡只能满足相应的营养缺陷型生长需要的组全培养基， 它是在基本培养基中加入该菌株不能合成的营养因子而组成。

营养缺陷型是指缺乏合成某种对自身生长繁殖所必须的营养物质（氨基酸、维生素、碱基等）的能力的突变型，只能从周围环境或培养基中获得这些物质或其前体物才能正常生长。

营养缺陷型的检出是通过一系列培养基实现的。

基本培养基（MM）——能满足野生型和原养型菌株最低营养要求的合成培养基。 完全培养基（CM）——能满足各种营养缺陷型菌株营养要求的天然培养或半合成培养基。 补充培养基（SM）——在MM中有针对地补加某一种或几种营养成分，以满足特定营养缺陷型菌株生长要求的培养基

诱变后的菌体经富集培养后，涂布于CM平板上，将长出的菌落按一定排列次序逐个地点种到MM平板、CM 平板的相应位置。培养后，在CM上有菌落生长而在MM的相应位置上没有生长的菌落，可能是营养缺陷型。挑取菌体分别接种于MM、CM上进一步复证。除点植对照法外，还可通过影印法、夹层法、限量补给法等检出营养缺陷型。

拷贝数就是指某基因（可以是质粒）在某一生物的基因组中的个数. 单拷贝就是该基因在该生物基因组中只有一个,多则指有

多个。

四、材料 (一)菌种 E.coli (二)培养基、 1

LB培养液(Luria-Bertani 培养基,这个名字来源于英语的 lysogeny broth，即溶菌肉汤。是微生物学实验中最常用的培养基，用于培养大肠杆菌等细菌，分为液态培养基和加入琼脂制成的固态培养基。加入抗生素的 LB 培养基可用于筛选以大肠杆菌为宿主的克隆。)：酵母膏，0.5g；蛋白胨，1g；NaCl，0.5g；水，100ml，pH7.2 121℃灭菌15min 2 3

2×LB培养液：其它不变，水，50ml。

基本培养基： 葡萄糖 0.5 g，(NH4)2SO4 0.1 g，柠檬酸钠 0.1 g，MgSO4·7H2O 0.02 g，K2HPO4 0.4 g，KH2PO4 0.6 g，重蒸水 100 mL，pH 7.2，110℃灭菌 20 min。 配固体培养基时需加 2%洗涤处理过的琼脂。全部药品需用分析纯，使用的器皿 需用蒸馏水或重蒸水冲洗 2~3 次。 4

无N基本液体培养基：

K2HPO4,0.7g；KH2PO4,0.3g; 柠檬酸钠 3H2O,0.5g；MgSO4 7H2O,0.01g; 葡萄糖2g；水100ml，pH7.0 110℃灭菌20min 5

2N基本培养基：

K2HPO4,0.7g；KH2PO4,0.3g; 柠檬酸钠 3H2O,0.5g；MgSO4 7H2O,0.01g; (NH4)2SO4,0.2g;葡萄糖2g；水100ml，pH7.0 110℃灭菌20min 6 7

完全培养基同LB培养基，配置固体培养基，需加 2%的琼脂。 混合氨基酸和混合维生素

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