一株反硝化光合细菌的生物学特性及系统发育分析

一株反硝化光合细菌的生物学特性及系统发育分析

摘要:【目的】养殖水体中亚硝酸盐的过量积累会对养殖生物产生毒害作用，应用脱氮细菌去除亚硝酸盐是养殖水质调控的重要手段之一，本文意在得到一株高效去除亚硝酸盐的光合细菌。【方法】采用软琼脂稀释法分离纯化光合细菌菌株，通过电镜观察、生理生化试验研究其生物学特性、依据 16S rDNA 和光合反应中心 M 亚基基因(Gene coding for photosynthetic reaction center subunit M，pufM)序列对其做系统发育分析。【结果】从淡水养殖塘中分离筛选到一株高效还原亚硝氮的光合细菌菌株 wps。该菌株为革兰氏阴性菌，细胞杆状，大小为 0. 4 － 0. 6μm × 1. 5 － 4. 0 μm，极生丛生鞭毛，片层状光合内膜，兼性厌氧光照条件生长，单菌落及液体培养物呈红色，含细菌叶绿素 a 和类胡萝卜素。最适生长 pH 范围为 5. 5 － 8. 5，最适生长盐度范围为0 － 2% ，最适生长温度范围为 25℃ － 38℃ 。菌株 wps 与 Rhodopseudomonas palustris 的 16S rDNA 序列相似性为 98. 9% ，光合反应中心 M 亚基基因序列的相似性为 94. 9% ，但是二者在生物学性质上有较大差异，如菌 株 wps 在 pH5. 5 生长，不能光自养生长，不利用柠檬酸盐、甲酸盐进行光异养生长，需盐酸硫胺素和泛酸钙做生长因子等。【结论】菌株 wps 可能为 Rhodopseudomonas 属的一个新种，且在养殖水体水质调控中具有重要应用前景。

关键词: 光合细菌，红假单胞菌，亚硝酸盐，反硝化

养殖水体的生态调控是水产养殖领域关注和研 究的重点之一。随着高密度养殖技术的推广，养殖 水质的控制成为养殖成功的一个关键问题。而养殖 水质恶化的指标之一就是养殖废水中存在较高的三 态氮，尤其是亚硝态氮浓度过高。亚硝酸盐的过量 积累对养殖生物产生毒害作用，高浓度亚硝酸盐可 致鱼虾等死亡 ［ 1 － 4 ］

，低浓度亚硝酸盐影响鱼类的血 蓝蛋白和多种代谢酶类的活性 ［ 1 － 2 ， 5 ］

，导致鱼虾等生 长缓慢 ［ 1 ， 3 ， 5

］

。因此，如何高效的去除亚硝酸盐是养 殖水质调控的重要目标之一。

亚硝酸盐的消除途径主要有两个，一是在亚硝 酸盐氧化菌的作用下转变成对养殖动物无毒的硝态 氮，另一个途径就是经反硝化细菌的作用，转变成氮 气进入大气 ［ 6 ］

。由于亚硝酸盐氧化菌属于化能自

养细菌，分离培养及规模化培养都非常困难，因此， 人们更加关注反硝化细菌的作用。反硝化细菌的种 类非常多，如光合细菌、产芽孢细菌、假单胞菌、盐单 胞菌等 ［ 7 ］

。光合细菌由于可利用小分子有机物，生

长不消耗氧气，自身又具有营养价值等优点被广泛 应用到水产养殖中 ［8 － 9］

。本文从淡水养殖塘底泥中Hui Chen et al. / Acta Microbiologica Sinica ( 2011 ) 51 ( 2 )

分离筛选出一株具有高效亚硝酸盐去除能力的光合 细菌菌株，对其进行了表型特征、生理生化特性研究 和系统发育分析。 1 材料和方法 1. 1 材料

1. 1. 1 样品来源:用于菌株分离的底泥采自浙江宁 波奉化某未使用微生物制剂的对虾养殖塘。

1. 1. 2 主要试剂和仪器:碳源、氮源、无机电子供体 等为分析纯试剂，购自宁波奥博生化试剂公司;DNA 提取试剂、PCR 试剂购自上海生工生物工程技术服 务有限公司。UV-3100PC 型紫外可见分光光度计 ( Apada );

CX31RTSF 系统生物显微镜 ( Olympus );

PIC-0100 PCR 扩增仪( Bio-rad);日立 S-3400N 扫描 电镜;日立 H-7650 透射电镜。 1. 2 培养基及培养条件

除特别说明，光合细菌富集、分离及生物学性质 研究均采用 ATY 培养基，即在 Imhoff 的 AT 培养 基 ［ 10 ］

基础上做了一些调整，具体组成:乙酸钠、丁二

酸钠、氯化铵和氯化钠各 1 g，氯化镁 0. 25 g，氯化 钙 0. 05 g，酵母膏 0. 2 g，微量元素母液 1 mL(每升 母液含氯化铁 1. 8 g;氯化铜 0. 01 g;硼酸 0. 5 g;氯 化钴 0. 25 g 氯化锰 0. 07 g;钼酸钠 0. 03 g;氯化镍 0. 01 g;氯化锌 0. 1 g) 和维生素母液 1 mL ( 每升母 液含生物素 10 mg、对氨基苯甲酸 20 mg、维生素 B 12

5 mg、烟酸 35 mg、盐酸吡哆辛 10 mg、盐酸硫胺素 30 mg、泛 酸 钙 10 mg )，加 水 至 1 L，pH7. 0。 在 30℃ 、光照为 2000 － 3000 lux 的条件下培养。 1. 3 菌株的富集和分离

取 1 g 底泥于装满液体培养基的厌氧管中，光

照培养约 7 d，直至出现红色培养物。富集样品采用 半固体培养基深层逐级稀释法获得单菌落 ［ 11 ］ ，将单

菌落转接到液体培养基中培养，待生长至对数后期， 再重复该稀释法分离纯化单菌落，直到培养基中没 有其他杂菌菌落出现且镜检无杂菌为止。 1. 4 细胞形态观察

扫描电子显微镜观察菌体形态及鞭毛，透射电 子显微镜观察光合内膜结构。 1. 5 活细胞吸收光谱测定

离心收集处于对数生长期的菌体，用生理盐水

洗涤 2 － 3 次后，将菌体悬浮于 60% 蔗糖溶液，以 60% 蔗糖溶液做参比，用紫外可见分光光度计检测 活细胞吸收光谱 ［ 12 ］

。波长范围为 300nm － 900 nm。

1. 6 光合细菌生理生化特性

以 ATY 培养基为基础，分别设置初始 pH 为

5. 0、5. 5、6. 0、6. 5、7. 0、7. 5、8. 0、8. 5 和 9. 0 的实验 组，观察不同起始 pH 对菌株 wps 生长的影响;调整

ATY 中的 NaCl 浓度分别为 0% 、0. 5% 、1% 、1. 5% 、 2% 、2. 5% 和 3% ，检测该菌株的盐度耐受范围; 分

别设置培养温度为 20℃ 、25℃ 、28℃ 、32℃ 、35℃ 、 38℃ 、41℃ 、44℃

，测定其生长温度范围。碳源利用

试验是在 ATY 培养基中，去除乙酸钠和丁二酸钠， 分别添加不同种类和浓度的待试碳源 ［13］ (丁二酸

钠、酵母膏、乳酸钠、乙醇、丙三醇、谷氨酸钠、葡萄糖 酸钠、柠檬酸钠、甲酸钠、酒石酸钠、松二糖、葡萄糖、 肌醇、海藻糖、半乳糖、甘露醇、山梨糖醇或苹果酸 钠)，以 ATY 为阳性对照，以不加任何碳源的 ATY 为阴性对照，观察其生长情况。氮源测定是以终浓 度为 0. 1% (W /V)的谷氨酸钠、尿素、亚硝酸钠和硝 酸钠取代 ATY 培养基中的氯化铵。含硫化合物无 机电子供体利用测定是把 ATY 培养基中的碳源替 代为碳酸氢钠，含硫化合物的终浓度分别为 0. 1%

(W /V) 硫、0. 5 mmol/L 硫代硫酸钠、0. 5 mmol/L 亚 硫酸钠或 0. 5 mmol/L 硫化钠 ［ 12 ， 14 ］

。必需生长因子

试验是去除 ATY 中的酵母膏和维生素母液中某一 生长因子(生物素、对氨基苯甲酸、维生素 B 12 、烟

酸、盐酸吡哆辛、盐酸硫胺素、泛酸钙) 以检查该生 长因子对菌株生长的影响。接种量均为 5% ，生长 因子试验是培养 120 h 后，其他试验均是培养 60 h 后，测定菌悬液 660 nm 处 OD 值。 1. 7 反硝化能力测定

用硝酸钠代替 ATY 培养基中的氨盐初步筛选

高效脱氮光合细菌，以检测亚硝酸盐的生成和观察 杜氏小管中气体的生成判定反硝化的有无及强弱; 筛选亚硝氮反硝化光合细菌则是在 ATY 培养基中 加入亚硝酸钠至 10 mg/L 终浓度。定量分析菌株

wps 的反硝化作用，则是调整亚硝态氮终浓度分别

为 1、10、50 和 100 mg/L，每个浓度做 3 个重复，接 种量为 5% (菌体数量大约为 5 × 10 6

个 /mL)。每隔

12 h 检测一次亚硝酸氮剩余量，计算出亚硝酸氮的

残存量，亚 硝 酸 氮 的 测 定 方 法 采 用 重 氮-偶 氮 法 (GB12763. 4-91)。

250陈慧等:一株反硝化光合细菌的生物学特性及系统发育分析. /微生物学报(2011)51(2) 1. 8 16S rDNA 与 pufM 基因的扩增、测序、系统发育 提取菌株基因组 DNA，分别用 16S rDNA 的引

物对 27f-1491r 和 光 合 反 应 中 心 M 亚 基 基 因 (

Photosynthetic reaction center subunit M ， pufM )的引

物对 557f-750r，进行 PCR 扩增，PCR 反应体系和反 应条件分别参照钱丽君等 ［15］

和 Achenbach 等 ［16］ ，

PCR 产物纯化后送去上海生工测序。 获得的序列

在 GenBank 登 录，得 到 16S rDNA 基 因 登 录 号 为 GU226427。在 NCBI 上 Blast 比对，下载相关序列， 用 MEGA 4 软件中的 Neighbor-Joining(NJ)法构建系 统发育树。 2 结果

2. 1 菌株 wps 的形态学特征 图 1 菌株 wps 的细胞形态结构

Fig. 1 Morphology and structure of cells of strain wps. A: Scanning

electron micrograph showing cell shape and polar multiple flagella (5000 × );

B:Transmission electron micrograph of ultra-thin sections，with arrow indicating the lamellar intracytoplasmic membrane (10000 × ) . 利用软琼脂深层逐级稀释法，从样品中分离、纯 化到 1 株光合细菌，命名为 wps。该菌株在光照厌 氧或微好氧条件下的液体培养物呈红色;不能在黑 暗好氧或厌氧条件下生长。光照厌氧或微好氧条件 下的单菌落为红色、球状;细胞革兰氏阴性，呈杆状， 稍弯曲，大小为 0. 4 － 0. 6 × 1. 5 － 4. 0 μm

，极生丛生

鞭毛(图 1-A)，细胞内有片层状光合内膜(图 1-B)， 生长晚期有玫瑰结结构。 2. 2 吸收光谱

菌株 wps 的活细胞吸收光谱如图 2 所示，在

805、863 nm 处都出现吸收峰，表明菌株含有细菌叶 绿素 a;在 490、500、520 － 534 nm 附近出现特征吸收 峰，表明有螺菌红质系的类胡萝卜素存在 ［10，12］ 。

图 2 菌株 wps 的活细胞吸收光谱

Fig. 2 Absorption spectra of living cells of strain wps. 2. 3 菌株 wps 的生理生化特性

菌株 wps 的生长最适初始 pH 范围为 5. 5 －

8. 0。该菌株在 0 － 3% 的盐度范围内均能生长，0 － 2% 盐度内均能最佳生长。菌株 wps 的生长温度范

围为 20 － 41℃ ，最佳生长温度为 25 － 38℃ 。菌株 wps 不能利用碳酸氢钠进行光合自养生长，对乙酸 钠、丁二酸钠和酵母膏利用较好，其次是乳酸钠、乙 醇、丙三醇、谷氨酸钠和葡萄糖酸钠。不利用下列碳 源:柠檬酸钠、甲酸钠、酒石酸钠、松二糖、葡萄糖、肌 醇、海藻糖、半乳糖、甘露醇、山梨糖醇、苹果酸钠。 除铵盐外，该菌株也能以谷氨酸盐和硝酸盐作为唯 一氮源生长，但不利用尿素。不利用单质硫、硫代硫 酸盐、亚硫酸盐以及硫化物为无机电子供体。生长 因子试验结果显示，菌株 wps 对泛酸钙和盐酸硫胺 素缺乏相对敏感，其他生长因子对菌株生长无影响。 251Hui Chen et al. / Acta Microbiologica Sinica ( 2011 ) 51 ( 2 )

2. 4 高效亚硝氮反硝化菌的筛选

我们首先以硝酸盐为唯一氮源代替 ATY 中的

铵盐，筛选具高效反硝化作用的光合细菌，发现 10 株光合细菌中除菌株 ZC 和菌株 T 外都有亚硝酸盐 和气体的产生，表明这 8 株菌均具有呼吸性还原硝

酸盐 及 亚 硝 酸 盐 的 能 力; 我 们 在 ATY 中 再 加 入 10 mg / L亚硝氮，筛选亚硝氮反硝化菌，发现菌株 T 和 ZC 也不具备亚硝酸盐反硝化活性，而其余 8 株 光合细菌的亚硝酸反硝化能力则得到了证实，其中

菌株 wps 的反硝化活性最高(表 1)。

表 1 十株光合细菌菌株亚硝酸盐反硝化作用

Table 1 The denitrification of nitrite by ten stains of photosynthetic bacteria *

Strain Identification Denitrification wps Rhodopseudomonas sp. + + pu Rhodopseudomonas sp. +

T Rhodopseudomonas palustris － ps Rhodobacter sp. +

ZC Rhodobacter spheroides － dc Most related to Proteus + cp1 Most related to Comamonas + sd Most related to Comamonas + su － a not determind + su － g not determind +

* The identificaion is based on the sequence of 16S rDNA gene 图 3 菌株 wps 对不同起始浓度的 NO － 2

－ N 的去除

Fig. 3 Removal of different initial concentration of NO － 2

－ N by strain wps.

定量测定了菌株 wps 去除亚硝酸盐性能，如图

3。在亚硝态氮浓度为 1 mg / L 和 10 mg / L 时，菌株 wps 分别在 12 h 内和 24 h 内完全去除亚硝酸盐;但 起始亚硝态氮浓度为 50 mg/L 时，菌株 wps 在前 48 h内亚硝态氮去除效率很低，之后亚硝酸盐反硝 化活性迅速提高，至 60 h 时，50 mg/L 的亚硝态氮也 全部去除;起始亚硝态氮浓度为 100 mg/L 的试验 组，一周内培养液内亚硝酸氮浓度仍无大的变化，菌 体生长也一直处于抑制状态。

2. 5 基于 16S rDNA 和 pufM 基因的系统发育学 分析

菌株 wps 的 16S rDNA 序列比对结果表明:菌株

wps 与 Rhodopseudomonas palustris 的 模 式 菌 株 (

ATCC17001 T

) 的 相 似 性 为 98. 9% ， 与 Rhodopseudomonas faecalis

( g-c T ) 和

Rhodopseudomonas rhenobacensis ( Rb T

) 的相 似性分

别为 98. 4% 和 97. 5% 。R. palustris 与 R. faecalis 和 R. rhenobacensis ( Rb T

) 的 相 似 性 分 别 为 98. 5% 和 97. 6% ，

R. rhenobacensis 与 R. faecalis 的相 似性为 98. 6% 。以 16S rDNA 序列构建的系统发育树也显 示菌株 wps 与所有 Rhodopseudomonas 属的种聚成一 簇(图 4-A)。光合作用功能基因 pufM 序列比对结 果表明，菌株 wps 与 R. palustris(ATCC17001 T )相似

性最高，达 94. 9% ，但与该属另两个种 R. faecalis(g- c T

)和 R. rhenobacensis(Rb T

)的相似性只有 88. 3% 和

85. 8% ，R. palustris 与 R. faecalis ( g-c T

) 和 R.

rhenobacensis ( Rb T

) 的 相 似 性 分 别 为 88. 8% 和

87. 6% 。基于 pufM 基因序列的系统发育树也显示， 菌株 wps 与 R. palustris (ATCC17001 T

)聚成一簇(图 4-B )。 3 讨论

从淡水养殖塘中分离出具有高效去除亚硝酸盐

能力的光合细菌菌株 wps，该菌株的 16S rDNA 序列 与 R. palustris 的模式菌株(ATCC17001 T

)相似度为

98. 9% ，二 者 的 pufM 基 因 序 列 的 相 似 性 也 高 达 94. 9% ，似乎可以定名菌株 wps 为 R. palustris。但是 从 16S rDNA 构建的系统发育树上可以看到菌株

wps 与 另 外 3 个 种 R. palustris、R. faecalis 和 R. rhenobacensts 呈平行关系，各种代表菌株之间的 16S rDNA 相 似 性 也 多 在 98% 以 上; Okamura ［ 17 ］ 等 以

99. 0% 的 16S rDNA 相似性为限，将红假单胞菌属 的 33 个菌株分为 8 个分类操作单元 ( Operational taxonomic unit，OTU )，DNA-DNA 杂交试验表明，至 少有 7 个 OTU 代表不同的种;同时，又考虑到菌株

wps 与 R. palustris 在生物学特性上有明显不同。 比 如，菌株 wps 具有丛生端生鞭毛，pH5. 5 可以生长，

252陈慧等:一株反硝化光合细菌的生物学特性及系统发育分析. /微生物学报(2011)51(2) 不能光自养生长，不利用柠檬酸盐、甲酸盐，需盐酸 硫胺素和泛酸钙做生长因子等(表 2)。因此，菌株 wps 很可能是一个新种，但还有待基因组间杂交试 验判定。

图 4 菌株 wps 的 16S rDNA(A)和 pufM(B)基因系统发育树

Fig. 4 Phylogenetic tree derived from 16S rDNA ( A) and pufM ( B) sequences showing the position of strain wps. Numbers in parentheses are the sequences’accession number in GeneBank. Numbers at the nodes indicate the bootstrap values on neighbor-joining analysis. Bars represents 0. 02% sequence divergence.

亚硝酸盐是水产养殖过程中产生的有毒物质，是

水产养殖的重要致病根源之一，常使养殖动物体抵抗 力下降，易患各种疾病 ［1 － 5］

。因此，亚硝态氮是养殖 管理中重点关注的一个指标 ［ 18］

。菌株 wps 可在 12 h

内完全去除 1 mg/L 的亚硝氮，即使 10 mg/L 的浓度， 也能在 24 h 内去除，且在 100 倍稀释的培养基中添加 0. 1 ppm 的 wps，菌体数约为 10 个 / mL 时，仍有明显 效果(将另文发表)。因此，菌株 wps 可用来高效净化

养殖水体的亚硝酸盐。从该菌株的生物学特性看，该 菌株也具有很好的生境适应性。如具有生长速度快， pH 适应范围宽，耐氧性高等特点，虽然分离自淡水养 殖塘，但是却有较宽的盐度适应范围，可以同时在淡 水和海水养殖环境中生长。此外，光合细菌可以吸收 利用环境中的有机物，菌体自身又具有较高的营养价 值可以作为养殖生物的饵料 ［ 18］

。因此，菌株 wps 在

养殖水体中具有重要的应用潜力。

253Hui Chen et al. / Acta Microbiologica Sinica ( 2011 ) 51 ( 2 )

表 2 菌株 wps 与 Rhodopseudomonas paslastris 的部分 生物学性质的区别

Table 2 The differences in biological characteristics between the strain wps and Rhodopseudomonas paslastris Characteristics wps R. palustris Cell shape Curved rod rod

Cell size ( μm) 0. 4 － 0. 6 × 1. 5 － 4. 0 0. 6 － 0. 9 × 1. 2 － 2. 0 Flagella Polar multiple Single Growth factors

Thiamine hydrochloride; Calcium pantothenate Aminobenzoic acid; Biotin

pH 5. 5 + －

Photoheterotrophically － + Citrate － + Formate － + Nitrite + － Urea － + Sulfide － + Thiosulfate － + 参考文献 ［ 1 ］

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254陈慧等:一株反硝化光合细菌的生物学特性及系统发育分析. /微生物学报(2011)51(2) Biological characteristics and phylogenetic analysis of a denitrifying photosynthetic bacterium Hui Chen，Demin Zhang * ，

Longgang Wang，Zhichong Pan

Key Laboratory of Applied Marine Biotechnology ，

Ningbo University ，

Ministry of Education ，

Ningbo 315211 ， China Abstract :［

Objective ］

Nitrite accumulation in aquaculture water is toxic to reared animals. One of the solutions to this

problem is to apply denitrifying bacteria. This paper is intended to get a strain

of phototrophic bacteria for efficient removal of nitrite from aquaculture water. ［

Methods ］

We used soft agar to isolate and purify phototrophic bacteria. We investigated biological characteristics of the isolate by means of light and electronic observations，physical and chemical tests. We

analyzed its phylogenetical position based on the sequences of 16S rDNA and the gene that codes for photosynthetic reaction center subunit M ( pufM ) . ［

Results ］

A photosynthetic bacterial strain ，

named wps ，

showing high removal

efficiency of nitrite，was isolated from the freshwater ponds. Cells were Gram-negative，rod-shaped，slightly curved，0. 4 － 0. 6 × 1. 5 － 4. 0 μm

，motile by means of polar multiple flagella. Intracellular membranes were of the lamellar type. It grew

under facultative anaerobic conditions in the light with bacteriochlorophyll a and carotenoid of sppirilloxanthin series as photosynthetic pigment. The optimum growth was obtained at pH 5. 5 － 8. 5，in a range of 0 － 2% salinity and at 25 －

38℃ . The similarity of 16S rDNA between strain wps and Rhodopseudomonas palustris was 98. 9% and 94. 9% for pufM gene. However

，there are significant differences between them in the morphological and physiological characteristics，i. e. grew at pH 5. 5

;no growth photoautotrophicaly with sodium hydrogen carbonate;could not utilize citrate or formate as only

carbon source;required thiamine hydrochloride and calcium pantothenate as growth factors. ［Conclusion］Strain wps may represent a novel species in genus Rhodopseudomonas and possibly find its application in the bioremediation of polluted

aquaculture water. Keywords

: photosynthetic bacteria，Rhodopseudomonas，nitrite，denitrification (本文责编:王晋芳)

Suported by the Science and Technology Project of Ministry of Education (208053)，by the Program for Changjiang Scholars and Innovative Research Team in University

(PCSIRT) (IRT0734)，by the National Program for High Technology Research and Development of China(2007AA10Z409)，by

the Natural Science Foundation of Zhejiang Province ( R305333 ) and by the Project of scientific and technological Innovation of Ningbo (2007A31004，2004A610026) *

Corresponding auther. Tel: + 86-574-87600164;E-mail:zhangdemin@ nbu. edu. cn Received :

6 July 2010 / Revised:25 October 2010 255

本文来源：https://www.bwwdw.com/article/uf4p.html