生物化学实验讲稿

实验四 双缩脲法测定蛋白质浓度

[实验原理]

具有两个或两个以上肽键的化合物皆有双缩脲反应，在碱性溶液中蛋白质与铜离子形成紫色配合物，在540nm处有最大吸收。在一定浓度的范围内，蛋白质和浓度与双缩脲反应所呈的颜色深浅成正比，可用比色法定量测定。

[实验仪器及用品]

实验器材：容量瓶、试管、吸管、722型（或7220型）分光光度计。 实验试剂：双缩脲试剂；卵清蛋白质溶液；未知液 [实验内容及步骤] 一、标准曲线的绘制

将6只10ml容量瓶编号，按下表加入试剂，即得6种不同浓度的蛋白质溶液。 瓶号 1 2 3 4 5 6 2mg/ml卵清蛋白液体积 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 蒸馏水 稀释至刻度 稀释至刻度 稀释至刻度 稀释至刻度 稀释至刻度 稀释至刻度 蛋白质浓度/（mg/ml） 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 取干净试管7只，按0、1、2、3、4、5、6编号，1-6号管分别加入上述不同浓度的蛋白质液3.0ml。0号为对照管，加入3.0ml蒸馏水。各管加入双缩脲试剂2.0ml，充分混匀，即有紫色出现，用540nm光测定各管吸光度，绘制浓度-吸光度曲线。

二、样液的测定

取未知浓度的蛋白质溶液3.0ml臵试管内，加入双缩脲试剂2.0ml，混匀，测其540nm吸光度。

三、数据记录和处理

根据标准溶液的吸光度，在坐标纸上绘制出浓度-吸光度曲线，测出位知液的吸光度后，在标准曲线上查出未知液的浓度。

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实验五 酵母核糖核酸的分离及组分鉴定 一、目的

了解核酸的组分，并掌握鉴定核酸组分的方法。 二、原理

酵母核酸中RNA含量较多。RNA可溶于碱性溶液，在碱提取液中加入酸性乙醇溶液可以使解聚的核糖核酸沉淀，由此即得到RNA的粗制品。

核糖核酸含有核糖、嘌呤碱、嘧啶碱和磷酸各组分。加硫酸煮沸可使其水解，从水解液中可以测出上述组分的存在。 三、器材

1．乳钵 2．150mL锥形瓶 3．水浴 4．量筒 5．布氏漏斗及抽滤瓶 6．吸管 7．滴管 8．试管及试管架 9．烧杯 10．离心机 11．漏斗 四、试剂和材料

1．0．04 mol／L氢氧化钠溶液 1000 mL 2．酸性乙醇溶液 500mL 将0．3毫升浓盐酸加入30毫升乙醇中。 3．95％乙醇 1000mL 4．乙醚 500 mL 5．1．5 mol／L硫酸溶液 200mL 6．浓氨水 50 mL 7．0．1 mol／L硝酸银溶液 50mL 8．氯化铁浓盐酸溶液 80mL

将2mLl0％三氯化铁溶液(用FeCl3?6H2O配制)加入到400mL浓盐酸中。 9．苔黑酚乙醇溶液 10 mL

溶解6g苔黑酚于100mL 95％乙醇中(可在冰箱中保存1个月)。 10．定磷试剂 50mL

（1）17％硫酸溶液 将17 mL浓硫酸(比重1．84)缓缓加入到83mL水中。 （2）2．5％钼酸铵溶液 将2．5g钼酸铵溶于100mL水中。

（3）10％抗坏血酸溶液 10 g抗坏血酸溶于100 mL水中，贮棕色瓶保存。溶液呈淡黄色时可用，如呈深黄或棕色则失效，需纯化抗坏血酸。 临用时将上述3种溶液与水按如下比例混合。

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17％硫酸溶液:2.5％钼酸铵溶液:10％抗坏血酸溶液:水=1:1:1:2(V／V)。 11．酵母粉 200 g 五、操作

将15g酵母悬浮于90 mL 0.04 mol/L氢氧化钠溶液中，并在乳钵中研磨均匀。将悬浮液转移至150毫升锥形瓶中。在沸水浴上加热30分钟后，冷却。离心(3 000r/min)15分钟，将上清液缓缓倾人30 mL酸性乙醇溶液中。注意要一边搅拌一边缓缓倾人。待核糖核酸沉淀完全后，离心(3000r/min)3分钟。弃去清液。用95％乙醇洗涤沉淀两次，乙醚洗涤沉淀一次后，再用乙醚将沉淀转移至布氏漏斗中抽滤。沉淀可在空气中干燥。

取200ng提取的核酸，加入1.5 mol/L硫酸溶液10mL，在沸水浴中加热10分钟制成水解液并进行组分的鉴定。

1．嘌呤碱 取水解液1 mL加入过量浓氨水，然后加入约1 mL 0.1 mol/L硝酸银溶液，观察有无嘌呤碱的银化合物沉淀。

2．核糖 取1支试管加人水解液1 mL、三氯化铁浓盐酸溶液2mL和苔黑酚乙醇溶液0．2 mL。放沸水浴中10分钟。注意溶液是否变成绿色，说明核糖的存在。 3．磷酸 取1支试管，加入水解液1 mL和定磷试剂I mL。在水浴中加热，观察溶液是否变成蓝色，说明磷酸是否存在。

思 考 题

1．如何得到高产量RNA的粗制品? 2．本实验RNA组分是什么?怎样验证的?

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实验六 酶的活化、抑制及专一性

一．目的：

1、巩固活化剂和抑制剂对酶活性的影响 2、加深对酶的专一性认识 二．内容：

（一）淀粉酶的活化和抑制

1、 原理：酶的活性受活化剂和抑制剂的影响，氯离子为唾液淀粉酶的活化剂，铜离子为该酶的抑制剂。

2、 器材：恒温水浴，试管及试管架，

3、 试剂和材料：（1）0.2%淀粉溶液（2）1%氯化钠溶液 （3）1%硫酸铜溶液（4）1%硫酸钠溶液 4、 操作： 管号 1 2 3 0.2%淀粉溶液（ml） 1.5 1.5 1.5 稀释唾液（ml） 0.5 0.5 0.5 1%硫酸铜溶液（ml） 0.5 1%氯化钠溶液（ml） 0.5 1%硫酸钠溶液（ml） 0.5 蒸馏水（ml） 37℃恒温水浴保温10分 KI-I2溶液（d） 2~3d 现象

（二）、酶的专一性

1、 原理：酶具有高度的专一性。本实验以唾液淀粉酶和蔗糖酶对淀粉和蔗糖的作用为例，来说明酶的专一性。

蔗糖和淀粉无还原性，但它们的水解产物是有还原性的，用Benedict试剂检查糖的还原性。

2、 器材：恒温水浴，试管及试管架、沸水浴 3、 试剂和材料：（1）1%淀粉溶液（2）2%蔗糖溶液 （3）蔗糖酶溶液（4）Benedict试剂 4、 操作：

（1）淀粉酶的专一性 管号 1

4 1.5 0.5 0.5 2 4

3 4 5 6 1%淀粉溶液(d) 2%蔗糖溶液(d) 稀释唾液（ml） 煮沸唾液（ml） 蒸馏水（ml） Benedict试剂(ml) 现象

4 4 4 1 1 1 37℃恒温水浴保温15分 1 1 1 沸水浴2min 4 1 1 4 1 1 4 1 1 （2）蔗糖酶的专一性 管号 1 1%淀粉溶液（ml） 4 2%蔗糖溶液（ml） 蔗糖酶溶液（ml） 煮沸蔗糖酶液（ml） 蒸馏水（ml） 1 Benedict试剂(ml) 现象

2 3 4 4 1 1 37恒温水浴5分 1 1 1 沸水浴2~3min 4 4 1 1 5 4 1 1 6 4 1 1 5、 注意事项： 当有一支试管的颜色发生变化时，立即取出所有试管. 三、作业：

1、解释酶的活化和抑制中Na2SO4的作用 2、记录实验现象，分析实验结果，写出实验结论

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实验九 维生素C的定量测定

【实验目的】

1. 学习定量测定维生素C的原理及方法 2. 掌握微量滴定法的操作技术 【实验原理】

维生素C具有很强的还原性，在中性和微酸性环境中，能将染料2，6-二氯酚靛酚还原成无色的还原型的2，6-二氯酚靛酚，同时被氧化成脱氢维生素C。氧化型的2，6-二氯酚靛酚在酸性溶液中呈现红色，在中性或碱性溶液中呈蓝色。当溶液由无色变为微红色时即表示溶液中的维生素C刚好全部被氧化，此时即为滴定终点。从滴定时2，6-二氯酚靛酚溶液的消耗量，可以计算出被检物质中还原型维生素C的含量。

【器材与试剂】

器材： 1. 研钵 2. 天平 3. 容量瓶（50ml） 4. 量筒 5. 刻度吸管 6. 锥形瓶（ 50ml）7. 玻棒 8. 微量滴定管 9. 漏斗 10. 新鲜蔬菜或新鲜水果 11. 滤纸 试剂： 1. 2%草酸溶液 2. 标准维生素C溶液 3. 0.02% 2，6-二氯酚靛酚溶液 【实验步骤】

1. 提取：称取新鲜样品约4g，臵于研钵中，加入5ml2%草酸溶液研磨成浆状，残渣再次研磨，一同转入50ml容量瓶中，草酸总量为35ml，加水定容。 2.过滤：提取液充分混匀后，过滤。

3. 样品滴定：准确吸取滤液5或10ml于50ml的锥形瓶中，立即用标定过的2，6-二氯酚靛酚溶液滴定至终点，粉红色，15秒不褪色。记录所用染料的毫升数（重复测定2～3次）。

4. 空白滴定：准确量取35ml2%的草酸，放入50ml容量瓶中，加水定容。准确吸5或10ml于50ml的锥形瓶中，立即用2，6-二氯酚靛酚溶液滴定至终点，粉红色，15秒不褪色。记录所用染料的毫升数（重复测定2～3次）。 5. 计算 维生素C含量（mg/100g样品）=（V1-V2）VK/W）×100 式中：V1为滴定样品所耗用的染料的平均ml数 V2为滴定空白所耗用的染料的平均ml数

K为1ml染料相当于维生素C的mg数 W为样品质量g数

*标定2，6-二氯酚靛酚：取维生素C标准液5ml及1%草酸溶液5ml于50ml的锥形瓶中，用配制好的2，6-二氯酚靛酚溶液标定。 【实验结果与分析】 复习思考题、作业题：

1. VC理化性质最重要的是哪一点？为何用草酸来提取？

2. VC的生理功能（生化作用）有那些？

3. 为了准确测定维生素C的含量，实验过程中应注意哪些操作步骤？为什么？

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实验十 Folin-Wu法测定血液葡萄糖含量

一、目的

学会用Folin—Wu法测定血液中葡萄糖含量。 二、原理

葡萄糖的半缩醛羟基具有还原性，在加热条件下可使碱性铜试剂中的Cu2+

还原为黄色的氧化亚铜沉淀，而其本身被氧化为羧基。氧化亚铜可使磷钼酸还原成蓝色的钼蓝，蓝色的深度与葡萄糖的浓度成正比，故可用比色法测定钼蓝的光吸收值来测定葡萄糖的浓度。

3Cu2O + 2MoO3 → 6CuO + Mo2O3 (氧化亚铜) （钼蓝）

血糖即指血液中存在的葡萄糖。由于血液中成分复杂，尤其有许多种蛋白质存在，它们对血糖的测定会产生干扰。因此，目前常用钨酸法处理抗凝血来制备无蛋白滤液，然后用来测定无蛋白滤液中的葡萄糖含量。

Na2WO4 + H2SO4 → H2WO4 + Na2SO4 (钨酸钠) （钨酸）

在测定过程中，由于空气中的氧对Cu2O会产生再氧化作用从而影响测定结果，因此实验中要采用特制的福林—吴宪血糖管——有一细颈，可以尽量减少与空气的接触。（图23-1）

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图23-1 血糖管和奥氏吸管 1．（Folin-吴宪式）血糖管 2.奥氏吸管

三、材料、试剂和器具 （一）材料

饥饿16小时的鸡或兔 （二）试剂

1、草酸钾（A.R）

2、0.25%苯甲酸溶液 3、10%钨酸钠溶液

称取10g钨酸钠，用双蒸水溶解后定容至100ml。

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4、1/3mol/L硫酸溶液

5、标准葡萄糖溶液（0.1mg/ml）

称取1.000g无水葡萄糖，用苯甲酸水溶液溶解后定容至1000ml，其浓度为1mg/ml。可长期保存使用。使用时用蒸馏水稀释，配成0.1mg/ml的葡萄糖溶液。

6、碱性铜试剂

分别称取40g无水碳酸钠、7.5g酒石酸、4.5g硫酸铜结晶，用蒸馏水溶解后混合，定容至1000ml。本试剂于室温下可长期保存使用，若有沉淀产生，应过滤后再使用。

7、磷钼酸试剂

称取70g钼酸、10g钨酸钠，量取10%氢氧化钠400ml及蒸馏水400ml，于烧杯中混合加热20~40min（以除去可能夹杂于钼酸中的氨），冷却后加入85%磷酸250ml，混匀后定溶至1000ml.. （三）器具

1、剪刀 2、烧杯

3、试管与试管架 4、玻璃棒

5、奥氏吸量管（见图23—1） 6、血糖管（见图23—1） 7、小漏斗 8、可见光分光光度计 9、水浴锅 10、移液管 11、电炉 12、天平 13、容量瓶

四、操作步骤

（一）制备无蛋白滤液

1．杀鸡取血后立即按2g草酸钾/L血液的比例加入草酸钾，以制备抗凝血。 2．于一支试管中加入7.5ml蒸馏水。

3．用奥氏吸管量取0.5ml抗凝血。小心擦去管外血液后，于试管底部缓缓放出血液。吸取试管内蒸馏水吹洗吸管数次后，充分摇匀，使血液完全溶血。注意不要使血液粘附于奥氏吸量管壁。

4．加入1/3mol/L硫酸1ml边加边摇，摇匀后放臵5min。 5．加入10%钨酸钠溶液1ml，边加边摇，摇匀后放臵5min. 6．过滤、收集滤液备用。若滤液不清，应重新过滤直至滤液澄清为止。至此，所制得的无蛋白滤液为20倍稀释的无蛋白血滤液，即每毫升血液相当于含血0.05ml..

(二)血糖的测定

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1．取血糖管3支，按下表进行编号后操作。 血糖管空白管 编号 试剂（ml） 蒸馏水 无蛋白血滤液 标准葡萄糖液 碱性铜溶液 磷钼酸试剂 蒸馏水 2.0 2.0 2.0 19.0 标准管 测定管 2.0 2.0 2.0 19.0 2.0 2.0 2.0 19.0 混匀，沸水浴中煮8min，勿摇动取出，流水冷却

2.充分混匀。

3．用分光光度比色测定吸光值A620nm。

（三）血糖浓度计算结果如下：

100测定管A620nm每100ml血液所含葡萄糖的毫克数=×标准葡萄糖的毫克数×

0.1标准管A620nm式中0.1表示2ml血滤液相当于0.1ml血液。

五、注意事项

1．过滤时应于漏斗上盖一表面皿，防止水分蒸发。 2．所用试管、漏斗均需干燥。

六、实验报告

以你的实验结果与其它测定血糖方法比较，有什么优缺点？

七、思考题

1．钨酸的作用是什么？

2．血糖管和奥氏吸管的结构特点对本实验有何作用？ 3、为什么实验中以无蛋白滤液，而不以全血、血浆或血清来测定血糖含量？

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实验十一 脂肪酸的β-氧化

目的和要求

1.了解脂肪酸的β-氧化作用。

2.通过测定和计算反应液内丁酸氧化生成丙酮的量，掌握测定β-氧化作用的方法及其原理 原理

根据β-氧化学说，机体组织能将脂肪酸氧化生成乙酰辅酶A。两分子乙酰辅酶A可再缩合成乙酰乙酸。在肝脏内，乙酰乙酸可脱羧生成丙酮，也可还原生成β-羟丁酸。乙酸乙酸、β-羟丁酸和丙酮总称为酮体。酮体为机体代谢的中间产物。在正常情况下，其产量甚微；患糖尿病或食用高脂肪膳食时，血中酮体含量增高，尿中也能出现酮体。

本实验用新鲜肝糜与丁酸保温，生成的丙酮可用碘仿反应测定。在碱性的条件下，丙酮与碘生成碘仿。 操作方法

击毙动物（家兔、大鼠或豚鼠），迅速放血，取出肝脏，在玻璃皿上剪成碎糜。

取50毫升锥形瓶 2个，各加入 3毫升 Locke氏溶液和 2毫升 PH7．6的磷酸缓冲浪。在一个锥形瓶中，加入3毫升0.2N丁酸溶液，另一个锥形瓶作为对照。取约0.5克肝组织两份（相等重量），分别臵于两个锥形瓶内。混匀，于37℃恒温水浴内保温。

保温2小时后，取出锥形瓶，各加入2毫升15%三氯乙酸溶液，在对照瓶内追加3毫升0.2N 丁酸溶液。混匀，静臵 15分钟后过滤。分别吸取 5毫升滤波，放入另外两个锥形瓶中，再各加5毫升0．IN碘溶液和5毫升10%氢氧化钠溶液。摇匀后，静臵10分钟。加入5毫升10%盐酸溶液中和。然后，用0.1N硫代硫酸钠溶液滴定剩余的碘。滴至浅黄色时，加入3滴淀粉溶液作指示剂。摇匀，并继续滴到蓝色消失。记录滴定样品与对照所用的硫代硫酸钠的毫升教，并按下式计算样品中丙酮含量：

样品中丙酮含量??B?A??0.9667?105式和B为滴定对照实验所消耗的0.1N硫代硫酸钠溶液毫升教；A为滴定样品所消耗的0.1N硫代硫酸钠溶液毫升数：0.9667为1毫升0.1N硫代硫酸钠溶液所

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相当的丙酮毫克数。

试剂和器材

一、

试剂

（1）动物：家兔、大白鼠等。肝糜必须新鲜，放臵久则失去氧化脂肪酸能力。

（2）Locke氏溶液：取 0.9克氯化钠、0.042克氯化钾、0.024克氯化钙、 0.015克碳酸氢钠及0.1克葡萄糖，溶于水中，稀释到100毫升。

（3）0.1N碘溶液：称取12.7克碘和约25克碘化钾，溶于水中，稀释到1000毫升，混匀，用标准硫代硫酸钠溶液标定。 （4）PH7.6，1/15的磷酸缓冲液。

（5）0.2N丁酸溶液：取18毫升正丁酸，用1N氢氧化钠溶液中和PH=7.6，并稀释至1000毫升。

（6）15%三氯乙酸溶液。 （7）10%氢氧化钠溶液。 （8）10%盐酸溶液 〔9〕0.1N硫代硫酸钠溶液 二、器材

（1）玻璃皿 （2）锥形瓶（50毫升） （3）试管及试管架 （4）吸量管（2、5毫升） （5）漏斗 （6）微量滴定管（5毫升） （7）剪刀及镊子 （8）小台称。 （9）恒温水浴 思考题

1.为什么说做好本实验的关键是制备新鲜的肝糜？

2.什么叫做酮体？为什么正常代谢时产生的酮体量很少？在什么情况下血中酮体含量增高，而尿中也能出现酮体？

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实验十二 过氧化氢酶和过氧化物酶的定性反应

主要内容

掌握过氧化氢酶和过氧化物酶催化反应的特点，学习酶定性反应的操作。 （一）原理：过氧化氢酶能催化过氧化氢分解，产生水及分子氧。过氧化物酶能催化过氧化氢分解释放出新生态氧以氧化某些酚类物质和胺类物质，例如氧化溶于水中的焦性没食子酸生成不溶于水的焦性没食子橙（橙红色）；氧化愈创木脂中的愈创木酸成为蓝色的愈创木酸的臭氧化物。 （二）操作： 原料：

切碎猪肝（2g），制成新鲜猪肝糜。 取1g新鲜猪肝糜加适量水煮沸，将水倒去。 切碎新鲜白菜叶（2g），越细越好。

白菜梗提取液：白菜梗约5g，切成细块至研钵中，加蒸馏水15ml，经白纱布过滤，滤液备用。

每人一组进行实验。按讲义设计的表格进行操作。注意观察现象。

表1 过氧化氢酶的作用

管号 1 2 3 4 2%H2O2/ml 3 3 3 3 新鲜肝糜/g 0.5 --- --- --- 煮沸肝糜/g --- 0.5 --- --- 生马铃薯/g --- --- 1 --- 熟马铃薯/g --- --- --- 1 观察有无气泡放出，特别注意肝糜周围和马铃薯周围。

表2 过氧化物酶的作用

白菜梗提取管号 1 2 3 4 焦性没食子酸 2 2 2 2 2%H2O2/滴 2 --- 2 2 蒸馏水/ml 2 --- --- --- 液/ml --- 2 2 --- 煮沸的白菜梗提取液/ml --- --- --- 2 观察颜色变化和沉淀的出现。

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