遗传学实验指导书 - 图文

实验1 植物染色体减数分裂过程切片制作与观察

1、实验目的

通过对植物花粉的形成过程中减数分裂的观察，了解植物生殖细胞形成的一般过程以及染色体在这一过程中的动态变化，从而深刻理解减数分裂的遗传学意义，为研究遗传学基本规律奠定细胞学基础。

2、实验原理

减数分裂是一种特殊方式的细胞分裂，仅在配子形成过程中发生。这一过程的特点是：细胞连续两次进行核分裂，而染色体只复制一次，结果形成四个核，每个核只含单倍数的染色体。即染色体数减少一半，所以称为减数分裂。另一个特点是前期特别长。而且变化复杂，包括同源染色体的配对和非姊妹染色单体的交换与分离等。

3、实验材料

高粱（2n=20）、玉米（2n=20）雄蕊幼穗。 4、实验器具和药品

（1） 用具：显微镜、载玻片、盖玻片、刀片、接种针、镊子、酒精灯、吸水纸、擦镜纸、烧杯、量筒、带橡皮头的铅笔。 （2） 药品：纯酒精、95%酒精、冰醋酸、70%酒精、卡诺固定液（Carnoy）液、醋酸洋红（醋酸地衣红）。 5、实验说明

在被子植物中，由分生细胞进行几次有丝分裂，形成小孢子母细胞（花粉母细胞），简称PMC，每个PMC进行两次连续的细胞分裂，即减数分裂，产生四个子细胞，每个子细胞就是一个小孢子，每个小孢子内的染色体的数目是PMC的一半（n）。整个减数分裂过程可分为下列各个时期：

第一次分裂：

前期I：又可分为以下五个时期：

细线期：核内出现染色体细长如线，数目成双，核仁明显，但一般看不到双线结构。 偶线期：同源染色体配对，即联会。呈二价状态（此期很短暂，不易找到）。

粗线期：二价体变粗变短，由于各染色体由已复制成两条的染色单体组成。故此时配对的染色体含有四条染色单体，叫做四合体。交换 双线期：各同源染色体开始分开，由于在粗线期非姊妹染色体之间发生局部的交换，因而同源染色体在一定区段出现交叉结。交叉 终变期：染色体长度更为粗短，交叉结向端部移动，核仁的核膜开始消失，此时观察染色体最清楚，故可计算数目。端化 中期I：染色体排列在赤道板上，并出现纺锤丝。

后期I：同源染色体由于纺锤丝牵引着丝粒，分别向两极移动。由于各染色体的着丝粒没有分裂，故两个细胞只有半数染色体（n）。 末期I：染色体拉向两极，松开变细，形成两个子核，细胞质分裂，在中央由纺锤丝形成细胞板，产生二分体。 第二次分裂：

前期Ⅱ：染色体又开始缩短，而其包含的两条染色单体分得很开，但着丝粒仍然连在一起。 中期Ⅱ：每个染色体整齐地排列在各个分裂细胞的赤道板上。 后期Ⅱ：每个染色体的着丝粒分裂为二，姊妹染色体分别移向两极。

末期Ⅱ：每个分裂细胞的细胞质又分隔为二，形成四个子细胞，又叫四分体。 6、实验步骤 （1）试剂的配制

卡诺固定液：纯酒精：冰醋酸 = 3：1

卡宝品红：①原液A：称取8克碱性品红结晶溶于100毫升70%乙醇中（可以无限期保存）

②原液B：取100毫升原液A 加入到90毫升5%的苯酚水溶液中，充分混匀，置37℃温箱中温溶2-4小时（此液不稳定，2周内使用）

③原液C：取原液B55毫升，加入冰乙酸和甲醛各6毫升，充分混匀。

④染色液：取原液C10-20毫升，加入90-80毫升45%乙酸和1克山梨醇（Sorbitol）。

该染色液配好后为淡品红色，立即使用染色较淡，放置两周后染色能力明显加强，而且放置时间越久染色能力越强，可以在常温下存放两年。 醋酸洋红：先将100毫升45%的乙酸装入大约200毫升的短颈平底烧瓶中加热煮沸，移去火源，然后，缓缓加入1克洋红粉末，并不断搅动使其溶解，这一过程防止溅出完全溶解后，重新置火上加热煮沸1-2分钟，此时，可用细线悬一生锈的小铁钉浸入染色液中约1分钟后取出或加入氢氧化铁的50%的乙酸饱和液1-2滴，不可多加，以免产生沉淀，配置完毕在室温下静置12小时后过滤于棕色试剂瓶中，备用。

（2）取材：玉米一般在雄穗抽出数天前开始取样，取材时用手指由喇叭口向下挤捏叶鞘，感到松软则是花序部位，用刀片纵切一刀，用镊子取出数条花序检查，如先端小穗长3-4cm时，花药未变黄的花序下处于减数分裂期，采样放入固定液中固定备用。高粱是在孕穗期，旗叶叶环与倒二叶叶环4-10cm时取样。高粱和玉米的最佳取样时间是晴天的上午8-10时。

（3）制片：在洁净的载玻片上，用清洁解剖针或刀片压在小花基部向一端挤出花药2-3枚，再将花药纵切数片，涂成薄片，然后加一滴醋酸洋红染液。也可在花药上滴上染液，然后用镊子把花药镊碎。上述两种方法都要去掉肉眼可看到的残渣，数分钟后盖上盖玻片，将吸水纸放于

1

盖玻片上固定盖玻片，用大拇指匀力压片。为加深染色，可微微加热。

（4）镜检：先在低倍镜下寻找花粉母细胞，一般花粉母细胞较大，园或扁园形，细胞核大着色浅。而一些形状较小而整齐一致着色深的细胞则是花药壁体细胞，那些形状处于中间略呈扁形的细胞则是从四分体脱开后的小孢子或幼小花粉粒。如有形状较大，似有明显的外壳，内部较透明的细胞则是成熟的花粉粒。选择有一定分裂相的花粉母细胞后，用高倍镜观察减数分裂时期染色体变化的特征。

7、思考题

减数分裂在遗传学上有什么意义？ 8、作业

绘制你所观察到的减数分裂各时期的图象并简述其特征。

实验2 花药发育过程的细胞学观察

1、实验目的

通过对植物雄蕊发育过程的细胞学观察，了解植物生殖细胞形成的一般过程以及花药、染色体在这一过程中的动态变化，为研究遗传学基本规律奠定细胞学基础。

2、实验原理

花药通常有4个花粉囊，锦葵科为2个。花粉囊是产生花粉粒的处所，每个花粉囊中含有很多花粉粒。花药的中部为药隔，除表皮外，有很多薄壁细胞，其中有一个维管束自花丝通入。花隔支连着花粉囊，并供应花药发育时所需的水分和养料。花粉粒成熟后，花药两侧的花粉囊各合并成一室，花药开裂，花粉粒散出，开始传粉 (见下图) 。

花药囊由表皮、内壁、中层和绒毡层组成。成熟的花药中一般已不存在中层。绒毡层是花粉囊壁的最里面的一层细胞，其细胞较大，初期为单核，在花粉母细胞开始减数分裂时，绒毡层细胞核内DNA增加很快。通常核进行分裂，但不伴随细胞壁的形成，所以每个细胞常具有双核或多核。在花粉粒为四分体时期，发育达到顶点，以后开始出现退化现象。

3、实验材料 4、实验器具和药品

用具：切片机、烤片台、显微镜、载玻片、盖玻片、刀片、镊子、酒精灯、吸水纸、擦镜纸、烧杯、量筒。 药品：纯酒精、95%酒精、二甲苯、冰醋酸、甲醛、FAA固定液、爱氏苏木精染色剂。 5、实验步骤 （1）试剂的配制

FAA固定液：50%酒精 89ml，冰醋酸 5ml，甲醛 6 ml。

爱氏苏木精：A：苏木精2g, 95%酒精 100 ml，冰醋酸10 ml，甘油100 ml B：钾矾 10g, 蒸馏水100 ml

（2）材料的固定：取各个发育时期的玉米或高粱小穗，用FAA固定液固定备用。 （3）爱氏苏木精染色

1） 选取合适的材料放入染色剂中整染5-7天；

2

表皮中层纤维层花粉母细胞绒毡层花药表皮药室药隔维管束造孢细胞表皮纤维层绒毡层造孢细胞表皮孢原细胞造孢细胞药隔基本组织纤维层高粱（2n=20）、玉米（2n=20）或小麦（2n=42）等雄蕊幼穗及其永久制片和照片。

2） 脱水：从低浓度酒精到高浓度酒精依次进行 ，每次3-5分钟； 3） 石蜡包埋：经1/2石蜡+1/2二甲苯 —石蜡； 4） 切片：将由石蜡包埋的材料放到切片机上切片； 5） 烤片：将切片放到烤片台上烤干； 6） 脱蜡：切片脱蜡；

7） 脱水至透明：经1/2纯酒精+1/2二甲苯—二甲苯I—二甲苯Ⅱ（30分钟）； 8） 封片：用加拿大树胶封片；

9） 用显微镜观察花药的正常结构及小孢子的发育过程。 6、作业：

（1）描述所观察到的花药的时期和结构。

（2）绘制观察到的花药结构图，并表明各部分的名称。

实验三 PTC昧盲基因的群体遗传分析

1、原理

苯硫脲(phenylthiourea)，又称苯基硫代碳酰二胺(phenylthiocarbamide，PTC)，是由尿素合成的白色结晶状化合物，因分子结构苯环上带有硫代酰胺基(N—C＝S)而呈苦味。1931—1932年Fox首先发现某些人对PTC有苦味感(尝味者、敏感者)，而某些人则无苦味感(味盲者)，从而将人类对PTC尝味分为两类。但味盲者对不含有硫代酰胺基的苦味物(如苦味酸等)还是有苦味感。1932年Blakeslee对PTC苦味敏感的家系进行了调查，证实了人类对苯硫脲的尝味能力是一种遗传性状。人类对PTC尝味浓度阈值方面的差异属单基因遗传，随后的家系和双生子研究支持了这一观点，基因(T—t)位于第7号染色体上，味盲者为隐性基因纯合体(tt)，而尝味者是显性基因的纯合体(TT)或杂合体(tt)，遗传方式为不完全显性遗传。但一些研究者从他们的研究数据中发现不能完全地用孟德尔遗传来解释，因而提出其他遗传方式，如：复等位基因、多基因等。另外，遗传背景和环境修饰也影响其表型。2003年Drayna等通过连锁研究把对PTC敏感的一个主要基因定位于第7号染色体上，第2个基因可能在第16号染色体上。而第7号染色体上负责该性状的主要基因也被确定为TAS2R苦味受体基因家族中的TAS2R38。

世界不同民族与地区的PTC味盲率与隐性基因频率有很大差异，世界上味盲率最高值在印度，为52.8％，澳大利亚土著也高达49.3％。欧洲的英国、德国、挪威、瑞士及芬兰等人群味盲率在30％左右，南欧的意大利、西班牙人群味盲率只有24％～25％。亚洲的尼泊尔人为22．8％，日本人、韩国人均在8％~15％，中国人味盲率在7.27％~10.13％。黑人中味盲率在3％~4％，而印第安人中味盲率比较低，有的仅有1．2％，甚至为0。

PTC尝味的敏感性与某些疾病存在着一定的相关性，如甲状腺肿、糖尿病、青光眼、呆小病、慢性消化溃疡、抑郁症，乃至某些癌症等。研究者发现PTC味盲者更易患结节性甲状腺肿，而先天愚型者中PTC味盲率大大高于正常群体。近年来西欧等国学者利用PTC等位基因进行味觉试验以研究原发性青光眼的遗传病因，研究表明PTC尝味者中的抑郁症患者显著高于味盲者。

检测PTC味盲有纸片法(filter paper method)、结晶法(crystal method)、阈值法(threshold method)等几种不同的方法。近年来国际上研究者采用1949年Harris和Kalmus改进的阈值法，将1.3 g苯硫脲溶于1 000mL双蒸水中，此溶液浓度等级定为1号，再取此溶液500mL与双蒸水500 mL混匀，浓度等级定为2号，如此等量对半稀释至14号溶液为止。本实验按此方法配制PTC溶液，对人群进行PTC味盲基因频率的测定与分析，为群体遗传学的学习提供基本数据。

2、材料

本校各院系学生或某一区域人群。 3、仪器与试剂 （1）仪器

天平、烧杯、容量瓶、试剂瓶等。 （2）试剂 苯硫脲 4、操作程序

（1）PTC溶液的配制

称取1.3 g苯硫脲，加双蒸水1 000 mL于容量瓶中，置于室温下2~3 d即可完全溶解，在此期间应不断摇晃以加速溶解过程，也可将容量瓶放于60℃水浴中1 h充分溶解。配成的溶液浓度为1／750 mol／L，编为1号。将倒出500 mL的1号液的1 000 mL容量瓶中再加入双蒸水至1 000 mL，充分混合，为2号液；这样用容量瓶依次倍比稀释，共配制14种浓度(表1)，分别装入消毒好的试剂瓶中。

（2）测试步骤

①受试者坐正，仰头张口伸舌，用滴管滴4～8滴14号液于受试者舌根部，让受试者慢慢咽下尝味，然后用双蒸水做同样的试验。 表1 14种PTC溶液的配制方法、浓度与对应基因型

编号 配制方法 浓度／(mg/L) 基因型 1 1.3 gPTC+双蒸水1 000mL 1／750 tt

3

2 1号液500 mL+双蒸水500 mL 1／1 500 tt 3 2号液500 mL+双蒸水500 mL 1／3 000 tt 4 3号液500 mL+双蒸水500 mL 1／6 000 tt 5 4号液500 mL+双蒸水500 mL 1／12 000 tt 6 5号液500 mL+双蒸水500 mL 1／24 000 tt 7 6号液500 mL+双蒸水500 mL 1／48 000 Tt 8 7号液500 mL+双蒸水500 mL 1／96 000 Tt 9 8号液500 mL+双蒸水500 mL 1／192 000 Tt 10 9号液500 mL+双蒸水500 mL 1／384 000 Tt 11 10号液500 mL+双蒸水500 mL 1／768 000 TT 12 11号液500 mL+双蒸水500 mL 1／1 536 000 TT 13 12号液500 mL+双蒸水500 mL 1／3 072 000 TT 14 13号液500 mL+双蒸水500 mL 1／6 144 000 TT 15 双蒸水

②询问受试者能否鉴别此两种溶液的味道。若不能鉴别或鉴别不准(如认为PTC溶液的味道是酸、咸、辣或其他说不出的药味等等)，则依次用稍浓的13号溶液重复试验，依次进行直到能明确鉴别出PTC的苦味为止。

③当受试者鉴别出某一号溶液时，应当用此号溶液重复尝味3次，3次结果相同时，才是可靠的，并记录首次尝到PTC苦味的浓度等级号。如果受试者直到1号液仍尝不出苦味，则其尝味浓度等级定为“<1”号。

④在测定时，注意用双蒸水反复交替给受试者尝味，避免由于受试者的猜测及其心理作用而影响结果的准确性。 5、结果与分析

正常尝味者的基因型为TT，能尝出1／6 144 000 ~1／768 000mol／L的PTC溶液的苦味，即阈值范围为11~14号；Tt基因型的人尝味能力较低，只能尝出1／384000~1／48000mol／L的PTC溶液的苦味，即阈值范围为7~10号；而基因型为tt的人只能尝出1／24 000mol／L以上浓度PTC溶液的苦味，即阈值范围为1~6号。也有个别人甚至对PTC的结晶也尝不出苦味。

对所测数据，按Hardy-Weinberg定律，可计算出基因频率(p、q)和基因型频率。若以6号液作为味盲和尝味者的界限，尝味阈值等于或低于6号液者为味盲，因而可测出味盲率。

若假定你所测试的群体是一个平衡群体，那么平衡群体中上下代之间基因频率，基因型保持不变，所以可以依据基因频率来推算各种基因型频率的理论预期值，再与实际测定结果进行X2检验，即可判定该群体是否为平衡群体(表2)。

根据X2值和自由度(df=1)，查表。

根据所测群体的实际结果，求出基因T和基因t的频率，并计算出群体味盲率。应用统计学方法确定该群体是否为平衡群体。若为不平衡群体，分析可能的原因。

5、思考题

（1）根据测得数据，计算基因型TT、Tt及tt的频率和基因T和t的频率（p和q）。结果进行X2检验，可判定该群体是否为平衡群体 (表2)。

（2）在所测群体中，男女在尝味能力上是否有区别? （3）年龄对尝味阈值是否会有影响? 表2 X2 检验计算

计算项目 TT Tt tt 实测值（O）

理论预期比 p2 2pq q2 预期值（E） (N p2) N 2pq (N q2) (O-E)2/E 6、实验建议

实验操作比较简单，测试者要采用一些技巧迷惑受试者，避免使受试者由于心理作用而影响结果的准确性。配液过程所用的烧杯、容量瓶、试剂瓶等应高压灭菌，给受试者滴药液时切记悬空加样，不要碰到受试者，避免交叉污染。

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