发酵培养基的优化

文献综述

发酵培养基的优化

申请学位： 院 （系）： 专 业： 姓 名： 学 号： 指导老师：

二 O 一 五 年 六 月 五 日

学士学位 药学院 生物技术 张永芳 114080107 张小华（讲师）

文献综述：

发酵培养基的优化

张永芳：114080107 指导老师：刘向勇

【摘要】：发酵，这一门悠久的技艺，在古今中外的生产生活与科学研究中扮

演着不可或缺的角色。在实验室发酵过程中,经常需要通过试验来寻找研究对象的变化规律,这些对象包括培养基的设计、工艺参数等;而这些变化规律的寻找就要通过科学的试验设计与数据分析来实现。通过对规律的研究达到各种实用的目的,比如提高产量、降低消耗、提高产品质量等,特别对于新菌种、新产品的试验。本文对发酵培养基优化的基本方向进行了综述,并比较了常用的试验设计与数据分析方法。

【关键词】：发酵、发酵培养基、优化、最优组合、响应面法优化 【内容】：

在工业化发酵生产中，发酵培养基的设计是十分重要的，因为培养基的成分对产物浓度、菌体生长都有重要的影响。培养基优化，是指面对特定的微生物，通过实验手段配比和筛选找到一种最适合其生长及发酵的培养基，在原来的基础上提高发酵产物的产量，以期达到生产最大发酵产物的目的。发酵培养基的优化在微生物产业化生产中举足轻重，是从实验室到工业生产的必要环节。能否设计出一个好的发酵培养基，是一个发酵产品工业化成功中非常重要的一步。目前，对培养基优化实验进行数学统计的方法很多，下面介绍几种目前应用较多的优化方法：

响应曲面分析法:Box和Wilson提出了利用因子设计来优化微生物产物生产过程的全面方法，Box-Wilson方法即现在的响应曲面法（(Response Surface Methodolog，简称RSM）。RSM是一种有效的统计技术，它是利用实验数据，通过建立数学模型来解决受多种因素影响的最优组合问题。通过对RSM的研究表明，研究工作者和产品生产者可以在更广泛的范围内考虑因素的组合，以及对响应值的预测，而均比一次次的单因素分析方法更有效。现在利用SAS软件可以很轻松地进行响应面分析。

改进单纯形优化法:单纯形优化法(Modified simplex method)是近年来应用较多的一种多因素优化方法。它是一种动态调优的方法，不受因素数的限制。由于单纯形法必须要先确定考察的因素，而且要等一个配方实验完后才能根据计算的结果进行下一次实验，因此主要适用于实验周期较短的细菌或重组工程发酵培养基的优化，以及不能大量实施的发酵罐培养条件的优化。

遗传算法:Genetic algorithm法是一种基于自然群体遗传演化机制的高效探索算法，它是美国学者Holland于1975年首先提出来的。它摒弃了传统的搜索方式，模拟自然界生物进化过程，采用人工进化的方式对目标空间进行随机化搜索。它将问题域中的可能解看作是群体的一个个体或染色体，并将每一个体编码

成符号串形式，模拟达尔文的遗传选择和自然淘汰的生物进化过程，对群体反复进行基于遗传学的操作(遗传，交叉和变异)，根据预定的目标适应度函数对每个个体进行评价，依据适者生存，优胜劣汰的进化规则，不断得到更优的群体，同时以全局并行搜索方式来搜索优化群体中的最优个体，求得满足要求的最优解。 1、 响应面法优化

1.1、响应面法优化畜禽用凝结芽孢杆菌发酵培养基

近年来抗生素作为饲料添加剂导致畜禽产品质量及环境药物残留等问题十分突出。微生态制剂已成为一种新型抗生素替代品，国家政策大力 支持其在畜禽养殖领域的推广应用。凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)是近年来益生菌领域研究热点，除具乳酸菌和双歧杆菌等保健功效外，还具抗逆性强、耐高温和易贮存等芽孢杆菌所具有的独特性，在国外已广泛应用于保健、医疗、食品和畜牧等领域。凝结芽孢杆菌在畜禽添加剂方面的应用报道日益增多，但有关其产业化方面的报道相对较少。

湖南省微生物研究所的高书锋、张德元、陈海荣、孙翔宇、周映华、胡新旭、周小玲、刘慧知通过Plackett—Burman试验对影响因子进行考察和评价，然后对关键影响因素进行最陡爬路径试验，进一步采用响应面法研究和探讨及其交互作用，获得最佳发酵培养基组成，为其产业化生产奠定基础。为了获得最佳发酵培养基，提高凝结芽孢杆菌液体发酵水平，在单因素试验优化基础上，采用Plackett—Burman设计确定淀粉、大豆粉和鱼粉混合物(质量比2：1)和磷酸氢二钾为凝结芽孢杆菌液体发酵水平的显著影响因素，通过最陡爬坡路径试验、中心组合设计和响应面分析法确定最优培养基组成。试验结果表明，最优培养基组成为淀粉10．6 g／L、大豆粉13．5 g／L、鱼粉6．7 g／L、磷酸氢二钾2．72 g／L、磷酸二氢钠0．312 g／L、碳酸钙0．2 g／L、一水硫酸锰0．169 g／I 硝酸钠0．34 g／L和七水硫酸镁0．74 g／I 。在最佳培养基组成条件下，液体发酵活茵数达67×10 CFU／mL。

1.2、响应面分析法优化乳糖酶发酵培养基

乳糖酶(Lactase)学名β-D-半乳糖苷半乳糖水解酶(8-D-galactoside galactohydrase)，能够水解β-D-半乳糖苷和 α-L-阿拉伯糖苷， 而催化乳糖的实用意义较大，故被研究得最多。牛乳和乳清中含有大量乳糖，它是乳制品中的主要碳水化合物，乳糖酶的存在是乳糖在人体内进行正常代谢的一个必要条件。如果数量缺少或活性不够，就会导致消化障碍 。近年来，对米曲霉、黑曲霉、脆壁酵母、乳酸酵母等菌株乳糖酶的研究报道较多。而对青霉乳糖酶的研究相对较少。

河北省微生物研究所的赵从波、章淑艳、罗同阳、李宾利用一株青霉菌发酵生产乳糖酶，为提高乳糖酶的酶活，采用PB设计和响应面法对其发酵条件进行研究，确定了最佳产酶条件，以期为乳糖酶的生产提供理论基础。采用Plackett-Burman设计分析液体发酵过程中影响乳糖酶活力的主要因素，利用最陡爬坡实验逼近响应区域，应用Box-behnken设计和响应面分析法优化发酵培养基。结果表明，葡萄糖、乳糖和玉米浆的质量浓度是影响乳糖酶酶活的主要因素；优化后的培养基为：葡萄糖36．2 g／L，乳糖6．7 g／L，蛋白胨6 g／L，玉米浆4．4 g／L，MgS04·7H2O 0．3 g／L，K2HPO4·3H20 0．5 g／L，KH2PO4 0．5 g／L， Tween-80 1．5 mL／L．乳糖酶的活力比优化前提高了32．3％。 1.3、响应面法优化绿色木霉H06产孢发酵培养基

香蕉枯萎病是由尖孢镰刀菌引起的一种毁灭性的土传病害．已严重危害到香

蕉的生产及香蕉产业。目前综合防控技术是香蕉枯萎病防治的主要手段，木霉(Trichoderm spp．)作为一种重要的植病生防菌一直受到普遍关注。绿色木霉菌 (Trichode viride)广泛地分布于自然界，可在多种营养基质上快速生长，对多种植物病原菌有重寄生作用，能有效地竞争营养和生存空间，还可以产生抗生素和攻击多种病原所需要的酶，所以被认为是一种很有开发潜力的生防菌。绿色木霉菌H06( T.viride)是中国热带农业科学院环境与植物保护研究所微生物资源研究与利用课题组从香蕉根际土壤中分离获得的拮抗镰刀菌的菌株，对香蕉枯萎病等植物病害有明显的防治效果，应用前景广阔。

中国热带农业科学院环境与植物保护研究所/农业部热带作物有害生物综合治理重点实验室/海南省热带农业有害生物检测与控制重点实验室的梁昌聪、刘磊、张建华、郭立佳、王伟伟、黄俊生采用响应面法对绿色木霉H06菌株产孢发酵培养基进行了优化。首先利用Plackett-Burman实验设计筛选出影响产孢的3个主要因素： 玉米粉、大豆粕和KH2PO 。在此基础上运用最陡爬坡路径法逼近最大响应值区域．最后利用响应面分析法确定主要因子之间的交互作用及最佳条件。结果表明， 蔗糖10 g／L、玉米粉12．75 g／L、NH4NO3 2 g／L、大豆粕4．65 g／L、MgSO4\、KH2PO4 3．32 g／L、H06最大理论孢子含量为3．29~ 10 个／mL 经3次平行实验验证．实际平均孢子含量与预测孢子含量相近，比之前的孢子含量提高了197％。

1.4、响应面法优化纳豆激酶固态发酵培养基

我国油菜籽产量居世界第一位，近年来产量持续增长，每年油菜籽制油后副产物菜籽粕高达600~700万吨，菜籽粕含有菜籽蛋白，菜籽多酚，植酸，菜籽多 糖等具有较高营养价值，通过微生物固态发酵菜籽粕中营养成分能够得到充分的利用，提高菜籽副产品利用率。固态发酵避免液态发酵投资大，成本高，污 染严重等弊端，更适宜于工业化生产。纳豆芽孢杆菌具有分解蛋白质、碳水化合物、脂肪等大分子物质能力，使发酵产品中富含氨基酸、有机酸、寡聚糖等多种易被人体吸收成分，纳豆芽孢杆菌产生纳豆激酶除可在体内溶解血栓外还可明显缩短优球蛋白溶解时间；同时能抵抗胰蛋白酶水解作用，在肠道内稳定性好，易被人体消化吸收；另外具有无毒副作用，体内半衰期长的优点，无论是将纳豆激 酶作为抗血栓药物，还是预防血栓栓塞性疾病保健食品都有十分重要的开发价值。

湖南农业大学食品科学技术学院食品科学与生物技术湖南省重点实验室、湖南省发酵食品工程技术研究中心的廖杰琼、陈力力、青文哲为优化以菜籽粕与麸皮为基质产纳豆激酶培养基组成，在单因素实验基础上，选择不同速效氮源、速效碳源、无机盐的种类及其添加量为自变量，纳豆激酶酶活为响应值，利用Box-Behnken中心组成设计原理，设计三因素三水平响应面试验，建立回归模型。经响应面分析，回归模型具有较高拟合度。结果显示优化后培养基组成为：菜籽粕：麸皮( W/W)=1：4基础培养基中，尿素添加量O．61 g／100g，葡萄糖添加量1．28 g／lOOg，氯化镁添加量0．64 g／100g，在初始pH 7．0，温度37℃条件下发酵48 h，纳豆激酶酶活达到7 329．76I U／g，较基础发酵培养基提高1．73倍。

2、其他优化方法

2.1、白酒丟糟饲料化的发酵培养基优化

我国是白酒生产大国，酒糟资源十分丰富。白酒丢糟由于酸度大，水分高，

易腐败变质，对于它的综合利用问题一直未能得到很好的解决，不仅造成资源浪费，又容易污染环境；同时我国是一个饲料资源严重短缺的大国，每年需从国外进口大量的鱼粉等蛋白饲料填补不足。利用微生物发酵白酒丢糟生产蛋白饲料，不仅可以解决蛋白饲料的严重不足、缓解人畜争粮的矛盾、促进畜牧业发展，还可促使我国的畜牧业结构从“精料型”向“节粮型”发展。

四川理工学院生物工程学院的郭志、明红梅、沈才萍、周建、肖倩研究了利用热带假丝酵母、黑曲霉、绿色木霉发酵白酒丢糟生产蛋白饲料。通过设计单因素实验与正交实验对培养基辅料、氮源以及无机盐进行研究、优化。实验得到最佳培养基组成与配比：辅料为10%麸皮、5%玉米粉、5%豆饼粉，尿素添加量为1%，硫酸铵添加量为2%，七水硫酸镁添加量为0．03％ ，磷酸二氢钾为0．2%。在此优化培养条件下，白酒丢糟发酵产物中的粗蛋白质质量分数达到30．37%，粗纤维含量为17．56%。相比原料丢糟，粗蛋白质增加百分比与粗纤维降解百分比分别达到73．54%、27．56%，而且还含有丰富的酶类。 2.2、北虫草液体发酵培养基的筛选优化

北虫草(Cordyceps militaris)又名北冬虫夏草、蛹虫草、虫草花，为珍稀药材冬虫夏草同属的真菌，其营养和药用成分与天然冬虫夏草极为相似。是天然冬虫夏草理想代用品。冬虫夏草是中国3大补品之一，具有增强免疫功能、抗肿瘤、抗菌消炎、抗衰老等药效作用。近年来，由于市场的需求量在不断增大，野生北虫草已经远远不能满足市场的需求。因此，大量人工培养的北虫草菌丝体被开发成保健品和药品。与北虫草菌丝体的固体培养相比，液体培养具有生产周期短、菌龄一致、出菇齐、接种方便且快速等优点，利于食用菌生产的规模化、工厂化。

辽宁省农业科学院的李红、刘娜、何雨、张敏、肖千明、张季军、孙利平研究对北虫草液体发酵培养基进行筛选，通过试验来确定北虫草的最佳液体培养基配方，为北虫草的液体发酵工业化生产提供参考。，结果表明在以红糖为碳源，黄豆粉和酵母粉为混合氮源的配方(5)[配方(5)红糖10 g，淀粉10 g，黄豆粉10 g，酵母粉2 g，KH2PO4l g，MgSO4·7H20 0．5 g，水1 000ml]中菌丝体细小致密，萌发快，干重最大，所以确定配方(5)为最佳培养基。 2.3、枯草芽孢杆菌DZ1的培养基及发酵条件优化

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是芽孢杆菌属的一种，是一类好氧内生芽孢的革兰氏阳性细菌，可以产生内生芽孢，耐热抗逆性强，在土壤和植物的表面普遍存在，同时还是植物体内常见的一种内生菌，对人畜无毒无害，不污染环境。由于枯草芽孢杆菌生长速度快、营养需求简单，易于存活、并可以分泌多种酶和抗生素，无致病性，而且还具有良好的发酵基础，用途十分广泛，国内外研究单位和学者对枯草芽孢杆菌进行了大量研究。

山东省林业科学研究院/山东省森林植被生态修复工程技术研究中心的刘方春、邢尚军、丁延芹、马海林、杜秉海以枯草芽孢杆菌菌(Bacillus subtilis)DZ1作为研究试材，通过单因子试验及正交试验，确定其适宜的摇瓶培养基及发酵条件。结果表明，培养时间、培养基及培养条件对Bacillus subtil&DZ1的活菌数影响差异显著。DZ1的最佳种龄为12 小时，最佳碳源和氮源分别是可溶性淀粉和酵母膏。影响枯草芽孢杆菌DZ1活菌数的主要因素为酵母膏，其次为可溶性淀粉，K2HPO 和MgSO4\影响较小。DZ1的最优培养基组合为可溶性淀粉1％，酵母膏1％，K2HPO40．15％，MgSO4\．02％，CaC120．01％，在此条件下，其活菌数可达44．1×10 CFU／mL。单因子试验结果表明，DZ1的适宜摇瓶培养条件分别为培养基温度34摄氏度，初始pit值7．0，摇床转速每分钟180转和

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