分子水平上益生菌研究进展

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中 国 生 物 工 程 杂 志

第24卷第10期

CHINABIOTECHNOLOGY

2004年10月

分子水平上益生菌研究进展

袁铁铮 姚 斌

**

(中国农业科学院饲料研究所 北京 100081)

摘要 益生菌是指能在生物体内存活,对生物体的健康有益的一类微生物。目前已经对益生菌的作用机理进行了深入和广泛的研究,获得了许多使用益生菌的经验。近些年来,分子生物学特别是基因工程技术的发展将益生菌的理论和应用研究推向了一个新的高度。从益生菌菌株的鉴定、菌株的遗传学修饰、益生菌功能基因组学和安全性等几个方面,综述了近年来国际上在分子水平上研究益生菌的技术方法、获得的主要研究成果和面临的挑战,并提出了益生菌研究的发展方向。

关键词 益生菌(益生素) 分子生物学 安全性 遗传修饰 一般认为益生菌就是指能够在生物体(主要是人和动物)内存活,对宿主的生命健康有益的一类微生物

[1~3]

的生理功能已经得到公认,并且在食品、畜牧、医药等领域都被大量应用。

在农业上,益生菌主要用于维持动物体内微生态系统的平衡,即在幼龄家畜尚未建立起良好的肠道微生物区系的情况下,使用益生菌减少动物生产损失;益生菌还能够部分替代抗菌药物,通过帮助恢复动物体内微生态系统的平衡,达到治疗动物疾病的目的,具有使用安全、无残留、不产生抗药性的优点。另外在饲料中添加能分泌纤维素酶、淀粉酶、葡聚糖酶等多种消化酶的益生菌,能补充畜禽自身酶系不全或酶量的不足,提高畜禽对饲料的利用率,同时益生菌自身也可以是一种很好的饲料原料。

目前人用益生菌主要使用乳酸菌和双歧杆菌,涉及婴儿食品、发酵过的奶制品和药用制剂三类,随着益生菌研究的深入,出现了含有所谓益生元(Gibson,1995)的功能性食品。大量研究表明益生菌能够通过恢复或改善人体内的微生态平衡和刺激机体的免疫机能,防治与细菌感染有关的疾病(包括胃肠道疾病、泌尿系统感染),降低乳糖不适应症,改善食品的营养价值,抗肿瘤抗突变延缓衰老等。

[3]

,一般把益生菌活菌制剂或含有微生物

培养物的微生物制剂称作益生素。从上个世纪初人们就开始认识到微生物及其产物能够对机体产

生影响,并且从细菌、真菌、酵母等微生物中筛选得到了许多被认为是益生菌的微生物。从Lilly和Stillwell(1965)提出 Probiotics(益生菌) 的概念到现在,在微生物菌群之间的关系、菌群细胞自身的代谢、与疾病的关系等方面都进行了深入研究,在应用于人以及畜禽方面积累的很多经验,出版了多本有关益生菌的专著。益生菌研究囊括了多个学科,传统的微生物学方法已经为益生菌的研究奠定了良好的基础,随着分子生物学方法的大量应用,把益生菌研究推向细胞和分子水平上。

[1,3~6]

1 目前对益生菌益生作用的认识

综合目前文献的报道,多数益生菌的益生作用主要体现在以下三个方面:防治消化道疾病、帮助消化吸收和刺激免疫系统。在所有益生菌当中,乳酸菌(lacticacidbacteria,LAB)是目前最受重视、研究得最深入的一类,目前对乳酸菌在维持肠道菌群平衡的作用、与免役系统的关系、营养学意义、基因表达和调控等方面都做了研究。益生菌具有重要

收稿日期:2004 07 05 修回日期:2004 08 18*通讯作者,电子信箱:yaobin@

2 分子水平上研究益生菌的几个热点问题

综合近几年的文献,可以发现益生菌的研究呈

现两个特点:(1)大量借鉴其它学科领域发展比较成熟的技术手段,主要涉及菌株的分离与鉴定的方

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对益生菌作用机理的研究,主要包括消化道内微生物菌群的动态变化、菌体细胞的代谢、菌群与宿主免疫系统的关系、菌群对宿主代谢的影响等方面,开始关注益生菌使用的安全性,结合益生菌功能基因组学研究,对细胞内基因的表达和调控进行研究。下面概述一下在分子水平上研究益生菌的一些研究进展。

2 1 菌株的分离与鉴定

动态的、完整的描绘整个消化道内微生物的分布和组成,对于正确评价益生菌在细胞水平上的营养调控机制和评价益生菌制剂的质量具有重要意义。应用分子生物学的方法,能够根据益生菌基因组DNA序列的特异性,进行群间、属间、种间、亚种间、乃至菌株之间的鉴定,帮助从复杂的培养物中间分离菌株。

帮助鉴定益生菌的分子生物学方法主要包括基因组探针技术和基因组指纹技术(如RFLPs技术、RAPD技术和AFLPs技术)。探针技术与生物芯片技术结合,能够从复杂微生物环境中快速检出并追踪感兴趣的菌株,探针技术使用的探针包括核糖体寡核苷酸探针(一般是16SrRNA)、全染色体探针、根据基因组的特殊的序列设计的DNA片段、质

[8]

[7]

粒DNA探针等。基因组指纹技术利用DNA片段长度的多态性,能够区分不同的菌株,帮助分析动态的、多样的微生物菌群。

另外PCR技术和其它技术联用为益生菌的研

究提供了有力的技术手段,PCR技术相对简单快速,不需要进行繁杂的微生物培养,利用专一性的引物,分析复杂菌群的菌种分布情况,检测染色体上是否存在致病因子的基因,帮助进行菌株鉴定。2 2 益生菌细胞的遗传修饰

利用基因工程技术改良已经过筛选或被证明有临床效果的菌株,拓宽它的应用范围,增强应用效果。与传统诱变方法相比,直接对染色体DNA定向操作更可能保持菌株原有的优良性状。这方面研究比较多的益生菌就是乳酸菌,归纳起来主要有两条技术路线:

2 2 1 利用益生菌作为体内生物反应器表达外源基因 目前芽孢杆菌、酿酒酵母和乳酸菌都可以作为表达外源基因的宿主菌,其中乳酸菌作为 体内生物反应器 最有代表性,也可能是最有价值的。表达的外源基因主要包括酶基因和治病 抗病基因,目前许多报道都集中在对促进消化的外源酶基因的克隆和表达(表1)。

表1 使用益生菌作为 体内生物反应器 表达外源基因

Table1 Heterologousgeneexpressedbyprobioticsorganismsas endo bioreactor

宿主菌Host

Lactococcuslactis

Lactobacillusgasseri、L.johnsoniiL.plantarumL.plantarumL.plantarumStreptococcilactisL.acidophilus

表达产物Expressedproduct脂肪酶内切葡聚糖酶 淀粉酶 淀粉酶内切葡聚糖酶 半乳糖苷酶 半乳糖苷酶

外源基因来源

SourceofheterologousgeneStaphylococcushyicusClostridiumthermocellumBacillusstearothermophilusBacillusamyloliquefaciensClostridiumthermocellumE.coliL.bulgaricus

文献ReferencesDrouaultetal,2002Jaie Soonetal,2000Scheirlincketal,1989Jonesetal,1990Batesetal,1989DeCosetal,1988Linetal,1996

另外随着对益生菌与免疫系统关系研究的深入,有人提出利用食品级的乳酸菌作为活疫苗,

或者把乳酸菌作为受体菌表达和运输抗原分子,但是尚未见成功应用的报道。

把益生菌作为表达外源基因的宿主菌,除了必须得到适合基因操作的菌株外,还必须建立合适的载体以及解决外源基因表达的相关问题,从目前的报道来看主要表现出以下一些特点:(1)目前受体

[9]

菌主要使用乳酸菌,特别是乳酸乳杆菌;(2)构建表达载体的一些元件都来源于益生菌;(3)表达载体

[10~12]

通常使用诱导型的启动子(见表2);(4)一些研究表明整合到染色体上的外源基因稳定性较高。其中使用nisA nisF启动子的乳酸菌表达系统是近些年发展起来的,表达过多种外源基因,进行诱导表达的诱导物是一种3 5kDa大小的抗菌肽!!!乳链菌肽nisin,可以在食品中使用。

[13~16]

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表2 在乳酸菌中表达外源基因使用的启动子Table2 Characteristicsofinduciblepromoters

forexpressinggenesinLAB

启动子PromoterlacA lacRnisA nisFtrpEpal70

说明

Relevantproperties

来源于ctis,诱导型启动子,诱导物是乳糖来源于ctis,诱导型,诱导物是nisin来源于ctis,诱导型启动子,限制色氨酸诱导型启动子,低温或低pH启动表达

脱氢酶(LDH,lactatedehydrogenase)降解丙酮酸,产生乳酸,引发D 乳酸中毒,如果能得到不产生乳酸脱氢酶的乳酸菌就能解决乳酸中毒症的问题,目前已经得到植物乳杆菌L.plantarum、瑞士乳杆菌L.helveticus、约氏乳杆菌L.johnsoniiLa1乳酸脱氢酶缺陷型菌株(ldhD)

-[17]

。

2 3 报告系统

报告系统能够对菌体细胞代谢进行动态监测,建立报告系统首先要将报告基因(见表3)转化到益生菌中,筛选得到表达报告基因的重组菌株,把报告基因的产物作为生化标记,通过检测这些生化标记,监测益生菌生长繁殖情况、益生菌基因表达情况、与宿主和有害微生物之间的相互作用等。

2 2 2 对内源基因的遗传修饰 对益生菌染色体上内源基因的遗传修饰主要指敲除有害基因,构建缺陷型菌株,或者改造功能性的内源基因,筛选

更为优良的益生菌菌株。报道比较多的是对乳酸杆菌进行遗传修饰,研究表明乳酸杆菌在儿童体内帮助调控肠道菌群,但是许多乳酸菌能够产生乳酸

表3 用于益生菌体内监测的报告基因

Table3 Reportergeneformonitorinprobioticsorganisms

报告基因Reportergenes

cat 194(Staphylococcusaureus)gusA(E.coli)

lacL lacM(Leuconostocmesenteroides)amyL(Bacilluslicheniformis)luxAB(Vibriofischeri)nuc(S.aureus)gfp(Aequoreavicoria)

基因产物Expressedproduct氯霉素乙酰转移酶 葡糖醛酸酶 半乳糖苷酶 淀粉酶荧光素酶核酸酶绿色荧光蛋白

参考文献ReferencesAchenetal,1986Christetal,1994Hansetal,1995Pascaletal,1992Eatonelal,1993Poquetetal,1998Martinetal,1994

用作报告基因的gfp基因编码绿色荧光蛋白GFP,检测时不需要外源底物或辅因子,可以监测基因表达和在活细胞里定位蛋白质,实现在消化道内实时监测GFP菌株的代谢情况。已经在小

鼠内使用GFP作为生化标记,通过乳酸菌表达gfp基因,利用流式细胞计量术,对发荧光的乳酸菌计数,监测乳酸菌的生命活动,分析乳酸菌与不同细胞的相互作用,到目前GFP系统已经被成功地应用于Mycobacteriumbovis、Streptococcusthermophilcus、Lactococcuslactis、Lactcoccusplantarum等多种益生菌。

2 4 安全性

虽然目前对益生菌安全性并没有公认的解释,但综合目前对益生菌的研究对益生菌安全性可以获得如下的认识:益生菌一定不能是致病菌而且不能产生有害物质,菌株不能通过遗传修饰获得有害基因或者具有把有害基因转移的潜力,这里的有害[20]

[9]

+

[18,19]

耐药性是筛选益生菌的一个重要指标,许多微生物自身存在抗某些抗生素的抗性基因,一方面益生菌只有对抗菌物质具有一定耐受性才能在消化道内存活,另一方面益生菌因为具有抗性而成为耐

[21~23]

药性的病原体,就会导致一些临床问题。通常肠道球菌Enterococcusfaecalis和E.faecium对万古霉素(vancomycin)敏感,但是陆续从抗性菌株分离到了抗性基因van基因,还发现一些肠道球菌能够获得van抗性基因。甚至还发现一些乳酸菌,如Lactobacillus、Pediococcus、Leuconnostoe、L.rhamnosus等自身存在包括抗万古霉素的一些抗性基因,但这些基因与van基因没有同源性,也没有证据表明乳酸菌会把抗性基因转移到其它微生物当中

[24]

。

值得注意的是益生菌株如果含有可转移的耐药性因子,那么对宿主生物体安全是有害的。目前认为由于基因转移获得致病基因可能是造成益生菌转变成有害菌的一个重要因素。肠道球菌被认(

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基因信息,少数情况下会成为致病菌,当然这与宿主的免疫状况很有关系。2 5 益生菌的功能基因组学

大规模全基因组测序为开展微生物基因组学研究提供了可能,同时为益生菌的研究开辟了一条全新的道路,形成所谓的益生菌功能基因组学研究。根据目前得到的资料,已经完成枯草杆菌

[26]

(Bacillussubtilis)、乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)

[27][25]

深入一些以外,大部分益生菌的研究只停留在作用效果研究上,而且这些研究结果还不系统,应该讲益生菌的研究还存在诸多难点,面临一些问题。3 1 缺乏行之有效的研究平台 因为益生菌需要在消化道内发挥作用的,消化道内多种微生物构成了一个复杂的微生态环境,单纯通过体外微生物培养,很难全面认识某种益生菌的作用;一般的作用效果研究,还受宿主的群体和个体差异的影响,只能观察间接的生理指标,很难排除各种不确定因素对实验结果的影响。

主要是一些关键技术方法有待创新:利用体外微生物培养从复杂环境进行菌株分离已被证明很有效,但是许多微生物是不能培养的,数量少的微生物菌群可能不被检出,所以要动态的检测肠道微生物的组成分布就有困难,也无法全面描述整个微生态环境,而且费时,工作量巨大,工作过程中很难预测和评估。其次目前鉴定菌株的分类方法主要依赖于表型特征,但是有可重复性差,大规模检测费时费钱,分辨率低的缺点,虽然应用分子生物学方法有力地补充了传统方法的不足,但是对于亲缘关系很近的种或进行种内鉴定时分辨率不高。最后由于缺少细胞内部代谢和基因调控的知识,相关的技术方法也不够完善,利用基因工程技术对益生菌细胞进行遗传修饰成功的例子并不多。

所以面对这样比较复杂的研究系统,有必要建立一套研究平台,包括选择几种生理代谢研究得比较清楚、对细胞内部基因调控研究得比较深入的微生物模式种,选择合适的实验动物,建立一系列有针对性的分析方法等等。3 2 菌株作用效果的重复性差

有的益生菌菌株在应用时存在较大的不确定性,有时作用效果不理想,可能有以下几个原因:3 2 1 菌株自身的缺陷 有的益生菌菌群要发挥作用对宿主的消化道条件要求较高,有的在消化道内的定殖能力差,有的抗逆性差存活期短,这些因素都影响益生菌持续发挥作用。

3 2 2 益生菌的安全性问题 益生菌有益生作用并不意味着它没有有害作用,许多益生菌存在这样的争议,比较典型的就是肠道球菌,它能够维持人或动物肠道内微生物的菌群平衡,用于治疗胃肠炎,也是一些食物当中的正常菌群,但是同时也能产生细菌毒素,污染食品,导致食物中毒。问题在(、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)

[30]

[28,29]

、

植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)全基因组的

测序,其它一些益生菌的全基因组测序工作也正在进行中(表4)。

表4 有关益生菌的测序情况1)

Table4 Genomessequencinginprogressof

probioticsorganisms

菌株Strain

完成全基因组测序的益生菌 Bacillussubtilis168枯草杆菌 LactococcuslactisIL1403乳酸乳球菌 SaccharomycescerevisiaeS288c酿酒酵母 Lactobacillusplantarum植物乳杆菌正在进行全基因组测序的益生菌 Aspergillusnidulans构巢曲霉 Aspergillusniger黑曲霉

BacilluscereusATCC10987腊状芽孢杆菌 Bacillusstearothermophilus10嗜热脂肪芽孢杆菌

Bacteroidesforsythus富塞思拟杆菌 BacteroidesfragilisNCTC9343脆弱拟杆菌 EnterococcusfaecalisV583粪肠球菌 EnterococcusfaeciumDO屎肠球菌

LactobacillusacidophilusATCC700396嗜酸乳杆菌

StreptococcusthermophilusLMG18311嗜热链球菌

3034.55.2NDND5.33.02.81.91.804.202.36133.31基因组大小Size(Mb)

1)数据来源TIGRMicrobialDatabase,URL:http:

研究功能基因组学的目的是研究基因突变对菌株安全性的影响,发展抗有害菌的微生物,指导益生菌的代谢工程,指导新酶或新基因的功能鉴定,实现对感兴趣的菌株进行高通量的突变分析,发展针对有害微生物的快速鉴定方法,确定种间、属间的遗传学分子标记等。

3 益生菌研究存在的问题

虽然国内外已有大量商品化的益生菌产品问世

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recognised as safe)之间的界限并不清晰,一些机会致病菌可能是人或动物消化道内的正常菌群,具有一定的生理作用,但是在某些条件下会产生有害作用;还有证据表明一些致病菌的变种可以产生与传统益生菌相类似的作用。(2)有些菌株在遗传上不稳定。遗传不稳定原因可能有多种,目前已经证明有许多菌株容易接受外源DNA,存在安全的菌株变成有害菌株的可能。

3 2 3 菌株不纯 常规手段分离鉴定菌株的分辨力不够高,不能保证菌株中所有细胞在遗传上是一致的,由于工业上连续大规模使用,如果缺乏足够的选择压力,其中的 杂菌 可能产生的副作用是无法预料的。Lin等报道过三个L.acidophilus菌株中,只有一株能够降解乳糖,还有报道发现在一些商品化的益生菌中对所含益生菌的鉴定比较

[33]

混乱。

3 3 缺乏技术标准

缺乏包括筛选、效用、安全性和产品质量等方面的统一技术标准,一方面是因为益生菌理论研究落后于实际应用,即使是对应用历史很长的益生菌的作用机理还不完全清楚,大多数的研究仅停留在试验使用效果的水平上,结果差异大,甚至可能出现相反的结果;另一方面由于必要的技术方法不完善,对于如何评价某一种益生菌的益生作用还需要进行深入的研究。

评价标准不统一是阻碍益生菌应用的巨大障碍,限制了应用范围,增加了开拓市场的难度。目前生产在人或动物上应用的益生菌,必须参照相关立法部门的规定,在我国可以参照卫生部颁布的 益生菌类保健食品评审规定 (只列出了9种益生菌)和农业部第105号公告公布的允许使用的饲料添加剂品种目录(列出了饲料级微生物添加剂12种),这些微生物都有较长的安全使用历史,还有许多微生物不在批准之列,虽然有报道证实它们具有益生作用,但是就现有的技术条件要获得管理部门和市场的认可还需要时间,这就造成一些益生菌不能够大规模应用。

[32]

[31]

索。在分子水平上研究益生菌能够把益生菌的研究推进到一个更高的层次,通过研究在消化道内菌体细胞的代谢、宿主对菌体细胞生产的功能性成分的利用、微生物菌群对宿主各器官的影响以及菌群之间的相互作用,真正弄清楚益生菌在生物体内所扮演的 角色 。4 2 安全性日益重要

近年来,一些重大食品安全事件的爆发使人类认识无论是食品还是饲料,只要最终消费者是人,那么之前所有环节都至关重要,在这样一个背景下,使用益生菌在保障和提高食品安全性必然有它的重大意义。同时随着对安全性认识的逐步深入,也不断对益生菌制剂的自身质量提出了新的要求,所以无论是从技术发展情况和研究成本,还是从法律法规要求和消费者的心理承受能力的角度讲,应该深入研究益生菌的作用机理、开发功能明确、安全性较高的益生菌;或者直接加入功能性成分代替使用活菌制剂,这样效果更直接也便于效果评估。4 3 应用更有针对性

益生菌对人或动植物的作用通常都是间接的,更多情况下是与其它措施综合运用,益生菌的特殊性决定益生菌的使用必须有针对性,就是指产品功能明确,使用对象有针对性。在畜牧生产当中,必须找到生态效益和经济效益的最佳结合点,认识到益生菌特殊作用的同时,不能无限夸大它的作用,开发针对不同禽畜和在畜禽的不同发育阶段时应用的专用益生菌产品。对于人用益生菌更多是关注益生菌在改善食品营养品质的巨大贡献以及益生菌产品中的活性成分,根据需要开发针对不同人群和在人体不同发育阶段甚至在不同生理条件下使用的专用益生菌产品。

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4 展 望

4 1 益生菌作用机理研究仍然是核心问题目前对益生菌的研究都意在揭示益生菌在生物体内的作用,并研究如何加以利用,但是即使是几,

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John

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InvestigationofProbioticsthroughMolecularBiology

YUANTie zheng YAOBin

(FeedResearchInstitute,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Beijing 100081,China)

Abstract Probioticsiscommonlydefinedasviablemicroorganismswhichexhibitabeneficialinfluencesonthehealthofthehostwhentheyareingested.Historyofresearchandapplicationsislongenough.Mechanismofprobioticshasbeeninvestigatedwidelyandthoroughly,andlotsofresultsarepracticableinapplications.Nowadaysthedevelopmentofmolecularbiology,especiallygeneticengineeringtechnology,promotesboththetheoreticalresearchandapplicationsofprobiotics.Thispaperreviewstheprobioticsresearchprogressesandtrendsinmolecularbiology,fromtheidentificationofstrain,safetytogeneticmodificationofprobiotics.Moreover,futurerecommendationforthedevelopmentofprobioticsisgiven.

Keywords Probiotics Molecularbiology Safety Geneticmodification

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#现代固态发酵原理及应用 陈洪章等主编 2004年8月出版 定价:30元

固态发酵是指没有或几乎没有自由水存在下,在有一定湿度的水不溶性固态基质中,用一种或多种微生物的一个生物反应过程。从生物反应过程的本质考虑,固态发酵是以气相为连续相的生物反应过程。固态发酵具有节水、节能的独特优势,属于清洁生产技术,现已逐步得到世界各国的重视。本书从全新的角度并从发展的观点来讨论固态发酵,以期使人们对固态发酵有重新的认识。

本书共分两大部分:第1部分介绍现代固态发酵技术原理、研究进展等;第2部分简要叙述固态发酵具体应用的工艺路线等。本书所讨论的内容充分体现了现代的特色,已经跳出了我国传统的固态发酵的范畴,纯种大规模培养及基因重组工程菌等概念已深入其中,不但表明了液体发酵无法取代传统食品生产中的固态发酵,也显示了我国在固态发酵研究和应用领域的领先性。

#生物技术原理与方法 刘佳佳等主编 2004年8月出版 定价:30元

本书系统地介绍了微生物的分类和分类技术,细胞的分离纯化与保存,细胞的生长与检测,基因的复制、修复、转录、表达与调控,基因重组技术,生物反应器,干细胞工程和生物技术在医药工业中的应用。本书选材注重工科的学科特点,同时强调基础知识,力求做到理论与实际应用并重。本书可作为生物工程、发酵工程、制药工程、食品科学与工程等专业的本科生、研究生的教学用书,也可作为生物工程领域的工程技术人员的参考书。

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