miRNA_21对其靶基因PTEN在前列腺癌中表达调控机制的研究

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现代预防医学2013年第40卷第6期ModernPreventiveMedicine，2013，Vol.40，NO.6

·实验技术及其应用·

ｍｉＲＮＡ－２１对其靶基因ＰＴＥＮ在前列腺癌中表达调控机制的研究

肖黎1，金艳阳2，佟明2

（1.辽宁医学院，辽宁锦州121001；2.辽宁医学院附属第一医院泌尿外科）

摘要：目的观察前列腺癌组织和细胞中miRNA-21和PTEN的表达情况，探讨miRNA-21对PTEN的调控。方法应

用实时荧光定量PCR和Westernblot检测正常前列腺组织、前列腺癌组织、非依赖性前列腺癌PC-3细胞中miRNA-21和PTEN的mRNA表和蛋白质表达水平。在前列腺癌PC-3细胞中通过转染miRNA-21inhibitor成功抑制MiRNA-21表达后，实时荧光定量PCR和Westernblot检测PC-3细胞中PTEN表达水平。结果对表达量为（0.421±0.166），明显高于正常前列腺组织（0.033±0.018）

miRNA-21在前列腺癌组织中的相

（t=6.6，P﹤0.05）。miRNA-21inhibitor转染

PC3细胞后miRNA-21在空白组、转染组和阴性对照组的相对表达量分别为（0.516±0.213）、（0.117±0.044）、（0.392±0.171），转染组与空白组及阴性对照组比较差异有统学意义（F=13.1，q=7.05、4.89，P﹤0.05）。PTENmR-NA在正常前列腺组织、前列腺癌组织的相对表达量分别为（1.534±0.385）、（0.376±0.232），正常前列腺组织高于前列腺癌组织差异有统计学意义（t=5.8，P﹤0.05）；PTEN蛋白在正常前列腺组织、前列腺癌组织中的相对表达量分别为（2.010±0.386）和（0.571±0.143），差异有统计学意义（t=12.3，P﹤0.05）。miRNA-21inhibitor转染PC-3细胞后，PTENmRNA在空白组、转染组和阴性对照组组织中的表达差异不显著，但其蛋白的相对表达量分别为（0.399±0.185）、（0.826±0.197）、（0.442±0.149），转染组与空白组及阴性对照组比较差异有统学意义（F=13.9，q=4.79、4.2，P﹤0.05）。结论前列腺癌组织中miRNA-21的表达上调，在转录后水平抑制PTEN表达，miRNA-21有可能成为

前列腺癌治疗的新靶点。

关键词：前列腺癌；miRNA-21；PTEN

中图分类号：R737.25

文献标志码：A

文章编号：1003-8507（2013）06-1112-04

ThestudyofexpressionandregulatoryroleofmicroRNA-21（miR-21）on

PTENinprostatecancer

XIAOLi*，JINYan-yang，TONGMing.

*LiaoningMedicalUniversity，Jinzhou，Liaoning121001，China

Abstract：OBJECTIVEToinvestigatetheexpressionandregulatoryroleofmicroRNA-21（miR-21）onPTENanditsroleinprostatecancer.METHODSmiR-21andPTENmRNAexpressioninnormaltissue，prostatecancertissueandprostatecancercells（PC3）weretestedbyquantitativereal-timePCR.PTENproteinexpressionwastestedbywesternblot（WB）.Successful-lytransfectedwithmiRNAinhibitionMiR-21expressioninPC-3cellsofprostatecancer，real-timePCRandWesternblot，thelevelofexpressionofPTENinPC-3cells，andthentheexpressionchangesofPTENmRNAandproteinweretestedbyPCRandWB.RESULTSmiR-21wasup-regulatedby11.7multiplesinprostatecancercomparedtonormalprostatetissues.Where-astheexpressionofPTENmRNAandproteindecreasedinprostatecancertissuescomparedwithnormalprostatetissues.ItpromptedthatthemiR-21andPTENwasnegativeiycorrelative.NOobviousdifferencewasfoundamongPTENmRNAaftermiR-21inhibiortransfectionintheorganizationoftheblankgroup，transfectiongroupandnegativecontrolgroup，whereitsrelativeproteinexpressionlevelshadobviousdifference.CONCLUSIONThePTENabnormallow-expressionmaypalyakeyroleinprostatecancerduetothethemiR-21up-regulation.Keywords：Prostatecancer；MicroRNA-21；PTEN

前列腺癌的发生发展涉及一系列的基因组的改变，抑癌基因PTEN（phosphataseandtensinhomologue）丢失在前列腺癌

作者简介：肖黎（1985-），男，硕士，住院医师，研究方向：前列腺

癌相关研究

通讯作者：佟明，博士，教授，主任医师，研究方向：泌尿系肿瘤治

疗及发病机制相关研究，E-mail：Dongmingmir@

的发生及进展中起关键的调控作用［1，2］。miRNA（microrRNA）广泛存在于动植物中，它对生物体生长发育和分化调控起着重要作用，其失衡表达亦可促进多种肿瘤的发生发展［3］；大样本筛查证实miRNA-21在多种实体肿瘤中均出现高表达现象［4］。

miRNA-21的高表达可以提高前列腺癌细胞的凋亡抵抗、活力及侵袭力［5］，而以前的研究也证实下调miRNA-21在前列腺癌表达后，细胞增殖能力减弱。本研究旨在探讨miRNA-21对抑

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癌基因PTEN在前列腺癌中可能的调控作用。2000转染试剂（美国Invitrogen公司）说明书进行。24h后提

取PTEN总RNA进行实时PCR反应，48h后提取蛋白质进行

1材料与方法1.1材料1.1.1

组织及细胞收集

Westernblot检测。1.2.4统计学方法

11份正常前列腺组织、6份前列腺癌

采用SPSS18.0统计软件进行数据分析。

实验所得数据以均数±标准差（±s）表示；独立样本采用t检验；单因素方差分析采用SNK-q进行多样本均数的两两比较。以P﹤0.05为差异有统计学意义。

组织均取自本院电切手术或前列腺穿刺标本并经病理证实。全部病例术前均未接受放化疗，标本采集后迅速放至液氮中冷冻，-80℃。前列腺癌PC-3系细胞（中国医学科学院基础医学研究所细胞中心），用含有10%的胎牛血清的RPMI1640培养基（美国Gibco公司），37℃温箱培养，隔日换液。

2结果

2.1miRNA-21和PTEN的表达

miRNA-21在正常前列腺组织、前列腺癌组织中的相对表达量分别为（0.033±0.018）和（0.421±0.166），正常前列腺

组织低于前列腺癌组织差异有统计学意义（t=-6.6，P﹤

1.2方法

1.2.1RT-PCR

Trizol法提取细胞及组织中的总RNA，紫外

分光光度计检测总RNA的吸光度A260和A280值，并保证

A260／A280比值为1.8～2.1以控制其纯度。取2μg总RNA作

为模板，miRNA-21、U6及编码基因PTEN的逆转录反应体系：2.5mmol／LdNTP2μl，1μmol／L逆转录引物1μl，4U／

0.05），表明miRNA-21在前列腺癌中高表达，见图1。PTENmRNA在正常前列腺组织、前列腺癌组织的相对表达量分别为（1.534±0.385）、（0.376±0.232），正常前列腺组织高于前列

腺癌组织，差异有统计学意义（t=5.8，P﹤0.05），见表2。

μlQuant反转录酶（Takara公司）1μl，5×逆转录酶缓冲液4μl，加无RNA酶水至反应体积为20μl。37℃温浴60min，95℃5min，收集cDNA，-20℃保存。miRNA-21茎环状逆转

录特异引物和miRNA内参照U6引物由Takara公司合成。

PTEN蛋白在正常前列腺组织、前列腺癌组织中的相对表达量分别为（2.010±0.386）和（0.571±0.143），差异有统计学意

义（t=12.3，P﹤0.05），见图2，3

。

miRNA-21及PTENPCR反应体系：取lμlcDNA为模板，SYBRGreenRealTimePCRMasterMix（Takara公司）9μl，上下游引物各2μl，无RNA酶水加至20μl。PCR反应参数：预

变性95℃30s（1次）；变性95℃10s退火60℃20s延伸

70℃2min（共30循环）；70℃10min延伸、补全。miRNA-21逆转录引物序列5'-GTGGTATCGAGAGCTGCGTG-GCAGGTATTCCCACTGGTTACGACTGAACA-3'；内参照U6引物序列5'-GTCGTATCGTGAGCAGCGTCCGAGGTATTCGCACTGGATAGCACAAAAATATG-3'。miRNA-21PCR反应的上下游

引物分别为5'-GCGCGCTAGCTTATCAAGCTGATG-3'和5'-

GTGCAGGCTCCGAGGT-3'；内参找U6的上下游引物5'-GCGCGTCGTGAAGCGTTC-3'和5'-GTGCAGGGTCCGAGG-3'。PTEN上、下游引物序列分别为5'-GAGGGAATAAACAC-CATG-3'和5'-AGGGGTAGTGAGTGACACAGTA-3'。内参照β-actin上下游引物序列分别为5'-CAGAGCCTCGCCTTTGCC-3'和5'-GTCGCCCACATAGGAATC-3'。按目的基因的表达量=2-△△Ct计算各个样本中的miRNA及mRNA的含量。△Ct=目的基因Ct值-内参基因的Ct值。

1.2.2Westernblot检测蛋白的表达将收集组织或细胞加入500μl裂解液［含150mmol／LNaCl、10mmol／LTris—HCI（pH7.5）、0.1％SDS、1％NP-40和蛋白酶抑制剂复合］中匀浆后超声波室温破碎10min，12000r／min离心10min，收集裂解物的总蛋白。BCA蛋白定量法测定蛋白质的浓度。取40μg总蛋白进行Westernblot，PTEN一抗为鼠抗人单克隆抗体（1︰300稀释，美国XYMED公司）及3-磷酸甘油脱氢酶

（GAPDH）一抗羊抗鼠（1︰400稀释，美国Promad公司）。辣根过氧化物酶偶联的二抗为羊抗鼠（1︰5000稀释，美国

图1mRNA-21

在不同前列腺组织中的表达

Abcam公司），按步骤进行曝光、显影及定影，然后扫描胶片，

用GENEGENIUS凝胶图像处理系统分析各条带谱带强度值。

1.2.3细胞转染取稳定生长的对数期PC3细胞，消化后以

图2

3×105／孔种植于6孔细胞培养板。设置空白组、转染组及阴性对照组。空白组加无血清培养基，转染组加50nmol／L的miRNA-21inhibitor（广州锐博公司），阴性对照组加入浓度为50nmol／L阴性对照剂（广州锐博公司），按Lipofectamine

PTEN在不同前列腺组织中的表达

2.2转染miRNA-21inhibitor后miRNA-21和PTEN的表达

miRNA-21inhibitor转染PC3细胞后miRNA-21在空白

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组、转染组和阴性对照组的相对表达量分别为（0.516±

0.213）、（0.117±0.044）、（0.392±0.171），转染组与空白

组及阴性对照组比较差异有统学意义（F=13.1，q=7.05、

4.89，P﹤0.05），而空白组与阴性对照组比较差异无统学意义

（q=2.19，P﹥0.05），表明转然后成功抑制了miRNA-21在

PC3细胞的表达，见图4；PTENmRNA空白组、转染组和阴性对照组的相对表达量分别为（0.474±0.188）、（0.491±0.289）、

（0.388±0.151），3组间表达差异无统计学意义（F=

图6

0.515，P﹥0.05）；PTEN蛋白在空白组、转染组和阴性对照组的相对表达量分别为（0.509±0.244）、（0.851±0.166）、

（0.422±0.191），转染组与空白组及阴性对照组比较差异有统学意义（F=9.7，q=5.92、4.79，P﹤0.05），而空白组与阴性对照组比较差异无统学意义（q=1.21，P﹥0.05），见图5、6

。

WesternBlot检测转染后PC3细胞中PTEN蛋白的表达

3讨论

miRNA是一类长度约21个核苷酸左右的非编码单链小分子RNA，通过特异性的识别靶mRNA的3＇-非翻译区（3＇-UTR）的方式参与生物体内各个阶段的表达调控，自发现以后

便引起了广泛的关注，特别是其在肿瘤发生发展中的调控机制是目前研究的热点［4～8］。鉴于miRNA和mRNA为非特异性的结合，一个miRNA可以有众多的靶向基因，一个靶向基因也可接受多个miRNA的调控［8，9］。目前miRNA-21已证明的靶向基因包括PTEN［10，11］，MARCKS（myristoylatedalanine-richprotein

kinasecsubstrate）［5］，TPM1（tumorsuppressorgenetropomyosinl）［12］，andprogrammedcelldeath4（programmedcelldeath4）［13］。Li［5］等的研究显示miRNA-21的高表达除增强前列腺癌细胞的

增殖和侵袭外，还在雄激素依赖性前列腺癌向非依赖性前列腺

图3

WesternBlot检测PTEN蛋白在不同前列腺癌组织中的

表达

癌的转化过程中起到非常重要的作用；Riabs［14］等随后通过小鼠模型实验证明了高表达miRNA-21促进前列腺癌的形成及癌细胞的增殖，并成功诱导前列腺癌激素非依赖表型的出现，这都提示miRNA-21在前列腺癌发生发展中起到重要作用。

PTEN是迄今发现的第一个具有双特异磷酸酶活性的抑癌基因［15］。PTEN基因编码的蛋白可以使三磷酸肌醇去磷酸化而负调节PI3K／AKT／mTOR通路。PTEN的功能缺失将使PI3K产物增加，直接导致信号蛋白AKT的持续活化，mTOR作为PI3K／Akt信号通路下游的一个效应分子，AKT激活使得mTOR信号途径的上调，引起细胞异常增殖［16］。mTOR是一个

丝氨酸和苏氨酸激酶，它的激活可以引起前列腺癌的发生和促进前列腺癌肿瘤的生长［3］。而Sircar［17］等对患者前列腺癌组织检测发现超过70%出现PTEN的丢失，并且这种丢失与前列腺癌的恶性程度相关。鉴于miRNA-21与PTEN在前列腺癌的发

图4

转染后PC3细胞各组中miRNA-21

的表达

生发展中都有重要作用，且miRNA-21相关的PTEN通路在肺癌［12］、肝癌［13］已被证明，推测miRNA-21的高表达也可能通过调控抑癌基因PTEN在前列腺癌中发挥作用。

为明确前列腺癌中miRNA-21是否通过调控PTEN发挥作用，本实验通过在PC3细胞中转染miRNA-21抑制剂成功抑制miRNA-21表达后，发现实验组PTEN蛋白表达量较对照组明显增高（P﹤0.05），而其mRNA表达与对照组无明显差异（P﹥0.05），表明PC3细胞中miRNA-21抑制PTEN的表达，即miRNA-21在转录后水平通过影响蛋白翻译作用于PTEN基因的表达；结合正常前列腺组织与前列腺癌组织中miRNA-21及PTEN的表达差异，证实了在前列腺癌中PTEN是miRNA-

21的下游靶基因，同时也表明miRNA-21在前列腺癌中高表达增强了其对抑癌基因PTEN表达的抑制，导致PTEN在前列

腺癌中的丢失而引起癌症的进一步发展。但由于实验条件的限制，miRNA-21的高表达与PTEN在前列腺癌中的丢失是否为

图5

转染后PC3各组中PTEN

表达

浓度依赖关系还有待进一步的研究。

综上所述，miRNA与其靶基因mRNA为非特异性的结合，

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导致miRNA-21不仅作用于MARCKS［5］，还通过调控PTEN在前列腺癌中发挥作用，而这种可以同时调控多个下游靶向因子的优势，使得miRNA-21可能成为未来前列腺癌靶向治疗的重要位点。参考文献

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收稿日期：2012-10-14

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《现代预防医学》论著的界定原则

本刊2008年起按专业分栏目，不再另设“论著”栏目

随着现代医学和其他相关学科的发展，医学论文的分类日趋专业化。近年来，国内外医学期刊越来越重视栏目设置的系统性、层次性、专业性与适用性，以便于作者投稿与读者选阅及检索。传统的“论著、短篇与摘要、综述、病案报道”等栏目设置方法已远远不能满足现代信息发展及检索的需要，按专业分栏目已经是国内外医学期刊的发展趋势。本刊从2008年起不再另设“论著”栏目，特此公告声明。

医学论文中“论著”的界定原则

在职称评审中，常常遇到如何确认职称申报者的文章是否属于“论著”的问题，现综合有关文献，对本刊“论著”的界定作一解释。论著是相对于短篇、病理报道、综述、经验交流等而言的一种论文体裁。目前国内尚无统一的届定标准和方法。本刊论著是指科研论文中，设计相关实验和调查的原创性文章，符合国际通用的温哥华论文格式，全文由中英文摘要、前言、材料（对象）与方法、结果、讨论及参考文献组成。中英文摘要为结构式摘要，包括目的，方法、结果、结论四要素，多数涉及统计学处理。凡符合上述条件的论文，本刊皆界定为论著，特此声明。

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