细胞培养及无菌操作

你还在为没有做过细胞培养实验而烦恼吗？你还在为做细胞实验而痛苦吗？看了这个《细胞培养的有关名词及其概念》相信一定会释疑我的烦恼

细胞培养的有关名词及其概念

1．原代培养（primary culture）

直接从有机体中取出的细胞、组织或器官开始进行体外培养直到第一次传代为止。这种培养称之为原代培养。

2．传代培养（subculture）

细胞从一个培养皿以1：2或1：2以上的比率转移或移植到另一个器皿的培养，这种培养称之为传代培养。

3． 悬浮培养（suspension culture）

细胞培养的一种类型。培养时通过一特殊的装置，使细胞瓶按一定的速度不断地转动，使细胞始终处于悬浮状态中进行增殖。

4．克隆（clone）

克隆指的是从一个细胞靠有丝分裂获得的一个细胞群体（population）。

5．细胞系（cell line）

在第二届细胞和组织培养专题讨论会上提出细胞系的概念为“原代培养物经首次传代成功后即成为细胞系，由原先存在于原代培养物中的细胞世系（lineages of cells）所组成。如果不能继续传代或传代数有限，可称有限细胞系（finite cell line），如果可以连续传代，则可称为连续细胞系（continous cell line）。以前认为细胞系来自细胞发生了遗传突变，并带有癌变的特点，这种细胞有可能在培养条件下无限的传下去。这种细胞的特点是染色体为异倍体，丧失了正常细胞的“接触抑制”的特性。

6．细胞株（cell strain）

细胞株的概念如下：由原代培养中，用选择或克隆代，选出具有特征标记的细胞，经传代形成细胞株，这些特性或标记在以后的培养中必须保持下去。以前认为经体外传代培养后细胞不表现退化现象，大约可传50代以上者，其染色体维持二倍体不变，保留正常细胞的“接触抑制”等特性。

一 常用设备

一 准备室的设备：

双蒸馏水蒸馏器、酸缸、烤箱、高压锅、储品柜（放置未消毒物品）、储品柜（放置消毒过的物品）、包装台。配液室的设备：扭力天平和电子天平（称量药品）、PH计（测量培养用液PH值）、磁力搅拌器（配置溶液室搅拌溶液）。

二 培养室的设备：

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液氮罐、储品柜（存放杂物）、日光灯和紫外灯、空气净化器系统、低温冰箱（-80℃）、空调、二氧化碳缸瓶、边台（书写实验记录）。

必须放在无菌间的设备：离心机（收集细胞）、超净工作台、倒置显微镜、CO2孵箱（孵育培养物）、水浴锅、三氧消毒杀菌机、4℃冰箱（放置serum和培养用液）。

二 无菌操作

一 无菌室的灭菌：

1.定期打扫无菌室：每周打扫一次，先用自来水拖地、擦桌子、超净工作台等，然后用3‰来苏尔或者新洁尔灭或者

0.5％过氧乙酸擦拭。

2.CO2孵箱（培养箱）灭菌：先用3‰新洁尔灭擦拭，然后用75％酒精擦拭或者0.5％

过氧乙酸，再用紫外灯照射；

3.实验前灭菌：打开紫外灯、三氧杀菌机、空气净化器系统各20-30分钟；

4.实验后灭菌：用75％酒精（3‰新洁尔灭）擦拭超净台、边台、倒置显微镜的载物台。

二 实验人员的无菌准备：

1.肥皂洗手；

2.穿好隔离衣、带好隔离帽、口罩、放好拖鞋；

3.用75％酒精棉球擦净双手。

三 无菌操作的演示：

1.凡是带入超净工作台内的酒精、PBS、培养基、胰蛋白酶的瓶子均要用75％酒精擦拭瓶子的外

表面；

2.靠近酒精灯火焰操作；

3.器皿使用前必须过火灭菌；

4.继续使用的器皿（如瓶盖、滴管）要放在高处，使用时仍要过火；

5.各种操作要靠近酒精灯，动作要轻、准确，不能乱碰。如吸管不能碰到废液缸；

6.吸取两种以上的使用液时要注意更换吸管，防止交叉污染；

三 器械的清洗和消毒

玻璃器械洗消：

一、新的玻璃器皿的洗消：

1.自来水刷洗，除去灰尘。

2.烘干、泡盐酸：烤箱中烘干，然后再浸入5％稀盐酸中12小时以除去脏物、铅、砷等物。

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3.刷洗、烘干：12小时后立即用自来水冲洗，再用洗涤剂刷洗，自来水冲干净后用烤箱烘干。

4.泡酸、清洗：用清洁液（重铬酸钾120g：浓硫酸200ml：蒸馏水1000ml）浸泡12小时，然后从酸缸内捞出器皿用自来水冲洗15次，最后蒸馏水冲洗3-5次和用双蒸水过3次。

5.烘干、包装：洗干净后先烘干，然后用牛皮纸（油光纸）包装。

6.高压消毒：包装好的器皿装入高压锅内盖好盖子，打开开关和安全阀，当蒸气成直线上升时，关闭安全阀，当指针指向15磅时，维持20-30分钟。

7.高压消毒后烘干

二、旧的玻璃器皿的洗消：

1．刷洗、烘干：使用过的玻璃器皿可直接泡入来苏尔液或洗涤剂溶液中，泡过来苏尔溶液（洗涤剂）的器皿要用清

水刷洗干净，然后烘干。

1.泡酸、清洗：烘干后泡入清洁液（酸液），12小时后从酸缸内捞出器皿立即用自来水冲洗（避免蛋白质干涸后粘

附于玻璃上难以清洗），再用蒸馏水冲洗3次。

2.烘干、包装：洗干净的器皿烘干后取出用牛皮纸（油光纸）等包装，以便于消毒储存及防止灰尘和再次被污染。

3.高压消毒：包装好的器皿装入高压锅内，盖好盖子，打开开关和安全阀，随着温度的上升安全阀冒出蒸气，当蒸气成直线冒出3-5分钟后，关闭安全阀，气压表指数随之上升，当指针指向15磅时，调节电开关维持20-30分钟即可。（玻璃培养瓶消毒前可将胶帽轻轻盖上）

5.烘干备用：因为高压消毒后器皿会被蒸气打湿，所以要放入烤箱内烘干备用。金属器械洗消：金属器皿不能泡酸，洗消时可先用洗涤剂刷洗，后用自来水冲干净，然后用75％酒精擦拭，再用自来水，然后用蒸馏水冲洗，再烘干或空气中晾干。放入铝制盒内包装好在高压锅内15磅高压（30分钟）消毒，再烘干备用。

三、橡胶和塑料：

橡胶和制品通常处理方法是：先用洗涤剂洗刷干净，再分别用自来水和蒸馏水冲干净，再用烤箱烘干，然后根据不同品质进行如下的处理程序：

1 . 针式滤器帽不能泡酸液,用NaOH泡6-12小时,或者煮沸20分钟,在包装之前要装好滤膜两张，安装滤膜时注意光面朝上(凹向上)，然后将螺旋稍微拧松一些，放入铝盒中在高压锅内15磅30分钟消毒，再烘干备用。注意在超净台内取出使用时应该立即将螺旋旋紧。

2. 胶塞烘干后用2％氢氧化钠溶液煮沸30分钟（用过的胶塞只要用沸水处理30分钟），自来水洗净，烘干。然后再泡入盐酸液30分钟，再用自来水，蒸馏水，三蒸水洗净，烘干。最后装入铝盒内高压消毒，烘干备用。

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3. 胶帽，离心管帽烘干后只能在2％氢氧化钠溶液中浸泡6-12小时（切记时间不能过长），自来水洗净，烘干。然后再泡入盐酸液30分钟，再用自来水，蒸馏水，三蒸水洗净，烘干。最后装入铝盒内高压消毒，烘干备用。

4. 胶头可用75％酒精浸泡5分钟，然后紫外照射后使用即可。

5.塑料培养瓶，培养板，冻存管：

6.其他消毒方法：有的物品既不能干燥消毒，又不能蒸气消毒，可用70％酒精浸泡消毒。塑料培养皿打开盖子，放在超净台台面上，直接暴露在紫外线下消毒。也可用氧化乙烯消毒塑料制品，消毒后需要用2—3周时间洗除残留的氧化乙烯。用20000-100000rad的r射线消毒塑料制品效果最好。为了防止清洗器材已消毒与末消毒发生混淆，可在纸包装后，用密写墨水作好标记。其法即用沾水笔或毛笔沾以密写墨水，在包装纸上作一记号，平时这种墨水不带痕迹，一经高温，即出现字迹，从而可以判定它们是否消毒。密写墨水的配制：氯化钻(CoC12·6H2o)2g，30％盐酸10m1，蒸馏水88m1。

注意事项：

1.严格执行高压锅的操作规程：高压消毒时，先检查锅内是否有蒸馏水，以防高压时烧干，水不能过多因为其将使空气流畅受阻，会降低高压消毒效果。检查安全阀是否通畅，以防高压时爆炸。

2.安装滤膜时注意光面朝上：注意滤膜光滑一面是正面，要朝上，否则起不到过滤的作用。

3.注意人体的防护和器皿的完全浸泡：

A.泡酸时要戴耐酸手套，防止酸液溅起伤害人体。

B.从酸缸内捞取器皿时防止酸液溅到地面，会腐蚀地面。

C.器皿浸入酸液中要完全，不能留有气泡，以防止泡酸不彻底。

四 细胞培养用液的配制与消毒

器材与试剂：干粉型培养基、胰蛋白酶，青霉素、链霉素. 纯净水系统、电子天平、PH计、磁力搅拌器。

具体步骤：

一. 水的制备：

细胞培养用水必须非常纯净，不含有离子和其他的杂质。需要用新鲜的双蒸水、三蒸水或纯净水。

二.PBS的制备与消毒(也可用于其它BSS，如：Hanks，D-Hanks液的配制)：

1.溶解定容：将药品（NaCl 8.0g，KCl 0.2g，Na2HPO4·H2O 1.56g，KH2PO40. 2g ）倒入盛有双蒸水的烧杯中，玻璃棒搅动，充分溶解，然后把溶液倒入容量瓶中准确定容至1000ml，摇匀即成新配制的PBS溶液。

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2.移入溶液瓶内待消毒：将PBS倒入溶液瓶（大的吊针瓶）内，盖上胶帽，并插上针头放入高压锅内8磅消毒20分钟。注意高压消毒后要用灭菌蒸馏水补充蒸发掉的水份。

三. 胰蛋白酶溶液的配制与消毒：

胰蛋白酶的作用是使细胞间的蛋白质水解从而使细胞离散。不同的组织或者细胞对胰酶的作用反应不一样。胰酶分散细胞的活性还与其浓度、温度和作用时间有关，在pH为8.0、温度为37℃时，胰酶溶液的作用能力最强。使用胰酶时，应把握好浓度、温度和时间，以免消化过度造成细胞损伤。因Ca2+、Mg2+和血清、蛋白质克降低胰酶的活性，所以配制胰酶溶液时应选用不含Ca2+、Mg2+的BSS，如：D-Hanks液。终止消化时，可用含有血清培养液或者胰酶抑制剂终止胰酶对细胞的作用。

1.称取胰蛋白酶：按胰蛋白酶液浓度为0.25％，用电子天平准确称取粉剂溶入小烧杯中的双蒸水（若用双蒸水需要调PH到7.2左右）或PBS（D-hanks）液中。搅拌混匀，置于4℃内过夜。

2.用注射滤器抽滤消毒：配好的胰酶溶液要在超净台内用注射滤器（0.22微米微孔滤膜）抽滤除菌。然后分装成小

于-20℃保存以备使用。

四.青、链霉素溶液的配制与消毒

1. 所用纯净水（双蒸水）需要15磅高压20分钟灭菌。

2.具体操作均在超净台内完成。青霉素是80万单位/瓶，用注射器加4ml灭菌双蒸水。链霉素是100万单位/瓶，加5ml灭菌双蒸水，即每毫升各为20万单位。

3.使用时溶入培养液中，使青链霉素的浓度最终为100单位/ml。1单位＝1微克？

五.RPMI1640的制备与消毒：

1.溶解、调PH值、定容：先将培养基粉剂加入培养液体积2/3的双蒸水中,并用双蒸水冲洗包装袋2-3次(冲洗液一并加入培养基中),充分搅拌至粉剂全部溶解,并按照包装说明添加一定的药品.然后用注射器向培养基中加入配制好的青链霉素液各0.5ml, 使青链霉素的浓度最终各为100单位/ml。然后用一个当量的盐酸和NaOH调PH到7.2左右。最后定容至1000ml，摇匀。

2.安装蔡式滤器：安装时先装好支架，按规定放好滤膜，用螺丝将不锈钢滤器和支架连接好。然后卸下支架腿分别用布包好待消毒。

3.抽滤：配制好的培养液通常用滤器过滤除菌。通常用蔡式滤器在超净工作台内过滤。

4.分装：将过滤好的培养液分装入小瓶内置于4℃冰箱内待用。

5.使用前要向100ml培养液中加入1ml谷氨酰胺溶液（4℃时两周有效）。

六．血清的灭火：

细胞培养常用的是小牛血清，新买来的血清要在56℃水浴中灭火30分钟后，再经过抽滤方可加入培养基中使用。

七. HEPES溶液：

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HEPES的化学全称位羟乙基呱嗪乙硫磺酸（N’-a-hydroxythylpiperazine-N’- ethanesulfanic acid ）。对细胞无毒性作用。它是一种氢离子缓冲剂，能较长时间控制恒定的pH范围。使用终浓度为10-50mmol/L，一般培养液内含20mmol/LHEPES即可达到缓冲能力。

1mol/L HEPE缓冲液配制方法如下：准确称取HEPES 238.3g，加入新鲜三蒸水定容至1L。过滤除菌，分装后4℃保存。

注意：因为现在市售HEPES为约10g包装的小瓶，所以可根据实际情况灵活配制，但是要保证培养液内HEPES的终浓度仍然为20m mol/L。如：称取4.766克HEPES溶于20ml三蒸水中，过滤除菌后可完全（20ml）加入1L培养液中，或者每100ml培养液中加入2ml即可。

八.谷氨酰胺：

合成培养基中都含有较大量的谷氨酰胺，其作用非常重要，细胞需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白质，谷氨酰胺缺乏要导致细胞生长不良甚至死亡。在配制各种培养液中都应该补加一定量的谷氨酰胺。由于谷氨酰胺在溶液中很不稳定，4℃下放置1周可分解50％，故应单独配制，置于-20℃冰箱中保存，用前加入培养液。加有谷氨酰胺的培养液在4℃冰箱中储存2周以上时，应重新加入原来的谷氨酰胺。一般培养液中谷氨酰胺的含量为1～4mmol/L。可以配制200mmol/L谷氨酰胺液贮存，用时加入培养液。

配制方法为：谷氨酰胺2.922g溶于三蒸水加至100ml即配成200mmol/L的溶液，充分搅拌溶解后，过滤除菌，分装小瓶，-20℃保存，使用时可向100ml培养液中加入1ml谷氨酰胺溶液。

九.肝素溶液的配制：

含有肝素的培养液可以使内皮细胞纯度提高，肝素加入全培养液中最终浓度为50ug/ml。因为现在市售的多为肝素钠，包装为约为0.56克/瓶，配制时，可将其溶于100ml三蒸水中，定容，过夜，然后过滤除菌，分装小瓶，保存温度为℃。使用时，向100ml培养液中加入1ml（精确可加入0.9ml）即可。

十. Ⅰ型胶原酶：

0.1％Ⅰ型胶原酶溶液同胰蛋白酶一样配制和消毒灭菌。注意：因为Ⅰ型胶原酶分子颗粒比胰酶大，不容易过滤，因此可以用蔡式滤器过滤除菌。分装入10ml小瓶-20℃保存。

十一.明胶溶液：

因为明胶难于过滤，所以配制0.1％明胶溶液必须用无菌的PBS配制。所以制备过程中必须要注意无菌操作。首要的问题是如何无菌准确称量0.1克（配成100ml溶液）即解决无菌分装药品的问题。其次要注意即使是0. 1％的溶液，明胶也难溶，因此要充分摇匀，过夜放置，然后无菌分装入50ml小瓶中， 4℃保存。

注意事项：

1.配制溶液时必须用新鲜的蒸馏水。

2.安装蔡式滤器时通常使用孔径0.45微米 和0.22微米滤膜各一张，放置位置为0.45的位于0.22微米的滤膜上方，并且要特别注意滤膜光面朝上。

3.配制RPMI1640培养基时因为还要加入小牛血清，而小牛血清略偏酸性，为了保证培养液PH值最终为7.2，可在配制时调PH至7.4。

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五 细胞传代培养（消化法）

具体操作：

一. 传代前准备：

1.预热培养用液：把已经配制好的装有培养液、PBS液和胰蛋白酶的瓶子放入37℃水浴锅内预热。

2.用75％酒精擦拭经过紫外线照射的超净工作台和双手。

3.正确摆放使用的器械：保证足够的操作空间，不仅便于操作而且可减少污染。

4.点燃酒精灯：注意火焰不能太小。

5.准备好将要使用的消毒后的空培养瓶，放入微波炉内高火，8分钟再次消毒。

6.取出预热好的培养用液：取出已经预热好的培养用液，用酒精棉球擦拭好后方能放入超净台内。

7.从培养箱内取出细胞：注意取出细胞时要旋紧瓶盖，用酒精棉球擦拭显微镜的台面，再在镜下观察细胞。

8.打开瓶口：将各瓶口一一打开，同时要在酒精灯上烧口消毒。

二.胰蛋白酶消化；

1.加入消化液：小心吸出旧培养液，用PBS清洗（冲洗），加入适量消化液（胰蛋白酶液），注意消化液的量以盖住细胞最好，最佳消化温度是37℃。

2. 显微镜下观察细胞：倒置显微镜下观察消化细胞，若胞质回缩，细胞之间不再连接成片，表明此时细胞消化度。

3.吸弃消化液加入培养液：弃去胰蛋白酶液，注意更换吸管，加入新鲜的培养液。

三.吹打分散细胞：

1.吹打制悬：用滴管将已经消化细胞吹打成细胞悬液。

2.吸细胞悬液入离心管：将细胞悬液吸入10ml离心管中。

3.平衡离心：平衡后将离心管放入台式离心机中，以1000转/分钟离心6-8分钟。

4.弃上清液，加入新培养液：弃去上清液，加入2ml培养液，用滴管轻轻吹打细胞制成细胞悬液。

四.分装稀释细胞：

1.分装：将细胞悬液吸出分装至2-3个培养瓶中，加入适量培养基旋紧瓶盖。

2.显微镜下观察细胞：倒置显微镜下观察细胞量，必要是计数。注意密度过小会影响传代细胞的生长，传代细胞的密度应该不低于5×105/ml。最后要做好标记。

五.继续培养：

用酒精棉球擦拭培养瓶，适当旋松瓶盖，放入CO2培养箱中继续培养。传代细胞2小时后开始贴附在瓶壁上。当生长细胞铺展面积占培养瓶底面积25％时为一个＋，占50％为＋＋，占75％时为＋＋＋。

六.观察

细胞培养24小时后，即可进行观察，观察的重点如下:

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（1）培养物是否被污染，主要观察培养液颜色的变化及混浊度。如培养液变为黄色且混浊，表示已经被污染。

（2）细胞生长状况与培养液颜色的变化，如培养液变为紫红色，一般细胞生长不好。可能是瓶塞未盖紧或营养液p

H过高。

（3）培养液若变为桔红色，一般显示细胞生长良好。

经过1～2天的培养后，若细胞生长情况较差或培养液变红了，则可换一次营养液。换液时也要注意无菌操作，

在酒精灯旁，倒去原培养液，再加入等体积的新配营养液，pH7.0。若经2～3天后，细胞营养液变黄，此时表示

细胞已生长。如果希望细胞长得更好些，此时也可换液，换液时，所用的营养液称为维持液，它与营养液的组成完

全相同，仅所用血清为5％。以后，每隔3～4天（视细胞液pH值而定）更换一次维持液。待细胞已基本长成致密单

层时，此时即可进行传代培养。

（4）如细胞已生长，则要观察细胞的形态特征并判断其所处的生长阶段。观察时，可参照以下（※）的描述进行。

（5）观察完毕，可用台盘蓝染液对细胞进行染色。以确定死活细胞的比例。

※细胞的生长阶段及形态特征

传代培养的细胞需逐日进行观察，注意细胞有无污染，培养液颜色的变化及细胞生长的情况。一般单层培养的

细胞，从培养开始，经过生殖、繁殖、衰老及死亡的全过程。它是一个连续的生长过程，但为了观察及描述，人为

地将其分为5个时期，但各期间无明显绝对界限。现分别描述如下：

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A．游离期：当细胞经消化分散成单个细胞后，由于细胞原生质的收缩和表面张力以及细胞膜的弹性。所以，此时

细胞多为圆形，折光率高，此期可延续数小时。

B．吸附期（贴壁）：由于细胞的附壁特性，细胞悬液静置培养一段时间（约7～8h）后，便附着在瓶壁上（此期不

同细胞所需时间不同）。在显微镜下观察时可见瓶壁上有各种形态的细胞，如圆形、扁形、短菱形。细胞的特点，

大多立体感强，细胞内颗粒少，透明。

C．繁殖期：培养12h以后直到72h（不同细胞亦不同），细胞进入繁殖期，加速了细胞生长和分裂。此期包括由几

个细胞形成的细胞岛（即由少数细胞紧密聚集而呈现的孤立细胞群，常散在地分布瓶壁上），到细胞铺满整个瓶壁

（即所谓形成细胞单层）的过程。此期细胞形态为多角形（呈现上皮样细胞的特征）。细胞特点：透明，颗粒较

少，细胞间界限清楚，并可隐约见到细胞核。根据细胞所占瓶壁有效面积的百分率，又可将其生长状况分为四级。

以“＋”的多少表示如下：

＋：细胞占瓶壁有效面积（也就是细胞能生长的瓶壁面积）的25％以内有新生细胞。一般要观察3－5个视野内的细

胞生长状况，然后加以综合分析判断。

＋＋：细胞占瓶壁有效面积的25～75％以内具新生细胞。

＋＋＋：细胞占瓶壁有效面积的75～95％具新生细胞。细胞排列致密。但仍有空隙。 ＋＋＋＋细胞占瓶壁95％以上，细胞已长满或接近长满单层，细胞致密，透明度好。 从＋＋→＋＋＋＋为细胞的对数增长期（或称为指数增长期），

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D．维持期：当细胞形成良好单层后，细胞的生长与分裂都减缓，并逐渐停止生长，这种现象被称为细胞生长的接

触抑制。此时细胞界限逐渐模糊，细胞内颗粒逐渐增多，且透明度降低，立体感较差。由于代谢产物的不断积累，

维持液逐渐变酸。此时营养液已变为橙黄色或黄色。

E. 衰退期：由于溶液中营养的减少和日龄的增长，以及代谢产物的累积等因素，此时细胞间可出现空隙、细胞中颗

粒进一步增多，透明度更低，立体感很差。若将细胞经固定染色处理后，可见细胞中有大而多的脂肪滴及液泡。最

后，细胞皱缩，逐渐死亡，从瓶壁上脱落下来。 传代细胞培养注意事项：

1.严格的无菌操作；

2.适度消化：消化的时间受消化液的种类、配制时间、加入培养瓶中的量等诸多因素的影响，消化过程中应该注意

培养细胞形态的变化，一旦胞质回缩，连接变松散，或有成片浮起的迹象就要立即终止消化。 附：EDTA（0.02％乙二胺四乙酸二钠）消化液配方：

EDTA 0.20g、NaCl 8.00g、KCl 0.20g、KH2PO4 0.02g、葡萄糖 2.00g、0.5％酚红4ml，加入蒸馏水定容至1000

ml。10磅20min高压灭菌，使用时调节PH值到7.4。

注意：EDTA不能被血清中和，使用后培养瓶要彻底清洗，否则再培养时细胞容易脱壁。

六 细胞的复苏

细胞复苏的原则－快速融化：必须将冻存在-196℃液氮中的细胞快速融化至37℃，使细胞外冻存时的冰晶迅速融化，避免冰晶缓慢融化时进入细胞形成再结晶，对细胞造成损害。

一. 实验前准备：

1.将水浴锅预热至37℃；

2.用75％酒精擦拭超净工作台台面，紫外线照射30min；

3.在超净工作台中按次序摆放好消过毒的离心管、吸管、培养瓶等等。

二．取出冻存管：

1.根据细胞冻存记录按标签找到所需细胞的编号。

2.从液氮罐中取出细胞盒，取出所需的细胞，同时核对管外的编号。

三．迅速解冻：

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1.迅速将冻存管投入到已经预热的水浴锅中迅速解冻，并要不断的摇动，使管中的液体迅速融化。

2.约1-2min后冻存管内液体完全溶解，取出用酒精棉球擦拭冻存管的外壁，再拿入超净台内。

四.平衡离心：

用架盘天平平衡后，放入离心机中3000r/min 离心3min

五.制备细胞悬液：

1.吸弃上清液。

2.向离心管内加入10ml培养液，吹打制成细胞悬液。

六.细胞计数：

细胞浓度以5×105/ml为宜。

七.培养细胞

将复合细胞计数要求的细胞悬液分装入培养瓶内，将培养瓶放入37℃和5％CO2的培养箱内2-4小时（或者24-48小时）后换液继续培养培养，换液的时间由细胞情况而定。

初学者易犯错误：

1水浴锅未预热或者未预热到37℃。

2.水浴锅内冻存管太多，导致传热不佳，使融化时间延长。

3.离心前忘记平衡，导致离心机损坏和细胞丢失。

4.一次复苏细胞过多，忘记更换吸头和吸管，导致细胞交叉污染。

七 细胞计数

实验原理：当待测细胞悬液中细胞均匀分布时，通过测定一定体积悬液中的细胞的数目，即可换算出每毫升细胞悬液中细胞的细胞数目。

一.准备工作：

取一瓶传代的细胞，按照《传代细胞培养（消化法）》中的传代方法繁殖细胞，待长成单层后以被使用。

二.细胞悬液制备：

细胞悬液的制备方法是用0.25％的胰蛋白酶液消化、PBS液洗涤后，加入培养液（或Hanks液或PBS等平衡盐溶液），吹打制成待测细胞悬液。

三.细胞计数：

1.盖好盖玻片：取一套血球计数板，将特制的盖玻片盖在血球计数槽上。

2.制备计数用的细胞悬液：用吸管吸5滴细胞悬液到一离心管中，加入5滴台盼蓝染液（0.4％）或苯胺黑，活细胞不会被染色，加入染液后就可以在显微镜下区别活细胞和死细胞。

3.将细胞悬液滴入计数板：将待测细胞悬液吹均匀，然后吸取少量悬液沿盖片边缘缓缓滴入，要保证盖片下充满悬液，注意盖片下不要有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中。

4.统计四个大格的细胞数：将血球计数板放于显微镜的低倍镜下观察，并移动计数板，当看到镜中出现计数方格后，数出四角的四个大铬（每个大格含有16个中铬）中没有被染液染上色的细胞数目。

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5.计算原细胞悬液的细胞数:按照下面公式计算细胞密度：

（细胞悬液的细胞数）/ml＝ （ 四个大格子细胞数/4) ×2×104

说明：公式中除以4因为计数了4个大格的细胞数；公式中乘以2因为细胞悬液于染液是1：1稀释；公式中乘以104因为计数板中每一个大格的体积为：1.0mm（长）×1.0mm（宽）×0.1mm（高）＝0.1mm3而 1ml＝1000mm3

四.细胞计数要点：

1.进行细胞计数时，要求悬液中细胞数目不低于104个/ml，如果细胞数目很少要进行离心再悬浮于少量培养液中；

2.要求细胞悬液中的细胞分散良好，否则影响计数准确性；

3.取样计数前，应充分混匀细胞悬液，尤其时多次取样计数时更要注意每次取样都要混匀，以求计数准确；

4.数细胞的原则是只数完整的细胞，若细胞聚集成团时，只按照一个细胞计算。如果细胞压在格线上时，则只计上线，不计下线，只计右线，不计左线。

5. 操作时，注意盖片下不能有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中，否则要重新计数。

五.初学者易犯的错误：

1. 计数前未将待测悬液吹打均匀。

2. 滴入细胞悬液时盖玻片下出现气泡。

3. 滴入悬液时的量太多，至使细胞悬液流入旁边的槽中。

六.本实验特殊试剂的配制：

4％台盼蓝母液：称取4克台盼蓝，加入少量蒸馏水研磨，加双蒸水至100毫升，用滤纸过滤，4℃保存。

工作液：使用时，用PBS稀释母液至0.4％即可。

八 细胞的冻存

一.冷冻培养基：

动物细胞冷冻保存时最常使用的冷冻培养基是含5-10%DMSO (dimethyl sulfoxide) 和90-95% 原来细胞生长用之新鲜培养基均匀混合之。注意：由于DMSO 稀释时会放出大量热能，故不可将DMSO 直接加入细胞液中， 必须使用前先行配制完成。（冷冻保存使用之DMSO等级，必须为Tissue culture grade之DMSO(如Sigma D2650)，其本身即为无菌状况， 第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中， 保存于4℃， 避免反复冷冻解冻造成DMSO之裂解而释出有害物质，并可减少污染之机会。若要过滤DMSO，则须使用耐DMSO之Nylon 材质滤膜。）

二. 冷冻保存：

（一）冷冻保存方法一：

1.先将冻存管放入4℃冰箱，约40min。

2.接着置于-20℃冰箱，约30-60min。

3.置于-80超低温冰箱中放置过夜。

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4.置于液氮罐中长期保存。

5.同时做好冻存记录，在自己的笔记本和冻存记录本上均要记录。

（二）冷冻保存方法二: 冷冻管置于已设定程序之可程序降温机中每分钟降1-3℃至-80℃以下，再放入液氮槽vapor phase长期储存。-20℃不可超过1小时，以防止冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入-80℃冰箱中，惟存活率稍微降低一些。

注意事项：

1.使用DMSO前，不需要进行高压灭菌，它本身就有灭菌的作用。高压灭菌反而会破华它的分子结构，以至于降低

冷冻保护效果。在常温下，DMSO对人体有害，故在配制时最好戴上手套操作。

2.不宜将冻存细胞放置在0℃～-60℃这一温度范围内过久，低温损伤主要发生在这一温度区内，是“危险温区”。

3.注意定期检查液氮罐内液氮量，及时添加。

九 影响离体细胞生长繁殖的一些因素

细胞生长、繁殖的最适条件是它们在机体内所处的条件，但如将组织、细胞从机体内取出，让其在离体条件下生存，那就必须模拟机体的环境。然而机体毕竟是太复杂了，所以在体外只能保证细胞生长，繁殖所需要的最基本因素，现简单介绍这些因素的作用。

1．培养基（液）：细胞培养所用的培养基主要是人工合成的。通常其主要成分含有氨基酸、维生素、糖类、无机盐、生长因子和其他的辅助物质。当然不同的组织和细胞对培养基成分的要求有所不同，因而进行培养时应区别对待，为其选择最适条件的配方。配制时应注意以下几点：

（1）水是细胞生命活动的重要因素之一，细胞培养用的各种液体都要用水配制。由于有毒物质和元素等即使含量很低也能引起细胞培养的失败，所以细胞中所用的水必须经过高度的纯化。通常使用的是三次蒸馏水或去离子水。

水质的好坏可用电导仪检测其电阻值，即水中离子的导电状况，越低的水含离子越少，电阻值也越高。一般以25 C时的欧姆（ ）/cm表示。细胞培养用水的电阻值一般选用100万欧以上的去离子水为宜。

（2）无机离子既是维护细胞生命所需要的成分，而且对维持一定的渗透压、缓冲和调节溶液的酸碱度等方面都起着重要的作用。所以在配制细胞培养液时，必须根据这几方面的需要，加入必需的一些无机盐类。就多数动物来说，所需的无机盐类有Na＋，K＋，Ca2＋，Mg2＋，Cl－，碳酸盐，磷酸盐等。它们彼此之间常保持一定的比例。破坏了这种关系，就会使培养的细胞受到损害。

（3）血清是细胞培养液中的重要成分之一。血清中含有丰富的营养物质，如蛋白质和核酸等，血清不仅为细胞的生长提供所必需的营养，还具有促生长能力。血清对细胞附着和生长均有明显的促进作用，并能中和有毒物质的毒性，使细胞不受到损伤。用于细胞培养的血清来源是多种的，如人血清、马血清、

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兔血清等。最常用的是牛血清。一般讲动物愈年轻，其血清愈有利于细胞生长，故成年牛血清不如犊牛的好。细胞培养中所用血清的质量会直接影响到细胞生长的状况。

（4）pH值对细胞生长有影响。来源不同的细胞，由于它们处于有机体的不同部位或器官，其所处外环境的pH值也不相同，所以在培养细胞时，应参考该细胞在机体内所处外环境的pH值配置适宜pH培养基（液）。一般以中性为好，刚开始培养的哺乳动物的细胞，pH在7.0左右较好，贴壁生长的细胞在pH7.2－7.4生长最好，以不超过pH6.8－7.6为宜。高于或低于此限度时，往往会引起细胞死亡。在细胞培养过程中，必须注意培养液pH值改变与细胞生长的关系，找出规律。在pH值变得不适于细胞生长时，应及时更换新的营养液。

2．温度：离体培养细胞一般要参考该种动物的体温设计培养时所用温度。通常哺乳动物的体温在37－38.5 C，禽类略高些，温度在39 C－40 C。因此，离体哺乳动物细胞培养的温度最适为37－38.5 C。在较低温度环境中，对细胞影响不大，但细胞对较高温度却比较敏感。

3．密度：密度是指细胞接种浓度。在细胞培养中，接种的细胞数目对细胞的生长状况有很大的影响。适宜的细胞浓度可以促进细胞的增殖。接种的细胞浓度过大或过小，均对细胞的增殖不利。尤其是原代细胞，其接种量与培养时细胞增殖的关系最大。一般接种的细胞（如肾细胞）数目以30－70万/ml为宜。

4．器皿的清洗：细胞培养所使用的器皿必须干净，所以在细胞培养工作中，器械的清洗是十分重要的，也是起关键性作用的工作，它直接影响到细胞培养的成败。

（1）新玻璃器皿的清洗步骤：先用自来水或肥皂水刷洗干净，放入洗液中过夜或浸泡几天，取出用自来水冲洗8至10次。然后，用蒸馏水洗3次，用去离子水（或三蒸馏水）洗2－3次，烤干、包装、灭菌。

（2)橡皮制品的清洗步骤：一般选用白皮橡皮塞，使用前先用自来水洗涮干净，以后用2％NaOH煮20分钟，用自来水冲洗5－6次，再用1.3％HCl煮30分钟，用自来水冲洗5－6次，用蒸馏水洗3次，最后用去离子水洗，干后包装灭菌。

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