PCR仪原理及其应用

PCR仪的原理及其操作应用 §1. PCR仪的技术原理 §2. PCR仪的分类与应用 §3. PCR仪的操作步骤轻纺与食品学院 报告人：裴乐乐 指导老师：林教授

§1.PCR原理简介PCR(Polymerase Chain Reaction)即聚 合酶链式反应，主要用于DNA片段的体外 扩增，基本原理类似于DNA的天然复制过 程 ，其特异性依赖于与靶序列两端互补的 寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三 个基本反应步骤构成。

PCR原理示意图

PCR Cycle - Step 1 - Denaturation Template DNA by Heat (94oC)Target Sequence

Target Sequence

①模板DNA的变性：模板DNA经加热至94℃左右一定时 间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解 离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准 备；

PCR Cycle - Step 2 – Temperature is lowered (Tm ) and primers anneal to target sequences

②模板DNA与引物的退火(复性):模板DNA经加热变性成单 链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列 配对结合；

PCR Cycle - Step 3 -

At 72 o C Taq DNA polymerase catalyses primer extension as complementary nucleotides are incorporated③引物的延伸： DNA模板--引物 结合物在 TaqDNA聚合酶 的作用下，以 dNTP为反应原 料，靶序列为模 板，按碱基配对 与半保留复制原 理，合成一条新 的DNA 链。

End of the 1st PCR Cycle –

Results in two copies of target sequence每完成一 个循环需 2~4分钟， 2~3小时 就能将待 扩目的基 因扩增放 大几百万 倍。

Target AmplificationNo. of1 cycle = 2 Amplicon

No. Amplicon Copies of Target

Cycles

2 cycle = 4 Amplicon

1 2 3 4 5

2 4 8 16 32 64 1,048,576

3 cycle = 8 Amplicon

4 cycle = 16 Amplicon

5 cycle = 32 Amplicon

6 cycle = 64 Amplicon6 20

7 cycle = 128 Amplicon

30

1,073,741,824

§2.PCR仪的分类与应用 普通PCR仪：一次PCR扩增只能运行一个特定退 火温度的PCR仪，如果要做不同的退火温度需要 多次运行。 梯度PCR仪：一次性PCR扩增可以设置一系列不 同的退火温度条件(温度梯度),因为被扩增的 不同DNA片段，其最适退火温度不同，通过设置 一系列的梯度退火温度迚行扩增，从而一次性 PCR扩增，就可以筛选出表达量高的最适退火温 度，迚行有效的扩增。主要用于研究未知DNA退 火温度的扩增，这样节约成本的同时也节约了时 间。

原位PCR仪：用于从细胞内靶DNA的定位分析的细胞内基 因扩增仪，如病源基因在细胞的位置或目的基因在细胞内 的作用位置等。是保持细胞或组织的完整性，使PCR反应 体系渗透到组织和细胞中，在细胞的靶DNA所在的位置上 迚行基因扩增。 实时荧光定量PCR仪：在普通PCR仪的基础上增加一个荧 光信号采集系统和计算机分析处理系统，就成了荧光定量 PCR仪。其PCR扩增

原理和普通PCR仪扩增原理相同，只 是PCR扩增时加入的引物是利用同位素、荧光素等迚行标 记，使用引物和荧光探针同时与模板特异性结合扩增。扩 增的结果通过荧光信号采集系统实时采集信号连接输送到 计算机分析处理系统得出量化的实时结果输出。

四种PCR仪示意图

普通PCR

梯度PCR

原位PCR

荧光定量PCR

§3. PCR的操作步骤 1.配置反应体系：引物、模板、buffer,dNTPs, 酶，Mg2+,(如果是荧光定量PCR,则还有染料或 探针)。 2.在PCR仪上设置程序：一般是94℃变性5min使 模板充分变性,之后“94℃变性、退火(不同引物 温度不同)、72℃延伸”共30-35个循环，再72℃ 延伸10min, 使产物延伸完整，设置完程序后启 动机器运行。 3.如果是常规PCR,则后面还有电泳实验，如果 是荧光定量PCR则可以实时观察实验过程。

PCR反应

PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点

PCR反应高温变性 低温退火 适温延伸 温 度 72 (℃)

PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点

1

2

3

94

重复1~3步 25~30轮 目的DNA片段 扩增100万倍以上

形 成

DNA 2

55 22

条变 单性 链

子链延伸 DNA加倍 DNA单链 与引物复性

DNA双螺旋

1

2

3时间(min)

4

5

95℃

模板DNA

PCR的基本原理

PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点

50℃

引物1

DNA引物

引物2

PCR的基本原理Taq酶

PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点

72℃

引物1

DNA引物

引物2Taq酶

PCR的基本原理

PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点

72℃

第1轮结束 第2轮开始

PCR的基本原理

Taq

PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点

95℃

Taq

50℃Taq

72℃Taq

PCR的基本原理

PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点

72℃

第2轮结束

模板DNA

PCR的基本原理 第1轮扩增第2轮扩增 PCR反应条件 第3轮扩增 PCR过程 PCR的特点

理想拷贝数=2nn 循环次数

重复30轮后 第4轮扩增 第5轮扩增 第6轮扩增 30=1,073,741,824 2 实际拷贝数=(1+x)n X 平均效率,约为0.85 n 循环次数

最近自己做的PCR扩增实验1.提取样品中酵母菌的DNA 2.配置好体系后用普通PCR仪迚行扩增(所用引物是EF3和 EF4) 3.做琼脂糖凝胶电泳实验，并用凝胶成像仪观察DNA条带 用到的PCR扩增程序：(1)94℃ 5min (2)94℃ 45s 51℃ 1min 72℃ 2min 设置第二步共30个循环，最后72℃ 保持10min

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