试剂盒DNA提取详细操作步骤

一、试剂盒打开后需要准备的工作

1、Proteinase K（蛋白酶K）的溶解

①取4.5ml双蒸水加入蛋白酶K粉中使其充分溶解

②将溶解好的蛋白酶K溶液分装进小离心管，每管100ul～200ul

③将分装好的Proteinase K放入-20℃冰箱中保存，使用期限为12个月 2、组织抑制剂（Inhibitor Removal buffer）的调配

加入20ml无水乙醇（absolute ethanol）颠倒混匀并在空白方框处打钩 3、洗液（wash buffer）的调配

加入80ml无水乙醇（absolute ethanol）颠倒混匀并在空白方框处打钩

二、组织DNA提取（试剂盒）

1、组织样品处理与消化

①将采集来的样品剪碎（≤0.1cm）洗净保存液。

②加入组织破解液Tissue-lysis 200ul 蛋白酶K 40ul然后放入55℃水浴锅内3

个小时使其充分消化。

2、DNA提取

①在消化好的组织样品中加入结合液binding buffer 200ul 然后放入70°水浴

锅中10分钟。

②再加异丙醇100ul 混合均匀吸取上清液放入柱体中，然后离心8000g一分钟。 ③倒掉底液，加500ul组织抑制剂Inhibitor Removal 然后离心倒掉底液 ④加洗液washing buffer500ul离心（洗液加两次）

⑤在70℃预热Elution Buffer，然后将洗好的柱体下部分丢掉，换新的离心管加

入Elution Buffer200ul溶解10分钟离心保留底液放-20℃保存。

三、细胞DNA的提取（试剂盒）

1、 组织样品处理与消化

① 将带有培养基的样品用PBS清洗干净8000rpm/1min离心，倒掉上清 ② 加PBS200ul振荡摇匀使之样品成为单个细胞的悬浊液 ③ 加200ul Binding Buffer，40ul蛋白酶K 混合均匀放入70℃水浴锅内消化10

分钟。

2、 DNA提取

① 加异丙醇100ul 混合均匀吸取上清液放入柱体中，然后离心8000g一分钟。 ② 倒掉底液，加500ul组织抑制剂Inhibitor Removal 然后离心倒掉底液 ③ 加洗液washing buffer500ul离心（洗液加两次）

④ 预热双蒸水（37℃）然后将洗好的柱体下部分丢掉，换新的离心管加入双蒸水

100ul溶解10分钟离心保留底液放-20℃保存。（注：最好溶解两次）。

四、分光密度仪的操作方法及样品的测试结果

1、光密度（optical delnsity）简称OD 2、操作示意图

电源开关 → 主界面→ 按1键 → 核酸 dsDNA 3、检测

①首先做一个空白对照，将1ul的水滴到镜头上盖上盖子，按一下蓝色键

②空白对照做好后依次检测其他样品，需要记录A260/A280的比值及浓度值

五、对浓度比较低的DNA溶液进行处理

1、处理方法（乙醇沉淀-浓缩） ①实验材料的准备

2ml圆底离心管；无水乙醇；70%无水乙醇；醋酸钠（NaAc PH5.2） ②操作方法

a 根据DNA溶液的体积判断加1/10体积的NaAc 和2倍体积的无水乙醇加好之后颠倒混匀放在-20℃沉淀（10min—16h或者更长时间均可）

b 将沉淀好的样品离心（12000xg10分钟）注意离心的时候离心管的管耳一定要朝外，离心后倒掉上清，取1ml 70%无水乙醇轻轻加入离心管中清洗之后倒掉洗液可清晰看到DNA片状物然后晾干。

c 根据需要将晾干后的DNA用双蒸水溶解。溶解的时候注意加双蒸水要沿着管耳加入小滴然后轻轻转动离心管使水滴随着管壁转动充分溶解DNA，将溶解好的DNA放入-20℃保存。

2、测OD上同（4—3）

六、酶切

1、酶切体系的建立

①酶切体系的建立包含底物、限制性内切酶、缓冲液、水，根据不同的需要配比个元素的量

②把混合好的需要酶切的样品放入37℃酶切过夜

③配置1%的琼脂糖凝胶电泳，观察是否将样品DNA成功切开如图1未切开，图2已经切开。

④分析未切开的原因，主要是酶，所以要考虑换其他酶来切

七、PCR（DNA扩增）

根据不同的酶可以设置不同的反应体系：Taq酶；2×red mix；Ex Taq体系；以下以

一个体系为例进行简单说明

1、试剂及器械的准备：10×taq buffer(kei),Mgcl2,dntp,引物，Taq DNA,模板DNA，H2O（无菌双蒸水）200ulPCR管

2、操作步骤：①取10×taq buffer 2.5×n(n=样品的个数)ul；Mgcl2 1.5×n ul；DNTP 2×n ul ；引物ovi F10.5×n ovi R10.5×n(为了方便起见可以将上下引物各取50ul混合后再取相应的数量使用)；Taq DNA 1×n ul ；H2O 16.5×n ul全部放入一个1.5ml离心管中混合均匀。② 取等量的混合液加入准备好的PCR管中，在加入模板DNA混合均匀之后等待扩增。（注：整个操作过程要保证无污染，用的移液枪要用75%的酒精棉球反复擦洗，枪头要绝对干净）

3、PCR仪的设置：打开电源→进入开始界面→按F3键选取一个程序→在按F1键开始进入程序→使用方向键来设置程序→按F1键开始扩增

4、反应条件：94℃ 2分钟 ； 94℃ 30″； 60℃退火30″； 72℃ 1分钟 ； 72℃5分钟 。整个循环完成后将样品放入4°冰箱保存

八、DNA纯化

1、试剂及仪器的准备

苯酚（棕色玻璃瓶装）；氯仿（四氯化碳CCL4）与异戊醇混合液（24︰1）DNA样品；双蒸水；1ml移液枪；500ul枪头；1.5ml离心管；离心机（12000rpm/10分钟）；无水乙醇；70%乙醇（4°冰箱放置）；醋酸钠（NaAc）

2、操作方法及步骤

①将DNA样品扩大体积到500ul即加相应体积的双蒸水与DNA样品混合均匀，取500ul苯酚（吸取苯酚时注意要吸液面下面的部分）加入到样品中，颠倒混匀然后离心12000rpm/10分钟，轻轻吸取上清液放入一个新的离心管中，估算上清体积以便下一步操作。

②在新的离心管中加入1/2苯酚和1/2氯仿与异戊醇混合液颠倒混匀后离心（12000rpm/10分钟）

③再换一个新的离心管将上清放入其中并估算体积，加等体积（与上清的体积相等）的氯仿与异戊醇混合液颠倒混匀后离心（12000rpm/10分钟）

④再准备个新离心管将上清放入估算体积，加2倍体积的无水乙醇和1/10体积的醋酸钠颠倒混匀，放入-20°冰箱沉淀（10分钟～更长时间）。

⑤把沉淀好的样品离心（12000g/10分钟）倒掉上清用70%的乙醇清洗两遍，倒掉上清晒干。（注意：在洗涤过程中尽量保持DNA片段不要随着倒掉的液体流出防止DNA损失）

⑥将双蒸水预热到37℃，然后取相应体积的双蒸水加入到已经晒干的离心管中满满转动管壁使其充分溶解。

3、测OD（方法同上第四条） 记录数据以便下一步研究。

九、琼脂糖凝胶电泳

琼脂糖凝胶电泳可以初步筛选大片段DNA及扩增后的DNA 1、配胶

根据DNA片段的大小选取不同浓度的凝胶，0.7%；1%；2%是比较常见的凝胶浓度，那么就以1%的凝胶为例进行说明。①用电子天平秤取琼脂糖1g放入烧杯中，在加入100ml电泳液，轻轻摇晃使其混合均匀让后电炉上加热使其充分融化取下放在操作台上冷却2～5分钟。根据样品的多少选取不同的梳子及胶版②取2ulEB加入到烧杯中摇晃均匀之后缓缓倒入准备好的胶版中待冷凝以后便可使用。

2、点样

点样的过程实际就是把需要检测的DNA通过染色、沉淀到凝胶孔中的过程，把冷凝好的凝胶放进电泳槽中使液面完全浸没凝胶等待点样，这一过程所需的试剂：①6×Loading Buffer或10×Loading Buffer 等，另外还需要一个对比1kb mark或DL2000（大片段时用1kb Mark，小片段用DL2000）。②6×Loading Buffer的用法一般是1体积的Loading Buffer可以沉淀5体积的DNA，10×Loading Buffer就是1体积的Loading Buffer可以沉淀9体积的DNA依此类推。③取相应体积的DNA和Loading Buffe混合均匀用移液枪加入到凝胶孔中（每个孔只能放一个DNA）。

3、电泳

检查电泳仪的电路，放上两极打开电源调整电压（电压一般在80—120v之间为宜）之后电泳开始，等凝胶上最前面一条带跑到凝胶的1/2或者1/2多一点时电泳停止取出后等待照相。

4、照相

①打开相机电源预热，打开电脑运行Lab软件

②放置凝胶，把跑好的凝胶放在仪器的载物台上对正

③点击Lab软件中实验协议选项选择琼脂糖凝胶电泳，然后点击放置凝胶选项调整

合适大小奇偶点击运行实验协议开始照相，完成后分析图像数据并将文件导出以便储存发布电泳过程结束。

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