4 基因工程的操作过程

4 基因工程的操作过程

A DNA的体外重组(切、接) B 重组DNA分子的转化和扩增(转、增) C 转化子的筛选和鉴定(检)

4 基因工程的操作过程切 接 转

增 检

4 基因工程的操作过程A DNA的体外重组(切与接)同种内切酶生产的粘性末端的连接 同尾酶生产的粘性末端的连接 重组率

同种内切酶生产的粘性末端的连接5' GAATTC CTTAAG EcoRI 5' G CTTAA 5' 5' AATTC G G CTTAA 5' 5' AATTC G GAATTC CTTAAG 5'

5'

退火5' 5' G AATTC CTTAA G G AATTC CTTAA G T4-DNA ligase 5' 5' GAATTC CTTAAG GAATTC CTTAAG G AATTC CTTAA G G AATTC CTTAA G

5'

5'

5' 5'

GAATTC CTTAAG

GAATTC CTTAAG

同尾酶生产的粘性末端的连接5' BclI 5' T ACTAG 5' 5' GATCA T TGATCA ACTAGT 5'

5'

GGATCC CCTAGG BamHI 5' GATCC G

GGATCC CCTAGG

5'

5'

G CCTAG 5'

退火5' 5' T GATCC ACTAG G T GATCC ACTAG G T4-DNA ligase 5' 5' TGATCC ACTAGG GGATCA CCTAGT G GATCA CCTAG T G GATCA CCTAG T

5'

5'

5' 5'

TGATCC ACTAGG

GGATCA CCTAGT

重组率重组率的定义重组率 = 含有外源DNA的重组分子数 / 载体分子总数 在常规实验条件下，重组率一般为25 - 75%

重组率是衡量连接反应效率的重要指标，较高的重组率可以大大简化DNA重组的后续操作。

重组率提高重组率的方法提高外源DNA片段与载体的分子比：5 : 1 - 10 : 1

载体DNA分子在连接前先除去磷酸基团：5' GAATTC CTTAAG EcoRI 5' p AATTC G G CTTAA p 5' GAATTC CTTAAG 5'

碱性磷酸单酯酶5' G CTTAA OH 5'

碱性磷酸单酯酶5' HO AATTC G

5'

退火HO OH 5' G-A-A-T-T-C C-T-T-A-A G HO OH G A-A-T-T-C C-T-T-A-A-G

5'

4 基因工程的操作过程B 重组DNA分子的转化和扩增(转与增)转化的原理与技术 转化率

转化细胞的扩增

转化的原理与技术Ca2+诱导的完整细菌细胞的转化Ca2+诱导的完整细胞的转化适用于革兰氏阴性细菌(如 大肠杆菌等),1970年建立此技术，其原理是Ca2+与细菌外 膜磷脂在低温下形成液晶结构，后者经热脉冲发生收缩作用， 使细胞膜出现空隙，细菌细胞此时的状态叫做感受态

转化的原理与技术Ca2+诱导的完整细菌细胞的转化大肠杆菌感受态细胞的制备： 100 ml 菌体培养至OD600 = 0.5,离心收集菌体 用10 ml 冰冷的20 mM CaCl2溶液悬浮菌体，离心 收集菌体 用1 ml 冰冷的100 mM CaCl2溶液悬浮菌体 冰浴放置12 - 24小时，备用

转化的原理与技术Ca2+诱导的完整细菌细胞的转化大肠杆菌感受态细胞的质粒转化： 取100 ml 感受态细胞，加入相当于50 ng 载体的重组 DNA连接液，混匀 冰浴放置半小时 在42℃保温 2 分钟(热脉冲) 快速将转化细胞转移至冰浴中放置1 - 2分钟 加入1 ml 新鲜培养基，于37℃培养 1 小时(扩增) 涂在合适的固体培养基平板上进行筛选

转化的原理与技术细菌原生质体的转化革兰氏阳性细菌(

如枯草杆菌、链霉菌等)接纳外源DNA 的主要屏障是细胞壁，因而这类细菌通常采用原生质体(细胞 去壁后的形态)转化的方法转移质粒或重组DNA分子 酵母菌、霉菌、植物细胞也可用原生质体法进行转化

转化的原理与技术电穿孔转化将待转化的质粒或DNA重组连接液加在电穿孔转化仪的样品池中，两极施加高压电场。在强大电场的作用下，细菌细胞壁和 细胞膜产生缝隙，质粒或DNA重组分子便可进入细胞内 电穿孔转化法操作简单，而且几乎对所有含细胞壁结构的受 体细胞均有效，但转化效率差别很大 同样的原理，电穿孔法也可用于质粒消除实验

转化率转化率的定义转化率是衡量转化效率的重要指标，其定义为：每微克载体DNA在最佳转化条件下进入受体细胞的分子数。由于在一般的转 化实验规模下，每个受体细胞最多只能接受一个载体分子，因此 转化率的定义也可以表征为：每微克载体DNA转化后，受体细胞 接纳DNA的个数，即克隆数(在筛选时，未接纳载体或重组子的

受体细胞不长)

转化率转化率的定义例如，pUC18对大肠杆菌的转化率为10 8 ,即每微克pUC18中只有108个分子能进入受体细胞。一微克pUC18共有3.4X1011个 分子(6.02X1017 / 2686X660),也就是说，每3400个pUC18分 子才有一个分子进入受体细胞 另一方面，在实际操作过程中，转化一微克pUC18共需2ml 感受态细胞，大约含有2X1010 个大肠杆菌细胞，也就是说，每 200个细胞只有一个细胞能接纳pUC18 DNA

转化率转化率的用途利用转化率和重组率等参数可以帮助设计DNA重组实验规模 例如，某一DNA重组实验的重组率为20%,转化率为107/mg载体， 经切接处理后的载体转化率比天然的载体低100倍，欲获得104个 重组克隆，需投入多少载体DNA进行重组实验？ 若重组率为100%,则转化后产生104个重组克隆需要： 104 / 107 X 10 - 2 = 0.1 mg 载体DNA 考虑到实验系统的重组率为20%,所以实际投入载体应为： 0.1 / 20% = 0.5 mg 载体DNA

载体投入量确定后，外源DNA的投入量即可按10∶1的要求算 出(5 mg),甚至还可以估算需要涂布多少块平板进行筛选

转化率转化率的影响因素载体及DNA重组分子方面： 载体本身的性质： 不同的载体转化同一株受体细胞，其转化率不同 载体的空间构象： 质粒的超螺旋构象转化率最高，经酶切连接操作后的载 体由于空间构象难以恢复，其转化率一般要比新制备的

超螺旋质粒低两个数量级 插入片段的大小： 对质粒载体而言，插入片段越大，转化效率越低

转化率转化率的影响因素受体细胞方面：受体细胞必须与载体相匹配，例如：pBR322转化大

肠杆菌JM83株，转化率很低；但对

大肠杆菌ED8767株的转化率则较高

转化率转化率的影响因素转化方法方面： 受体细胞的预处理：影响最大 供受体的比例： Ca2+诱导转化 原生质体转化 转化方法： Ca2+诱导转化 原生质体转化 106 - 107 / mg DNA 105 - 106 / mg DNA 0.1 ml 感受态细胞 109 个原生质体 50 ng DNA 50 ng DNA

l-DNA转染 电穿孔转化

107 - 108 / mg DNA 106 - 109 / mg DNA

转化细胞的扩增扩增操作转化细胞的扩增操作是指转化完成之后细胞的短时间培养。在实验时，扩增操作往往与转化操作偶联在一起，如： Ca2+诱导转化后的37℃培养一个小时 原生质体转化后的再生过程 l噬菌体转染后的30℃培养等，均属扩增操作

转化细胞的扩增扩增操作的目的增殖转化细胞，使得有足够数量的转化细胞用于筛选程序 扩增和表达载体分子上的标记基因，便于筛选 表达外源基因，便于筛选和鉴定

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