（整理）-分子生物学复习资料

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2013-2014分子生物学复习资料

一、中心法则

DNA RNA 蛋白质

二、DNA复制

(一) DNA复制的特点

1、半保留复制

DNA复制时分别以两条亲代链作为模板链通过酶催化各形成一条子代链，亲代链分开处即子代链合成处成为复制叉。 2、半不连续复制

DNA亲代链5’到3’方向的复制时，是以小片段的形式从5’到3’不连续的复制形成冈崎片段，再经DNA连接酶连接形成一条链。 3、RNA的引导

RNA的引导保证DNA复制的高忠实性。 （二） DNA复制所需要的酶 1、原核中：

（１）DNA解旋酶：利用ATP水解的能量解开双链ＤＮＡ

（２）DNA旋转酶（Ⅱ型拓扑异构酶）：引入负超螺旋从而释放正超螺旋。 （3）DNA聚合酶Ⅲ：延伸前导链和后随链中的引物。 （4）DNA聚合酶Ⅰ：切除引物。

（5）DNA连接酶：连接冈崎片段形成ＤＮＡ子代链。 2、真核中：

（１）DNA聚合酶α：前导链和后随链的每个片段都是利用其引发酶活性从RNA引物开始。

（２）DNA聚合酶δ：在前导链上替代前一种酶继续延伸。 （３）DNA聚合酶ε：在后随链上完成DNA的复制。 （三） DNA聚合酶

1、真核中：真核细胞有5种DNA聚合酶，分别为DNA聚合酶α（定位于胞核，参与复制引发具5－3外切酶活性），β（定位于核内，参与修复，具5－3外切

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酶活性），γ（定位于线粒体，参与线粒体复制具5－3和3－5外切活性），δ（定位核，参与复制，具有3－5和5－3外切活性），ε（定位于核，参与损伤修复，具有3－5和5－3外切活性）。

2、原核中：原核细胞有3种DNA聚合酶，都与DNA链的延长有关。DNA聚合酶I是单链多肽，可催化单链或双链DNA 的延长；DNA聚合酶II则与低分子脱氧核苷酸链的延长有关；DNA聚合酶III在细胞中存在的数目不多，是促进DNA链延长的主要酶。

功能 聚合作用5'→3' 外切酶活性3'→5' 内切酶活性5'→3' polⅠ polⅡ polⅢ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ － － － － － ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ － － － ＋ 焦磷酸解和焦磷酸交换作用 ＋ 完整的DNA双链 带引物的长单链DNA 带缺口的双链DNA 双链而有间障的DNA 分子量（ｋｄ） （四）DNA的损伤与修复 1、诱变 （1）突变

1) 点突变：一个单一碱基的改变

－ ＋ ＋ ＋ 109 120 140 转换：嘌呤与嘌呤之间或是嘧啶与嘧啶之间 颠换：嘌呤与嘧啶之间或是嘧啶与嘌呤之间

2) 沉默突变：突变发生在ＤＮＡ的非编码区、非调节区或密码子的第

三个碱基位置，不影响掺进蛋白质中的氨基酸 3) 错义突变：突变改变了基因产物的一个氨基酸

4) 移码突变：插入或缺失涉及一个或多个碱基的增加或丢失

（２）物理诱变：高能离子化辐射，如Ｘ射线、γ射线、紫外线（嘧啶二聚体是常见的一种产物）

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（３）化学诱变：碱基类似物（直接诱变）、亚硝酸、烷化剂等 ２、损伤 （１）氧化性损伤

（２）烷基化（如ＭＭＳ、ＥＮＵ） （３）聚化加合物 ３、修复

（１）光复活：在可见光下，ＤＮＡ光解酶可将环丁烷嘧啶二聚体再分解为单体 （２）烷基转移酶

（３）切除修复：核苷酸切除修复和碱基切除修复 （４）错配修复 （５）遗传性修复 （五）ＤＮＡ的克隆 １、ＤＮＡ的制备 （１）质粒DNA的制备

碱裂解法：从染色体ＤＮＡ及大部分其他细胞成分中纯化 酚抽提法：采用酚或酚－氯仿混合物进行抽提 乙醇沉淀： 氯化铯梯度法：

（２）噬菌体DNA的制备 2、载体 （1）质粒载体

1) 插入失活原理：pBR322及其衍生物包含两个抗生素抗性基因，ampr

和tetr，当目的基因插入其中一个时，会导致该基因失活。 2) 蓝白斑筛选：在质粒中含有LacZ基因（编码β-半乳糖苷酶，受Lac

启动子的调控）的α-肽的序列，当无外源DNA片段插入时，质粒表达α-肽，它与宿主菌的Lac ZM15基因的产物互补，产生有活性的β-半乳糖苷酶，在含有指示剂X-gal和诱导剂IPTG存在的情况下，菌落呈蓝色（质粒自身环化）；外源基因插入后，肽基因阅读框架被破坏，细菌内无半乳糖苷酶活性存在，菌落呈白色（阳性克隆）。

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（2）噬菌体载体

噬菌体颗粒将其线性DNA注入细胞，进而DNA连成环状，其后该DNA被复制组装成噬菌体颗粒，经裂解细胞释放到胞外，造成细胞死亡，或通过特异位点将其DNA整合到宿主基因组，而获得长期插入。 （3）其他载体

黏粒载体：利用λ噬菌体cos位点 YAC：酵母人工染色体 BAC：细菌人工染色体 （六）基因文库

1、基因组文库（DNA来自基因组DNA）

N?ln(1?p)1n(1?f)，p代表给定概率，f是插入片段大小占总基因大小的

文库的大小比例。

2、cDNA文库（DNA来自群体mRNA的拷贝） cDNA第二条链的合成：

a) 自身引物合成法：cDNA/mRNA杂合体用碱处理后获得单链cDNA，随即在3’

端形成一个短小的发夹结构，次发夹结构可以作为引物合成第二条链。最后用SI核酸酶处理除去末端发夹结构，但5’端部分序列会因此而失去。 b) 置换合成法：RNaseH在mRNA上产生缺口（内切作用）残存的ＲＮＡ可以作

为合成第二条链的引物，最后用Ｔ４ＤＮＡ连接酶连接修复缺口。通过这种方法可以获得近乎全长的dscDNA。

c) 引导合成法：NaoH降解杂交链中的mRNA，然后用末端转移酶在cDNA３＇端

加聚Ｃ尾巴，以Oligo（dG）为引物合成第二条链，这种方法可获得全长的dscDNA。 (七)DNA测序

1、双脱氧链终止法测序的原理

DNA聚合酶能利用单链ＤＮＡ为模板，离体合成其互补链，当反应液中２＇，３＇－双脱氧核苷三磷酸（ｄｄＮＴＰ），它可以像２＇－脱氧核苷三磷酸（ｄＮＴＰ）那样直接掺入新合成的ＤＮＡ链中，但因ｄｄＮＴＰ３＇端不具－ＯＨ，所

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以寡核苷酸链不再继续延长，即ＤＮＡ链合成终止。在４个反应管中同时加入同一种合成ＤＮＡ的被标记的引物和待测序的ＤＮＡ模板、ＤＮＡ聚合酶１、４种脱氧核苷三磷酸（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ），并在这４个管中分别加入４种不同的２＇，３＇－双脱氧核苷三磷酸。反应将产生不同长度的DNA片段混合物，他们都带有ddNTP的3’末端。将这些混合物进行变性凝胶电泳分离，就可以获得一系列不同长度的DNA普带。再通过放射自显影术，检测单链DNA片段的放射性带。最后可以在放射性Ｘ光底片上，直接读出ＤＮＡ序列。 2、Ｍａｘａｍ－Ｇｉｌｂｅｒｔ化学降解法：

首先放射性标记待测序ＤＮＡ的一端，并将其分为４份，分别用不同的化，学试剂进行４种裂解反应，每种反应之断裂某一种或某一类碱基，结果可产生４种起始于放射性标记末端的不同长度的标记分子，经变性ＰＡＧＥ凝胶电泳分离各组不同大小长的ＤＮＡ片段，并进行放射自显影，可根据Ｘ光片上所显现的相应普带，读出ＤＮＡ的核苷酸序列。 3、ＤＮＡ的自动测序：

基于双脱氧链终止法测序原理，也是通过４个酶学反应利用ｄｄＮＴＰｓ产生一系列一端固定、另一端终止于不同Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ碱基位点的DNA片段。

三、RNA转录

乳糖操纵子

1、乳糖操纵子的组成：大肠杆菌乳糖操纵子含Z、Y、A三个结构基因，分别编码半乳糖苷酶、透酶和半乳糖苷乙酰转移酶，此外还有一个操纵序列O，一个启动子P和一个调节基因I。

2、阻遏蛋白的负性调节：没有乳糖存在时，I基因编码的阻遏蛋白结合于操纵序列O处，乳糖操纵子处于阻遏状态，不能合成分解乳糖的三种酶；有乳糖存在时，乳糖作为诱导物诱导阻遏蛋白变构，不能结合于操纵序列，乳糖操纵子被诱导开放合成分解乳糖的三种酶。所以，乳糖操纵子的这种调控机制为可诱导的负调控。

3、CAP（ｃＡＭＰ受体蛋白）的正性调节：在启动子上游有CAP结合位点，当大肠杆菌从以葡萄糖为碳源的环境转变为以乳糖为碳源的环境时，cAMP

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始复合物。

c) 一旦形成前起始复合物，50S亚基就与30S亚基结合，同时结合

在IF－2上的GTP水解生成IF-2-GDP和Pi，然后结合在前起始复合体上的起始因子IF－1和IF－3解离，最后形成由30S与50S组成的起始复合物，fMet- tRNAfMet被定位在P位。IF-2-GDP 中的GDP与GTP交换重新生成IF-2-GTP。

2. 延伸

当蛋白质合成启动后，第二个密码被定位准备接收第二个氨酰-tRNA。起始氨酰-tRNA占据P位，A位被用来接收一个氨酰-tRNA，这是肽链延伸反应的第一步。在肽链延伸阶段，需要将每一个按照密码要求的氨基酸接到生长着的肽链上，每连接一个氨基酸都要重复进行一轮延伸循环反应。 a) 将正确的氨酰-tRNA定位在A位 b) 形成肽键

c) 使mRNA相对于核糖体移动一个密码（移位）。 d) 释放卸载的tRNA

在每一轮延伸循环的开始，核糖体的A位是空的，而P位被一个氨酰化的tRNA占据。P位的tRNA作为延伸的肽链的连接点，每进行一轮延伸循环，连接在P位tRNA分子上的氨基酸残基数都增加一个。连接着延伸肽链的tRNA称为肽酰-tRNA。 3. 终止

蛋白质合成的最后一个阶段是多肽链延伸的终止。多肽链的最后一个肽键形成后，携带新合成多肽链的肽酰-tRNA从A位转移至P位，终止密码（UAA、UAG或UGA）进入A位，在正常的细胞中没有和终止信号互补的tRNA。在E.Coli中，有三种释放因子RF－1、RF－2和RF－3（RF：Release Factor）能够识别终止密码。释放因子RF－1可以与UAA和UAG结合，而RF－2能与UAA和UGA结合，RF－3与RF－1或RF－2结合形成异二聚体。RF－3也结合GTP。 当异二聚体在A位与mRNA结合后，改变了肽酰转移酶的活性，使得该酶能够水解肽酰-tRNA酯。伴随着GTP的水解和释放因子从核糖体的解离，最后的多肽产物从核糖体释放出来。70S核糖体解离为30S和50S亚基，为

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合成另一个多肽分子作准备。

【总结】

遗传密码几乎是通用的，由64个密码组成，每个密码由3个核苷酸残基构成。64个密码中有61是编码氨基酸的，其余的UAA、UAG和UGA 3个密码为终止密码。读码的起点确定了一个基因的读码框架。读码起点的漂移有时会改变整个遗传信息。密码中碱基突变有时会改变密码的意义，一个核苷酸的取代可能会使一个错误的氨基酸整合到合成的蛋白质中。

遗传密码有几个显著特点，一是密码具有简并性，即许多密码编码同一个氨基酸，而且处于密码头两个位置的核苷酸足以指定一个氨基酸，所以处于第三个位置的核苷酸即使发生突变也不会改变密码的意义。另外具有类似核苷酸序列的密码往往指定化学性质相近的氨基酸。

tRNA分子是mRNA和蛋白质之间的桥梁，它携带有激活的氨基酸，在核糖体处通过互补碱基配对与mRNA相互作用将氨基酸转移给生长着的肽链。

所有的tRNA分子都含有一些确定的结构特征，tRNA分子中往往都含有许多保守和许多共价修饰的核苷酸，其中一些核苷酸对tRNA分子的二级和三级结构有稳定作用。tRNA分子的二级结构为三叶草型，含有4个臂（碱基配对区）和3个环。氨基酸臂共价连接着氨基酸残基，反密码环上的反密码通过碱基配对与mRNA中的密码相互作用。tRNA分子的三级结构为倒L型。

反密码与mRNA中的密码相互作用在5ˊ位有一定的柔性（摆动性），即在该位置容许非标准碱基配对，结合同一个氨基酸但具有不同反密码的tRNA（同工tRNA）可以与同一个密码通过碱基配对相互作用。

一个氨基酸在氨酰-tRNA合成酶的催化下共价连接在tRNA分子3ˊ末端的A残基上。每一种氨酰-tRNA合成酶对一种氨基酸和相应的tRNA分子是

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高度特异的。某些氨酰-tRNA合成酶还具有校正活性，使已经形成的不正确的氨酰-腺苷酸水解。

核糖体是由一个大亚基和一个小亚基组成的。在E.coli中，小亚基是30S亚基，含有21种蛋白质和一分子的16SrRNA；而大亚基是50S亚基，含有31种蛋白质和5S、23S两种rRNA分子。在蛋白质合成期间，两个亚基结合形成一个70S核糖体。真核生物的核糖体比原核生物的大（由40S和60S亚基组成的80S核糖体）和含有更多的蛋白质。真核生物核糖体的大亚基含有3分子rRNA（28S、5S和5.8S）。

核糖体中肽链的合成包括三个阶段：起始、延伸和终止。在原核生物的起始阶段，首先形成一个包含mRNA、30S亚基、一个氨酰化的起始tRNA（fMet- tRNA fMet）和50S亚基的起始复合体。起始因子促进复合体成员之间的结合，同时需要一分子GTP。通过起始密码和氨酰化的起始tRNA的相互作用选择正确的密码，这种相互作用由于16SrRNA和位于mRNA起始密码上游的互补SD序列之间碱基配进一步得到了加强。

在蛋白质合成的延伸阶段，一个氨酰-tRNA结合在A位，而相邻的P位为肽酰-tRNA位置，一个肽键的形成伴随着一个新的肽酰-tRNA由A位转移到P位和游离的tRNA从E位被弹出过程。这个过程需要3个延伸因子和消耗两分子GTP。

蛋白质合成的终止发生在特殊的终止密码处，同时需要释放因子参与和消耗一分子的GTP。蛋白质合成的不同阶段都会受到抗生素的抑制。

许多蛋白质在合成期间和翻译之后会受到共价修饰。某些修饰(如：乙酰化、羟基化、磷酸化、甲基化、糖基化和核苷的添加)影响蛋白质向不同细胞部位的转运。一个向细胞外分泌或插入到膜中的蛋白质的N末端常常含有一个由16～30个残基组成的疏水性信号肽

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【名词解释】

Melting temperature ：解链温度即双链核酸分子变性打开双链成单链的温度Tm值，一般DNA分子变性的Tm与G和C的含量成正相关。

Cis-acting elements ：顺式作用元件，是基因转录中的一系列调控基因转录的基因序列片段。

在原核生物中，大多数基因表达通过操纵子模型进行调控，其顺式作用元件主要由启动基因、操纵基因和调节基因组成。在真核生物中，与基因表达调控有关的顺式作用元件主要有启动子、增强子和沉默子。

Wobble：摇摆，主要是指在基因密码中，编码一个氨基酸的密码子的第三个核苷酸碱基有可能与反密码子的第一个碱基形成非沃森-克里克的碱基配对方式，从而允许tRNA解读更多密码子的现象。

ORF：开放阅读框，是基因序列中一段从起始密码子开始编码某一蛋白质的到终止密码子结束的碱基序列。

Base stacking force：碱基堆积力，是一种在DNA双螺旋结构中，碱基对平面垂直于中心轴，层叠于双螺旋的内侧，相邻疏水性碱基在旋进中彼此堆积在一起相互吸引形成的作用力。这种力与氢键共同维系着DNA的双螺旋结构的稳定性。

Transcription ：转录，是指生物中遗传信息由DNA流向RNA的过程，其中主要是指以DNA为模板在RNA聚合酶的作用下合成前体RNA的过程。

Silent mutation ：沉默突变，即同义突变。由于基因编码的简并性原则，在基因突变中，虽然某碱基改变了，但最后在翻译的蛋白质序列中氨基酸并未发生改变，仍保持野生型功能。

Intron ：是真核生物基因中阻断基因线性表达，分开相邻外显子的一段非编码DNA片段。

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Hyperchromic effect：增色效应，由于DNA变性由双链变为单链引起的光吸收增加称增色效应,也就是变性后 DNA 溶液的紫外吸收作用增强的效应。

Hypochromicity effect：减色效应，单一的核苷酸的光吸收值比RNA和单链的DNA的吸收值都大，单链DNA又比双链DNA大。这种双链DNA相对于单链DNA吸收值减少的现象就叫做减色效应。

Supercoiling：超螺旋，是DNA绕轴线的再次螺旋，若以Lk0表示松弛闭环DNA的连接数，Lk0的改变将导致超螺旋。一般天然的DNA呈负超螺旋，即DNA变形的方向同双螺旋解旋的方向相反。

Telomerase:端粒酶，是一种由RNA和蛋白质组成的核糖核蛋白复合体，属于反转录酶。它以自身的RNA作为端粒DNA复制的模板，合成出富含脱氧单磷酸鸟苷(dGMP)的DNA序列后添加到染色体的末端并与端粒蛋白质结合，从而稳定了染色体的结构。

RNA polymerase：①原核生物RNA聚合酶：只有一种，组成α2ββ′σ，称为全酶。α亚基以二聚体形式形式存在，主要功能是装配核心酶及识别启动子；σ亚基是启动子特异识别及转录起始物异构的主要亚基，分子大小为32×103的σ亚基，常写成σ32，分子大小为70×103的亚基，常写成σ70。 σ亚基与其他亚基结合松弛，易从全酶上掉下来，使全酶成4亚基的α2ββ′。解离后的α2ββ′称为核心酶。β与β′一起构成RNA聚合酶的催化中心。其中β能与模板DNA、转录产物RNA及底物交联，参与RNA合成及终止信号识别；β′可使聚合酶结合到模板DNA上，行使转录功能。

②真核生物RNA聚合酶：真核生物有3种，即RNA polⅠ、RNA polⅡ、RNA polⅢ，分布于细胞核的不同位置，它们之间的主要区别在于对α-鹅膏蕈碱的敏感性不同，其中最敏感的是RNA polⅡ，存在于核质中，转录mRNA前体；其次是RNA polⅢ，也存在于核质中，转录tRNA、5S rRNA和其他几种小

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