组织块石蜡包埋

组织块石蜡包埋的步骤：

1. 取材：尽量活杀，在处死30min内取材完毕，组织块的大小一般为（1.0-1.5cm）

*1.0cm*(0.2-0.3cm) 2. 固定：常用甲醛液浓度为4%，是40%甲醛溶液和水按1:9比例配制而成。固定时间

以12-24h为宜。（4℃冰箱可放置1-3个月） 3. 冲洗：将组织块放在固定的容器中用流水冲洗24h.

4. 脱水：一次70%酒精2h, 80%酒精2h, 90%酒精1h, 95%酒精40min,无水乙醇Ⅰ40min, 无水乙醇Ⅱ30min。可将组织放于70%酒精中过夜。 5. 透明：将脱水后组织直接浸入二甲苯透明剂中（二甲苯Ⅰ, 二甲苯Ⅱ），每次透明

为10min。 6. 浸蜡：常规制片常用熔点高于56℃以上的石蜡，普通采用56℃-58℃石蜡。先将组

织浸入软蜡Ⅰ1h左右, 再浸入软蜡Ⅱ40min；硬蜡Ⅰ40min, 硬蜡Ⅱ1h。（一般浸蜡时间为3-4h）软蜡熔点为45℃-50℃，硬蜡熔点为55℃-60℃。 7. 包埋：将蜡液注入包埋硬具中，迅速将组织块平放入蜡液中，摆正并铺平，然后移

至冷却台，使组织块同蜡液凝固在一起的过程。（硬蜡凝固定型）

石蜡切片法：

在切片前应先切去标本周围过多的石蜡（此过程称为“修块”），但也不能留得太少，否

则易造成组织破坏，连续切片时分片困难。一般切片厚度为4-6μm。

贴片时先在干净的载玻片上涂一层蛋白甘油，然后于60℃恒温箱中烘烤1h，若未烤干可适当延长时间；若组织剥脱可涂一层蛋清加以固定。 做免疫组化时，玻片应涂多聚赖氨酸，亦可买防脱玻片。

HE染色的步骤：

二甲苯Ⅰ5-10min→ 二甲苯Ⅱ5-10min→无水乙醇Ⅰ1-3min→无水乙醇Ⅱ1-3min→90%酒精1min→80%酒精1min→70%酒精1min→水洗→苏木精3-5min→水洗→盐酸酒精1-3s→水洗→饱和碳酸锂（氨水）10-30s→水洗→伊红3-5min→水洗（短）→70%酒精1-2s→80%酒精3-5min→90%酒精3-5min→95%酒精3-5min→无水乙醇5-10min→二甲苯Ⅰ3-5min→ 二甲苯Ⅱ3-5min→中性树胶封片

染色液的配制： 1.Harris苏木精的配制 苏木精 1g 硫酸铝钾 15g 无水乙醇 10ml 蒸馏水 200ml

先用蒸馏水加热溶解硫酸铝钾，用无水乙醇溶解苏木精再倒入已溶解的硫酸铝钾蒸馏水中，煮沸1min后，稍冷却，慢慢加入红色氧化汞0.5g，继续加热至染液变为紫红色，用纱布盖瓶口，用滤纸过滤后每100ml加冰醋酸5ml。 2.伊红的配制 伊红 1g

90%酒精 100ml

先将伊红溶于酒精中，用玻璃棒研碎溶解后，每100ml加冰醋酸1滴。 3.盐酸酒精分化液的配制： 浓盐酸 0.1-1ml 75%酒精 99ml

免疫组化实验步骤：

常规石蜡水化，将石蜡切片浸于二甲苯中5min,三次。取出切片置于无水乙醇中2次，每次3min；90%酒精、80%酒精、70%酒精，各三次。取出置于蒸馏水中。

1.取出蒸馏水中的切片，甩干并擦干切片上组织周围的液体，平放于湿盒中，滴加过氧化物酶阻断剂（常用0.3%过氧化氢）于组织上避光孵育15min。蒸馏水冲洗，再将切片置于TBS或PBS缓冲液中，浸泡5min，三次。取出切片，甩干并擦干切片上组织周围的液体，平放于湿盒中。

2.滴加50-100μl一抗工作液于组织上，室温孵育2-3h，用PBS冲洗切片。将切片置于TBS或PBS缓冲液中，浸泡5min，三次。取出切片，甩干并擦干切片上组织周围的液体，平放于湿盒中。

3.滴加50-100μlA液于组织上，室温孵育30min，用PBS冲洗切片。将切片置于TBS或PBS缓冲液中，浸泡5min，三次。取出切片，甩干并擦干切片上组织周围的液体，平放于湿盒中。

4.滴加预备好的显色剂DAB工作液50-100μl，室温孵育5-10min，或光镜下控制显色。显色完全后，用蒸馏水冲洗终止显色。

5.需要时，苏木精复染，盐酸酒精分化1-2s，水洗。

6.各级酒精（70%、80%、90%、无水乙醇Ⅰ、无水乙醇Ⅱ）脱水，每级3min,取出切片置入二甲苯5min，三次。 7.用中性树胶封片。

SABC试剂盒组分：

A chemMateEn Vision +/HRP, 兔、小鼠 1×5ml B DAB缓冲稀释液 2×6.25ml C DAB原液 1×0.25ml DAB工作液的配制：

实验前按每毫升B液（DAB稀释液）中加1滴（或20微升）C液(DAB原液)的浓度配制所需要的用量，混合后备用。 PBS缓冲液配制： 1×PBS（1000ml） Nacl(137mM) 4g Kcl(2.7mM) 0.1g Na2HPO4(10mM) 0.72g K2HPO4(2mM) 0.12g

TM

5×PBS（500ml） Nacl(137mM) 10g Kcl(2.7mM) 0.25g Na2HPO4(10mM) 1.8g K2HPO4(2mM) 0.3g

TGF 1:50-1:200 1:100 孵育3h MMP 1:50-1:200 1:100 孵育3h 二抗 羊抗兔 1:400

组织RNA提取：

1.称取子宫肌瘤和瘤旁组织50-100mg，放入3.5mmRNase Free dish 中，先加入4℃预冷的Trizol500μl，用眼科剪（RNase Free：用3%双氧水或氯仿浸泡30min，或用DEPC水 浸泡12h）将组织尽可能剪碎，再加入500μlTrizol，混匀后转入RNase Free EP管中。

2.室温放置5min，加入4℃预冷的氯仿0.2ml/mlTrizol,颠倒混匀（可剧烈），要充分至出现均匀乳糜状为止，然后静置5min，4℃，14000rpm×15min。

3.小心收集上层水相约600μl，置于另一个EP管（RNase Free）中，避免吸到中间层和有机相。 4.加入500μl预冷的异丙醇（0.5ml异丙醇/mlTrizol）,颠倒混匀3-5次，-20℃放置1h或室温静置10min。 5. 4℃，12000rpm×15min，离心后能看到少许沉淀附于EP管底部，弃上清，用滤纸吸干管口的余液，倒置于滤纸上晾干1min。 6.加入1ml-20℃预冷的75%乙醇（含DEPC），洗涤RNA沉淀。4℃，12000rpm×5min。 7.弃上清，加入1ml-20℃预冷的无水乙醇，不要冲起沉淀，立即离心，4℃，12000rpm×5min。 8.弃上清，沉淀中即为总RNA，将EP管倒置于滤纸上，空气中干燥10min，不能干燥过度。加入20μlRNase Free H2O溶解沉淀，分装5μl/管，-70℃冰箱保存。 9.总RNA的鉴定：1%琼脂糖电泳鉴定总RNA，观察出现条带的完整性来判断RNA是否降解。核酸蛋白测定仪测定RNA的含量和纯度。 1%琼脂糖电泳制胶：

15ml 0.5×TBE+0.125g琼脂糖+2.4μl核酸染料 上样：2μl 5×loading buffer +3μl样本+5μl DEPC水 150V 30min

测RNA含量:2μl样本+98μlDEPC水 TBE电泳缓冲液配制：10× PH7.0 T Tris碱 27g B 硼酸 13.75g E EDTA 7.44g

三蒸水 500ml RT-PCR步骤：

RT:1.按下列组成配制反转录反应液： ⑾ Mgcl2 2μl ⑻ 10×RT Buffer 1μl ⑸ RNase Free dH2O 3.75μl ⑽ dNTP mixture(各10mM) 1μl ⑵ RNase inhibitor 0.25μl ⑴ AMV Reverse Transcriptase 0.5μl ⑷ Oligo dT-Adaptor Primer 0.5μl 实验样品RNA（≤500ng total RNA） 1μl total 10μl/sample 按以下条件进行反转录反应(一个循环)

（30℃ 10min） 42℃ 99℃ 5℃-60℃ 15-30min 60min 5min 5min ℃ 5min ℃ 5min 配制PCR反应液 100-500bp ⑼ 5×PCR Buffer 10μl 灭菌蒸馏水 28.75μl ⑹ TakaRa Ex Taq HS 0.25μl 上游特异性PCR引物 0.5μl 下游特异性PCR引物 0.5μl cDNA 10μl total 50μl/sample 反应条件（25-35个循环）

94℃ 30sec 55℃-65℃ 30sec 72℃ 1min/kbp TmP 30c2Holds 1 Hid 3 ycles 99退火72724℃ 4℃ 4℃ 温度 ℃ ℃ 5330sec 1mi7∞

℃ 2. 42 95 5 PCR:1. 2.

min 0sec n min PCR凝胶电泳制胶：（1.5%）

15ml 0.5×TBE+0.225g琼脂糖+1.9μl核酸染料

上样：2μl 6×loading buffer +7μl样本+ 3μl灭菌蒸馏水

TGF- length 335 57.0℃

Sense 5′CAC AGT CCG CTA CTT CGT CC 3′20bp Anti-Sense 5′CCC TAA TGG CTT CCA CCC TC 3′20bp MMP11 length 409 56.9℃

Sense 5′TTC TAC ACC TTC CGC TAC CC 3′20bp Anti-Sense 5′GGA CTG GCT TCT CAC CAT CAT AT 3′23bp -actin length 592 56.0℃

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