实验记录

实验名称：EGFR基因突变的检测 实验标本：D13229、D13230

实验目的：检测样品是否存在EGFR突变

实验试剂：QIAGEN DNA FFPE Tissue Kit、人EGFR基因突变检测试剂盒（Taqman-ARMS

法）（为真，20种突变类型）

实验仪器：Roche LightCycler 480荧光定量PCR、Nanodrop2000分光光度计、生物安全柜、

离心机、恒温金属浴。

实验方法：探针法 实验步骤：一、DNA提取

1、 切取5μm厚度的组织片3片，放入EP管中；

2、 加入1ml二甲苯振荡混匀，充分溶解石蜡，14000rpm离心2min，吸去上清； 3、 加入无水乙醇1ml，14000rpm离心2min，吸尽上清，开盖挥发（约10min）； 4、 加入180μlATL和20μl蛋白酶K，震荡混匀； 5、 56℃1h 6、 90℃1h

7、 短暂离心，加入200μl AL，震荡混匀； 8、 短暂离心，加入200μl无水乙醇，震荡混匀；

9、 短暂离心，将液体移入收集柱中，8000rpm离心1min，更换新的收集管； 10、 加入500μl AW1漂洗液，离心8000 rpm，1min，更换新的收集管； 11、 加入500μl AW2漂洗液，离心8000rpm，1min，更换新的收集管； 12、 离心14000rpm，3min，丢弃收集管，更换成1.5ml离心管； 13、 加入ATE（洗脱液）50μl，室温静置2min； 14、 离心14000rpm，1min，收集洗脱液。 二、DNA浓度调整

1、用分光光度计检测DNA样品，记录样品浓度、260/280值； 2、DNA样本统一稀释浓度为5ng/μl，共20μl。 三、检测

1、取八联管、DNA聚合酶、纯化水、阳性质控品、稀释后的DNA样品置于4℃冰箱中；

2、八联管、阳性质控品、样品混匀后稍离心，置于冰上；DNA聚合酶、纯化水

稍离心后置于冰上；

3、按每管：1.64μl DNA聚合酶、63.96μl 纯化水、16.4μl 样品；混匀成总体积82μl的MIX混合液。混匀后稍离心；

4、八联管中每孔加入10μl MIX混合液，一条八联管对应一个样品；加样完成后，轻混匀后稍离心； 5、程序设置：

第一阶段：95℃，5min，1循环；

第二阶段：95℃，20s、63℃，40s，45循环； 第三阶段：40℃，10s，1循环。 四、结果分析

1、NTC无扩增曲线升起，或Ct≥40； 2、阳性质控Ct≤30；

3、Control，FAM通道，Ct≤35；

4、结果判定：阴性：无扩增曲线，或Ct≥40； 阳性：曲线呈S型且Ct≤38。

实验结果：

提取的DNA浓度 260/280比值 结果

D13229 D13230

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