蛋白质组学 TAP技术在生命科学中的重要意义 - 图文

TAP技术在生命科学中的重要意义

陈戬

第三军医大学全军免疫学研究所 重庆 400038

摘要：TAP（串联亲和纯化）技术是一种在生理条件下采用两步亲和纯化来分离蛋白质复合物的技术，尽管这种技术在酵母细胞体系中已经得到了广泛的应用，但在哺乳细胞体系中这种技术的应用却十分的局限，本文主要就TAP技术的原理、TAP标签的种类、TAP技术在哺乳动物细胞体系中的运用以及目前取得的重要进展四个方面进行阐述，揭示了TAP技术在分离、鉴定蛋白复合体过程中的重要应用。

关键词：TAP技术 哺乳细胞 蛋白质相互作用 标签

众所周知，细胞的功能是通过大量不同的蛋白质相互协调作用而体现出来的，随着时间和空间的不同，蛋白与蛋白之间也存在着不同的交互作用以满足细胞的需求，因此分析研究蛋白质复合物的构成及其之间的相互作用对于从以往基因型的研究过渡到显型的研究十分重要，因此TAP技术应运而生，TAP技术最早运用于生理条件下酵母细胞中蛋白质复合物的纯化，而后由于在高等生物中难以进行原位蛋白的标记以及存在内源蛋白的干扰，TAP技术的发展曾一时受到一定程度的限制。随着TAP技术的不断更新和TAP标签的日益发展， TAP技术已日趋成熟并很容易标准化，为以后研究无论是在原核生物或真核生物蛋白质相互作用中提供了有力的支撑和平台。 一． TAP技术的原理

TAP技术包括向把蛋白融合TAP标签以及将其转染至宿主细胞，通过基因工程给被分离纯化蛋白的一端加一个TAP标签，该标签由IgG结合结构域（ProtA）及一个钙调蛋白结合多(CBP)组成，结构域与多肽之间由一个TEV蛋白酶切位点隔开。通过基因重组将细胞内源性的目标蛋白基因置换为带有TAP标签的基因，温和裂解细胞，获取细胞抽提物，将抽提物加入IgG亲和柱，TAP标签的ProtA端会与IgG形成强结合，在用洗脱液洗脱掉大部分非特异性结合物和杂蛋白后，再用含有TEV蛋白酶的洗脱夜将蛋白质复合体切割下来。在钙离子参与下，被切割下来带有CBP的蛋白质复合体与钙调蛋白紧密结合，充分洗脱，就可以进一步去除非特异作用的蛋白质杂质，最后纯化出高纯度的目的蛋白复合体。大体上利用TAP技术研究蛋白质复合体的流程图为：

构建稳定表达带TAP标签的融合蛋白细胞株

↓ 细胞培养 ↓ 裂解细胞 ↓

串联亲和纯化（得到复合体，TAP技术）

↓

SDS-PAGE分离（复合体被打碎并分离）

↓ 质谱鉴定

TAP技术的流程示意图：

可以说，与传统的研究蛋白质相互作用的技术相比，TAP技术具有周期短、假阳性结果少等优点。通过这种方法鉴定出的蛋白质相互作用能真实地反映细胞中蛋白质分子之间的联系，实验结果更加接近真实情况，而且TAP技术还特别适用于蛋白质组水平上的大规模研究。 二． TAP标签的结构、种类及应用

我们知道，每一种蛋白都有其特殊的生化和物理特性，所以我们可以根据蛋白的不同特性对蛋白质进行纯化和分离，然而这样的纯化和分离工作是大量的、复杂的，那么就要求在保证能够获得足够量的复合体基本组分的前提下纯化和分离的过程是通用的、可重复的、可比的，那么如果将多个标签、短肽或者蛋白结构域串联后与所要研究的蛋白N端或C端融合，在表达以后进行亲和纯化就能达到这个目的。由此可以看出在TAP技术中如何运用好标签至关重要，不同的蛋白复合物可以选择不同的标签进行标记，常用的TAP标签包括括FLAG标签、金黄色葡萄球菌蛋白A(ProtA)的2个IgG结合单位、Strep标签、His标签、钙调蛋白结合肽(calmodulin-binding peptide，CBP)以及角质素结合结构域(chitin-binding domain，CBD)等等，但仅有ProtA和CBP标签能以融合蛋白的形式，低浓度存在于复合体中的情况下获得有效的回收。但实际上，其他的一些亲和标签也被应用在串联亲和纯化技术中，如Martinez等在研究STAGA复合体时使用的是FLAG-HA串联标[1]Knuesel等[2]则构建了用于哺乳动物的

反转录病毒TAP载体，考虑到CBP会与细胞中的很多内源蛋白结合，所以用FLAG替代了CBP，使用的是ProtA-FLAG串联标签。不过，用FLAG标签不仅会把大量Flag抗体带入回收产物中，需要进一步去除处理，而且成本高。另外，标签的数目也不仅限于2种，Honey等[3]构建了一种多亲和纯化(multiple affinity purification，MAFT)标签CBP-His6-HA3 (CHH)，并将其用于识别与cyclin2CDK复合体相关的蛋白。这说明在TAP技术中标签的选择并非如此局限，目前使用较多的仍然是ProtA-CBP串联标签。尽管如此，国外有报道称链球菌蛋白G的2个IgG结合单位和链霉抗生物素蛋白结合肽（streptavidin-binding peptide，SBP）组成的GS-TAP串联标签较之ProtA-CBP串联标签在初始物的用量、细胞材料的获取上以及在TEV蛋白酶切割后对诱饵回收再利用方面有着明显的优越性，使得分离的流程变得更加简单和经济。

三、TAP技术在哺乳细胞体系中的应用及意义

虽然TAP技术已经能对酵母、大肠杆菌、植物、果蝇等生物体系中蛋白质的相互作用进行大规模的研究，但在哺乳动物细胞体系中却一直受到很大的限制，因为在不同的生物体系中，串联亲和纯化技术的区别主要在于融合蛋白的表达，由于在哺乳动物中难以进行原位蛋白的标记以及存在内源蛋白的干扰再加上哺乳动物细胞同源重组效率较低，所以在一定程度上TAP技术在哺乳动物细胞体系中的运用较为局限，目前人们常常将融合基因构建到载体上，用转染的手段将其导入到动物细胞系中。但是转染的直接影响就是融合蛋白的异常高表达，这往往引起细胞生理活动的异变，过量的蛋白质也会引起不正常的折叠，细胞定位的变化和细胞应激反应等大量的假阳性相互作用的产生，需要更多的验证[4]。Forler等[5]在果蝇细胞体系中率先尝试RNA干扰（RNAi）与TAP技术相结合，建立了iTAP技术，运用这种技术在很大程度上解决了这个问题，RNA干扰是指一些段片段的双链RNA引发转录后基因静默的机制，通过特异的阻断体内特定基因表达，诱使细胞表现出特定基因的缺失表型。实验时只需用TAP技术对目的蛋白参与形成的复合物进行纯化数天，将其反义RNA分子导入，阻止与目的蛋白相应的内源性蛋白的表达即可，由于目的蛋白是通过转染外源cDNA进入细胞表达的，因而不会受RNA分子的影响而顺利表达，Forler他们的做法就是选择与果蝇中相应蛋白质同源的人类蛋白质作为诱饵，然后用dsRNA沉默果蝇内源蛋白质的表达，从而使目的蛋白的表达不受影响。Bouwmeester等[6]则采取另外一种策略，在通过TAP技术得到TNFα/NF-κB信号通路蛋白质-蛋白质相互作用的物理图谱后，使用RNAi技术对这些蛋白质参与TNFα/NF-κB信号通路的真实性和蛋白质的功能进行揭示，从而得到功能图谱。通过这些方法均能对哺乳动物中蛋白之间的相互作用进行认识和分析，不仅从整体角度了解蛋白质之间如何进行功能的整合执行特定的生理过程，还可以辅助发现新的蛋白质，通过蛋白质之间相互作用的关系揭示蛋白质新的功能，从疾病治疗的层次上讲揭示蛋白质的功能以及它们之间的相互作用能对细胞的生命过程、疾病的发生和治疗靶点的选择做出有意义的提示。与此同时，随着酵母双杂交技术的不断成熟，TAP技术能与之进行互补对进一步了解蛋白质之间的更高层次的关系有着重要的意义。 四．展望

目前，TAP技术与质谱技术的联用，以及质谱技术的自动化，使得大规模地分析相互作用的蛋白质在技术上成为可能[7]，尤其是在酵母菌和人细胞系中的大规模应用已成为大规模蛋白质相互作用研究领域的一个重要组成部分，通过这种技术可以全方位的向人们展示细胞内蛋白质复合体之间的相互作用的网络图。这对我们准确理解蛋白质功能，揭开各种细胞运营生命奥秘再次搭建了一个重要的信息平台，其应用的前景会越来越广阔。然而，尽管这种技术已经成功的应用在了哺乳细胞之中，但是同样的也具有一定的局限性，比如在运用TAP

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技术分离纯化蛋白质的进程中效率偏低，导致需要大量的初始细胞（5×10－1×10）；此外，现目前TAP技术的运用也有着一定的局限性它并不能运用于所有不同种类的细胞之中，

比如一些高分化的细胞（神经元细胞和免疫细胞）；再有就是细胞原料有效性的限制使得在TAP中原代细胞的量不容易控制。但是随着科技的日益更新特别是生命科学的不断发展，TAP的这些局限一定会有所突破，毕竟TAP技术在研究蛋白质的相互作用的各个方面都比传统方法有所突破，能更加真实的反映细胞内部客观世界。这项技术同时也向人们展示了细胞内部蛋白质分子之间的相互作用网络，进一步加深了人们对于蛋白质如何执行细胞功能的认识，如果将细胞比做一个社会那么细胞中的每一个蛋白质就是社会中的成员，它们之间如同人一样发生着各式各样，惟妙惟肖的关系，我们倘若了解它们之间的内在关联，也就对破解生命密码又近了一步，而TAP技术就像是我们捕捉蛋白质成员相互关系的工具，因此必定将起着越来越重要的作用。

参考文献

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