新型毕赤酵母分泌表达载体的构建与功能验证

第４０卷第７期

２００９年７月东北农业大学学报ＪｏｕｒｎａｌｏｆＮｏｒｔｈｅａｓｔ４０（７）：５５－５９Ｊｕｌｙ２００９Ａ—ｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ

新型毕赤酵母分泌表达载体的构建与功能验证

宋庆凤，暴立娟，李杰’

（东北农业大学生命科学学院，哈尔滨１５００３０）

摘要：巴斯德毕赤酵母（Ｐ／ｃｈ／ａｐａｓｔｏｒ／ｓ）是目前应用最广泛的外源蛋白表达系统之一。用于毕赤酵母表达系统的表达栽体种类繁多，却因需要甲醇诱导表达或者基因转化过程中引入抗生素基因而限制了其在食品行业中的应用。研究设计以毕赤酵母组成型启动子一ＧＡＰ启动子替换毕赤酵母表达栽体ｐＰＩＣ９上的甲醇诱导型启动子ＡＯＸ，成功构建了毕赤酵母组成型表达栽体ｐＧＡＰＨａ。并以里氏木霉木聚糖酶基因ｘｙｎ２为报告基因进行功能验证，结果表明，该载体可实现ｘｙｎ２基因在毕赤酵母中的高效表达。在此基础上以经密码子优化后的克鲁维酵母菊粉酶基因信号肽ＩＮＵ替换栽体上原有的ａ—Ｆａｃｔｏｒ信号肽，结果表明，ＩＮＵ信号肽能够有效引导ＸＹＮＩＩ的分泌。

关键词：毕赤酵母；表达裁体；ＧＡＰ启动子；ＩＮＵ信号肽

中图分类号：文献标识码：Ａ文章编号：１００５—９３６９（２００９）０７－００５５－０５

ＣｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎａｎｄｐｒｏｂａｔｉｏｎｏｆｎｅｏｔｙｐｅｓｅｃｒｅｔｉｎｇｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒｓｆｏｒＰｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ／ＳＯＮＧＱｉｎｇｆｅｎｇ，ＢＡＯＬｉｊｕａｎ，ＬＩＪｉｅ（ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ，ＮｏｒｔｈｅａｓｔＡｇｒｉｃｕｌ—ｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈａｒｂｉｎ１５００３０，Ｃｈｉｎａ）

ｏｎｅＡｂｓｔｒａｃｔ：Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓｉｓｏｆｔｈｅｆｏｒｅｉｇｎｐｒｏｔｅｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｙｓｔｅｍｗｈｉｃｈｈａｓｂｅｅｎｗｉｄｅｌｙ

ｕｓｅｄ．ＴｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒｓｆｏｒＰｉｃｈｉａｐａｓｔｏｄｓａｒｅｖａｒｉｅｄ，ｂｕｔｔｈｅｙｃａｎｎｏｔｂｅｕｓｅｄｉｎｆｏｏｄｖｏｃａｔｉｏｎ，ｂｅｃａｕｓｅｏｆｔｈｅｎｅｅｄｏｆｍｅｔｈａｎｏｌｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄｔｈｅｌｅａｄｉｎｇ－ｉｎｏｆａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｇｅｎｅｂｙｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ．ＴｈｉｓｒｅｓｅａｒｃｈｄｅｓｉｇｎｅｄｔｏｒｅｐｌａｃｅｔｈｅｍｅｔｈａｎｏｌｉｎｄｕｃｅｄＡＯＸｐｒｏｍｏｔｅｒｂｙＰｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉ＃ｓｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌｐｒｏｍｏｔｅｒ．ＧＡＰｐｒｏｍｏｔｅｒ，ａｎｄｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄｔｈｅｓｅｃｒｅｔｉｎｇｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒｐＧＡＰＨａｆｏｒＰｉｃｈｉａ

ａｓｐａｓｔｏｒｉｓ．Ｔｈｅｇｅｎｅ

ａｅｎｃｏｄｉｎｇｅｎｄ争争１。４－ｘｙｌａｎａｓｅｆｒｏｍＴｄｃｈｏｄｅｒｍａＲｅｅｓｅＬａｎｄｘｙｎ２ｇｅｎｅｗｅｒｅｕｓｅｄｒｅｐｏｒｔｅｒｇｅｎｅ，ａｎｄｔｈｅｎｔｈｅｆｕｎｃｔｉｏｎｐｒｏｂａｔｉｏｎ

ｏｎｉｎｄｉｃａｔｅｄｔｈａｔｔｈｅｘｙｎ２ｇｅｎｅｃｏｕｌｄｂｅｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｅｄｉｎＰｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ．ＢａｓｅｄｔｈｉｓｎｅｏｔｙｐｅｓｅｃｒｅｔｉｎｇｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒｐＧＡＰＨａⅡ．ｗｅｒｅｐｌａｃｅｄｔｈｅａ－Ｆａｃｔｏｒｂｙ

ｉｎｕｌａｓｅｇｅｎｅ＇ｓｓｉｇｎａｌｐｅｐｔｉｄｅｓｅｑｕｅｎｃｅ

ｃｏｕｌｄａｌｓｏｗｈｉｃｈｈａｄｂｅｅｎｏｐｔｉｍｉｚｅｄｉｎｃｏｄｏｎ．ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｕｔｉｌｉｔｙｇｕｉｄｅｔｈｅｓｅｃｒｅｔｉｎｇｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｘｙｎ２ｇｅｎｅ．ｓｈｏｗｅｄｇｅｎｅ。ｓｓｉｇｎａｌｐｅｐｔｉｄｅ

Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ；ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒ；ＧＡＰｐｒｏｍｏｔｅｒ；ＩＮＵｓｉｇｎａｌｐｅｐｔｉｄｅ

随着蛋白异源表达的飞速发展，越来越多的

表达系统被建立并得到应用。酵母作为单细胞真

核生物，因具有比较完备的基因表达调控机制和

对表达产物的加工修饰能力，仍表现出不可比拟

的优势。以甲醇营养型酵母（Ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃｙｅａｓｔ）一

毕赤酵母为代表的第二代酵母表达系统，是近年

来被公认的最有效的外源蛋白表达系统之一，已

收稿日期：２００９－０３—１１

基金项目：黑龙江省生物菌种资源共享平台建设（ＫＴ０５Ａ４００－１）有多种外源蛋白在该宿主系统中获得了成功表达【ｌ】。作为生产外源蛋白的重要宿主菌，依靠其各种不同功能的表达载体，已经得到广泛的应用。表达的蛋白质包括酶、膜蛋白、抗原、抗体和调节蛋白等［２１。然而，虽然用于毕赤酵母表达系统的表达载体种类繁多，却难于适用食品蛋白的表达及工业生产要求。主要影响因素有两点：ｐＨＩＬ、ｐＰＩＣ系列表达载体由于

作者简介：宋庆风（１９８３一），女。黑龙江人，硕士研究生，研究方向为生物化学与分子生物学。

通讯作者：李杰。副教授，硕士生导师，研究方向为植物分子遗传学与基因工程。Ｅ－－ｍａｉｈｌｉｊｉｅ．．＿ｎｅａｕ＠１２６．ｃｏｍ

万方数据

第７期宋庆凤等：新型毕赤酵母分泌表达载体的构建与功能验证 ５７－２．２毕赤酵母表达载体ｐＧＡＰＨｃｔ的构建

毕赤酵母表达载体ｐＧＡＰＨａ的构建过程如图２

所示。以ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＴ２２Ｉ双酶切ｐＴＧＡＰ和ｐＰＩＣ９载体，分别回收约５００ｂｐ的ＧＡＰ启动子片段和约８０００ｂｐ的ｐＰＩＣ９载体大片段，连接，构建成毕赤酵母表达载体ｐＧＡＰＨｃｔ。

＇图２毕赤酵母表达载体ｐＧＡＰＨｃｔ的构建Ｆｉｇ．２ＣｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒｐＧＡＰＨｏｔｆｏｒＰ／ｃｈ／ａｐａｓｔｏｔｌｓ图３毕赤酵母表达载体ｐＧＡＰＨｃｔ－ｘｙｎ２的构建隐．３ＣｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒｐＧＡＰＨａ－ｘｙｎ２ｆｏｒＰ／ｃｈ／ａ

ｐａｓｔｏｒ／ｓ

万方数据

第７期宋庆凤等：新型毕赤酵母分泌表达载体的构建与功能验证 ５９ ３讨论

启动子在基因表达过程中具有很重要的作用，

本文用ＧＡＰ启动子替换毕赤酵母表达载体ｐＰＩＣ９

上的ＡＯＸ启动子，构建组成型表达载体ｐＧＡＰＨａ。

在生产和应用过程中无需甲醇诱导，大大增加了安

全性。

同时，与ｐＧＡＰＺ系列组成型表达载体相比，

ｐＧＡＰＨａ在转化过程中无抗生素基因被引入，也增

加了安全性。尽管在本试验中与ＡＯＸ启动子相比，

ＧＡＰ启动子调控的ｘｙｎ２基因表达水平稍低，但是

在安全性方面的优势使其有望在食品等领域得到广

泛应用。

重组蛋白的高效分泌表达对于提高表达量和产

品的纯化都是有利的，在毕赤酵母中，信号肽对不

同的异源蛋白分泌效率有很大的差异１２。本文以经

过密码子优化的克鲁维酵母菊粉酶基因信号肽ＩＮＵ

替换毕赤酵母表达载体ｐＧＡＰＨａ上的ａ—Ｆａｃｔｏｒ信号

肽，能够有效地引导木聚糖酶的分泌。尽管在本试

验中，ＩＮＵ信号肽引导木聚糖酶分泌的能力不如ａ—

Ｆａｃｔｏｒ信号肽，但是由于菊粉酶是大分子蛋白质（９０

ｋｕ），所以ＩＮＵ信号肽能有效弥补ａ—Ｆａｃｔｏｒ信号肽

不能有效引导高分子质量蛋白质分泌的缺陷。

４结论

本研究成功构建了毕赤酵母组成型表达载体

ｐＧＡＰＨａ，并以里氏木霉木聚糖酶基因ｘｙｎ２为报

告基因进行功能验证，结果表明该载体可实现

ｘｙｎ２基因在毕赤酵母中的高效表达。在此基础上

以经密码子优化后的克鲁维酵母菊粉酶基因信号肽ＩＮＵ替换表达载体上原有的０【一Ｆａｃｔｏｒ信号肽，结果表明ＩＮＵ信号肽能够有效引导外源蛋白ＸＹＮＩＩ在毕赤酵母中的分泌表达。［参考文献】【１】ＣｅｒｅｇｈｉｎｏＪＬＣａ＇ｅｇｇＪＭ．Ｈｅｔｅｍｌｏｇｏｕｓｐｒｏｔｅｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎｔｈｅｍｅｔｈｙ－ｌｏｔｒｏｐｈｉｃｙｅａｓｔＰ／ｃｈ／ａｐａｓｔｏｒ／ｓ【Ｊ】．ＦＥＭＳＭｉｃｍｂｉｏｌＲｅｖ，２０００，２４（１）：４５．【２】路蓉，安云庆．巴斯德毕赤酵母表达系统及其分泌型蛋白表达的研究进展叨．临床和实验医学杂志，２００４，３（１）：４３－４７．【３１邢福国，张培军，谭训刚，等．酵母基因组的提取叨．食品科学，２００７，２８（３）：２１０－２１１．【４】赵颖怡，梁世中，黄鲲，等．一种新型酿酒酵母附加分泌表达载体的构建哪．微生物学报，２００２，４８（４）：４３ｌ－４３５．【５】ＴｅｎｇＤ＇ＦａｎＹ＇ＹａｎｇＹＴ＇ｅｔａ１．ＣｏｄｏｎｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎｏｆＢａｃｉｌｌｕｓ／／ｏｈ—ｅｎ／－－ｆｏｒｍｌｓ争ｌ，３－１，４－ｇｌｕｃａｎａｓｅｇｅｎｅａｎｄｉｔｓｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎＰ／ｃｈ／ａｐａｓｔｏｒ／ｓ町ＡｐｐｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２００７，７４：１０７４－１０８３．【６】萨姆布鲁克．分子克隆实验指南［ＭＩ．２版．北京：科学出版社，１９９２．【７】李杰，李晶，朱延明，等．ＤＲＥＢｌＡ基因植物表达载体的构建加．东北农业大学学报，２００３（２）：１９９—２０４．【８１ＣｈｏｓｅＴＫ．Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｏｆｃｅｌｌｕｌａｓｅａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ忉．ＰｕｒｅａｎｄＡｐｐｌＣｈｅｍ，１９８７，５９（２）：２５７－２６８．【９】罗竞红。游自立．巴斯德毕赤酵母表达系统在外源基因表达中的研究进展们．生物技术通报，２００７（３）：７５—７９．【ｌｏ】张树军，杨磊，黄瑾．信号肽序列在酵母分泌表达系统中的应用册．医学综述，２００７，１３（９）：６４３－－６４５．

新型毕赤酵母分泌表达载体的构建与功能验证

作者：

作者单位：

刊名：

英文刊名：

年，卷(期)：

被引用次数：宋庆凤， 暴立娟， 李杰， SONG Qingfeng， BAO Lijuan， LI Jie东北农业大学生命科学学院,哈尔滨,150030东北农业大学学报JOURNAL OF NORTHEAST AGRICULTURAL UNIVERSITY2009，40(7)0次

参考文献(10条)

1.Cereglfino J L.Cregg J M Heterologous protein expression in the methy-lotrophic yeast Pichiapastoris 2000(01)

2.路蓉.安云庆 巴斯德毕赤酵母表达系统及其分泌型蛋白表达的研究进展[期刊论文]-临床和实验医学杂志2004(01)

3.邢福国.张培军.谭训刚 酵母基因组的提取[期刊论文]-食品科学 2007(03)

4.赵颖怡.梁世中.黄鲲 一种新型酿酒酵母附加分泌表达载体的构建[期刊论文]-微生物学报 2002(04)

5.Teng D.Fan Y.Yang Y T Codon optimization of Bacillus licheni--formis β-1,3-1,4-glucanase gene andits expression in Pichia pastoris 2007

6.萨姆布鲁克 分子克隆实验指南 1992

7.李杰.李晶.朱延明 DREB1A基因植物表达载体的构建[期刊论文]-东北农业大学学报 2003(02)

8.Chose T K Measurement of cellulase activities 1987(02)

9.罗竞红.游自立 巴斯德毕赤酵母表达系统在外源基因表达中的研究进展[期刊论文]-生物技术通报 2007(03)

10.张树军.杨磊.黄瑾 信号肽序列在酵母分泌表达系统中的应用[期刊论文]-医学综述 2007(09)

相似文献(10条)

1.学位论文 钱洪喜 PRRSV N基因原核双基因表达载体与毕赤酵母表达载体的构建及其表达研究 2008

本研究以RT-PCR分别扩增了PRRSV美洲型N基因(以NA表示)和欧洲型N基因(以NE表示)，并开展了以下两方面的研究：(1)将NA和NE基因片段同时插入pET-32a(+)中构建了双基因融合表达载体pET-32a(+)-NA-NE，并进行了表达研究：(2)将NA和NE基因片段分别插入毕赤酵母表达载体pPIC9K中构建了pPIC9K-NA和pPIC9K-NE，并进行了表达研究。本研究为深入研究N蛋白的结构与功能、制备诊断试剂及开展分型诊断等奠定了基础，对PRRS的防控具有重要的意义。

1.双基因融合表达载体pET-32a(+)-NA-NE的构建及其表达研究

针对美洲型和欧洲型PRRSVN基因设计两对特异性引物，以RT-PCR扩增获得NA和NE基因，分别插入pMD19-Tsimple载体中，构建了pMD19-T-NA和pMD19-T-NE，并对两重组质粒进行了测序鉴定。将pMD19-T-NA和pET-32a(+)经NcoI&EcoRI双酶切后连接构建了pET-32a(+)-NA重组质粒；再将pET-32a(+)-NA和pMD19-T-NE经EcoRI&NotI双酶切后连接构建了双基因融合表达载体pET-32a(+)-NA-NE。pET-32a(+)-NA-NE经PCR和不同双酶切鉴定均得到预期大小的片段，结果表明成功构建了双基因融合表达载体pET-32a(+)-NA-NE。将pET-32a(+)-NA-NE转化大肠杆菌BL21进行了表达，IPTG最佳诱导浓度为1.0mM/L，最佳诱导时间为3h；经SDS-PAGE分析表达的融合N蛋白(NA-NE蛋白)大小约为49kD；经Westernblotting表明，该融合N蛋白具有良好的反应原性。

2.毕赤酵母表达载体pPIC9K-NA和pPIC9K-NE的构建及其表达研究

针对NA基因重新设计一对引物(只更换酶切位点)扩增获得了NA基因，插入pMDl9-Tsimple载体中构建了pMD19-T-NA1。将pMD19-T-NA1和pMD19-T-NE经EcoRI&NotI双酶切后回收NA和NE基因片段，分别插入经EcoRI&NotI双酶切处理的pPIC9K中构建了毕赤酵母表达载体pPIC9K-NA和pPIC9K-NE，并分别对两种重组质粒进行了PCR和双酶切鉴定。pPIC9K-NA和pPIC9K-NE经PCR鉴定和不同双酶切鉴定均得到预期大小的片段，结果表明成功构建pPIC9K-NA和

pPIC9K-NE。将pPIC9K-NA和pPIC9K-NE经SacI线性化后分别电转化毕赤酵母宿主菌GS115，再经G-418/YPD筛选获得高拷贝数重组子；重组子经表型鉴定为Mut+，且PCR鉴定为阳性。阳性重组子经甲醇诱导表达，在96h表达产物量最大，SDS-PAGE显示表达产物大小均约为15kD，Dotblotting表明表达的两型N蛋白均能与相应型阳性血清发生反应，具有良好的反应原性。

2.期刊论文 易冰.何蔼.雷智刚.郑小英.张瑞林.孟锦绣.申川军.李卓雅.詹希美 日本血吸虫组织蛋白酶L2(SjCL2)基因巴氏毕赤酵母表达载体的构建 -中国人兽共患病杂志2004,20(5)

目的扩增SjCL2基因,构建巴氏毕赤酵母表达载体pPICZαB-SjCL2,为进一步研究其蛋白酶的功能奠定基础.方法运用RT-PCR技术,从日本血吸虫(中国大陆株)成虫总RNA中扩增获得SjCL2基因;将其定向克隆至巴氏毕赤酵母表达载体pPICZαB质粒;经KpnⅠ、XbaⅠ双酶切分析和PCR鉴定筛选出阳性克隆,测序分析SjCL2基因并确定其读码框的正确插入.结果利用RT-PCR技术从日本血吸虫成虫总RNA中扩增到约1Kb大小的SjCL2基因,通过双酶切分析、PCR鉴定以及DNA序列分析确定SjCL2基因被克隆到巴氏毕赤酵母表达载体pPICZαB中.结论成功构建了含有SjCL2基因编码区序列的巴氏毕赤酵母表达载体pPICZαB-SjCL2质粒.

3.学位论文 谢涛 表达载体信号肽改造提高毕赤酵母植酸酶phyA基因表达量研究 2006

植酸酶可以提高饲料中磷的利用率和减少粪便中磷的排出量，对减少畜禽粪便中磷对环境的污染和提高饲料利用率有重大价值，提高植酸酶的表达量，对工业化生产有重要意义。

本研究以本课题组构建的植酸酶毕赤酵母基因工程PP-NPm-8和PP-NPm-4-8为出发菌株，根据毕赤酵母的信号肽序列，按照酵母偏爱密码，人工合成毕赤酵母的新型信号肽MS，并构建了新型酵母表达载体pPIC9k-MS，并进行了酶切鉴定。将本课题组来源于黑曲霉N25植酸酶phyA基因的突变基因phyAm和

突变基因phyAm-4分别插入pPCI9K-MS载体中，构建重组质粒pPIC9k-MS-phyAm和pPIC9k-MS-phyAm-4，并进行PCR鉴定，然后电击转化毕赤酵母，筛选获得了植酸酶毕赤酵母基因工程菌株PP-MS-NPm-77和PP-MS-NPm-4-16。

植酸酶毕赤酵母基因工程菌PP-MS-NPm-77和PP-MS-NPm-4-16表达产物的SDS-PAGE分析表明，酶蛋白分子大小为70.15KD。PCR鉴定结果表明，突变基因phyAm和突变基因phyAm-4都已整合到酵母染色体DNA中。连续传10代培养实验证实，植酸酶毕赤酵母基因工程菌的遗传稳定。

植酸酶毕赤酵母基因工程菌PP-MS-NPm-77酶活性测定结果表明，在BMGY/BMMY培养基中诱导36h后酶活力可达179150u/ml，比出发菌株PP-NPm-8的63667u/ml提高了2.81倍，在麦芽汁培养基中，诱导36h后酶活力达188130u/ml，比PP-NPm-8的47600u/ml提高了3.95倍。

植酸酶毕赤酵母基因工程菌PP-MS-NPm-4-16酶活性测定结果表明，在BMGY/BMMY培养基中诱导36h后酶活力可达201800u/ml，比出发菌株PP-NPm-4-2的133800u/ml提高了1.51倍，在麦芽汁培养基中，诱导36h后酶活力达209600u/ml，比PP-NPm-4-2的136900u/ml提高了1.53倍。

本研究通过表达载体信号肽的改造，构建了新型酵母表达载体，提高了植酸酶在毕赤酵母中的表达量，为植酸酶工业化生产提供了基础材料和科学依据，具有重要的学术价值和应用前景。

4.期刊论文 张超.刘刚.余少文.邢苗.ZHANG Chao.LIU Gang.YU Shao-wen.XING Miao 可直接克隆PCR产物的毕赤酵母分泌型表达载体 -中国生物工程杂志2007,27(1)

从毕赤酵母表达载体pPICZαA出发,构建了可直接克隆PCR产物的毕赤酵母分泌型表达载体(毕赤酵母表达型T载体),并通过表达重组纤维二糖水解酶Ⅱ对该载体进行了检验.设计合适的引物扩增一DNA片段,使该片段的上游含XhoⅠ和Eam1105Ⅰ酶切位点,下游含Eam1105Ⅰ和XbaⅠ酶切位点.通过XhoⅠ和XbaⅠ位点将扩增产物与质粒pPICZαA连接形成重组质粒.用Eam1105Ⅰ酶切重组质粒,回收大片段即得到毕赤酵母表达型T载体pPICZαT.使用该表达型T载体进行了里氏木霉纤维二糖水解酶Ⅱ基因(cbh2)的克隆和在巴氏毕赤酵母中的表达.结果表明,使用表达型T载体可以直接克隆PCR产物,而且可以使外源基因在毕赤酵母中成功表达.另一方面,使用该载体时不需要使用限制性内切酶,从而可以避免在所表达蛋白的N-末端引入多余氨基酸.

5.学位论文 杨乐乐 贵妃鸡、番鸭γ干扰素基因的克隆及毕赤酵母表达载体的构建 2007

γ干扰素是一种由T淋巴细胞在促有丝分裂源和抗原刺激下产生的细胞因子，它具有高效抗病毒和免疫调节作用，有广阔的应用前景。

本研究根据Genbank中禽γ干扰素(interferon-γ)基因cDNA序列设计简并引物，采用RT-PCR的方法成功的从贵妃鸡和番鸭脾淋巴细胞中扩增到IFN-γ基因cDNA片段，并将其克隆到pMD18-T载体中进行序列测定，结果表明：两种禽IFN-γ基因cDNA长度均为495bp，编码164个氨基酸和一个终止密码子。它们与Genbank中红原鸡和绿头鸭IFN-γ基因cDNA核苷酸序列同源性分别为99.8％和98.0％，与Genbank其它6个物种(人、鼠、猪、马、牛和犬)的cDNA序列进行比较，发现核苷酸序列同源性在49％～84％之间，氨基酸序列同源性在25％～81％之间，说明不同物种之间IFN-γ基因差异较大。

根据贵妃鸡IFN-γ基因测序结果设计另一对引物，用PCR方法从含有贵妃鸡IFN-γ基因的重组质粒pMD18-T-RchIFN-γ中扩增到目的基因成熟肽基因编码序列，大小为438bp。将贵妃鸡IFN-γ基因成熟肽编码序列亚克隆到毕赤酵母表达载体的EcoR Ⅰ和Not Ⅰ位点，获得融合表达载体pPIC9K-RchIMFN-Ⅰ，使贵妃鸡IFN-γ成熟肽基因编码序列与载体上的α-factor信号肽序列构成一个完整的表达阅读框，结果表明，已经成功构建了贵妃鸡IFN-γ基因的毕赤酵母表达载体pPIC9K-RchOIFN-γ，为进一步研究贵妃鸡γ干扰素的结构和功能以及重组γ干扰素在养殖业中的应用奠定了基础。

6.期刊论文 孙文秀.SUN Wen-xiu 大豆疫霉多聚半乳糖醛酸酶pspg1基因毕赤酵母表达载体的构建 -安徽农业科学2009,35(19)

[目的] 构建大豆疫霉多聚半乳糖醛酸酶pspg1基因毕赤酵母表达载体.[方法] 利用PCR方法从大豆疫霉菌cDNA中扩增多聚半乳糖醛酸酶pspg1基因,用限制性内切酶EcoR Ⅰ和Not Ⅰ分别酶切此基因和毕赤酵母表达载体pPIC9K,然后用T4连接酶将目的基因克隆到pPIC9K载体中构建此载体.[结果] 扩增的大豆疫霉菌pspg1基因成熟肽片段大小为1 250 bp.用基因特异性引物扩增阳性重组子,可得到大小为1 200 bp的片段.而用载体特异性引物扩增阳性重组子,可得到大小为1 200 和1 700 bp两条带,多出来的400 bp恰好符合载体部分的大小.将此特异性片段PCR扩增回收,序列测定发现大豆疫霉pspg1基因已经成功地插入到表达载体中.[结论] 该研究为进一步研究大豆疫霉菌pspg1基因在毕赤酵母中高效表达奠定了基础.

7.学位论文 龚杰万 mae和misgurin两种基因表达载体的构建及其在毕赤酵母中的表达 2002

MAE是本实验室设计的具有抗菌活性的杂合肽，它是以MagaininⅡ(残基4-14)和Melittin(残基2-13)为亲本，并对序列进行了优化改造后设计出的杂合肽。本文对杂合肽的高级结构进行了模拟，得到了该杂合肽高级结构的初步信息。并以已构建的载体pTYB2-mae为模板，通过PCR扩增出融合基因mae-imein-cbd，将其克隆于表达质粒pPIC9K中，通过鉴定并测序正确后，电转化真核表达宿主——毕赤酵母菌株GS115，通过营养缺陷型培养基筛选重组子，再利用G418抗性筛选出整合有多拷贝外源基因的重组子。按表达手册进行表达实验，挑选出具有高分泌表达水平的菌株，并采用不同的诱导时间、pH值、甲醇诱导浓度进行表达比较，优化出适宜的表达条件。采用优化的表达条件进行大量发酵，对上清液超滤浓缩脱盐后，采用几丁质基质进行亲和层析分离目的蛋白，溴化氰切割，琼脂孔穴法测抗菌活性。结果表明，纯化后的产物具有明显的抗菌活性。Misgurin是一种从泥鳅中分离出来的，具有强抗菌活性而无溶血活性的抗菌肽，因而有望成为一种抗菌新药。

8.期刊论文 余祖华.王红宁.周生.黄勇.丁轲.Yu Zuhua.Wang Hongning.Zhou Sheng.Huang Yong.Ding Ke 禽传染性支气管炎病毒S1基因毕赤酵母表达载体的构建 -中国家禽2006,28(21)

本试验根据已公布的IBV株S1基因序列及pPIC9K表达载体序列,去掉由18个氨基酸构成的信号肽后,设计一对IBV S1基因表达片段的PCR引物,利用RT-PCR扩增得到了IBV四川分离株的S1基因片段,将该片段克隆到PMD18-T载体上,通过对所得到的重组质粒进行酶切分析、菌落PCR鉴定,证明得到了含有目的基因片段的阳性重组质粒,测序分析片段长为1 566 bp,已经成功切除了由18个氨基酸构成的信号肽序列.将该基因亚克隆到毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K的SnaB Ⅰ和Not Ⅰ酶切位点,并通过菌落PCR、双酶切鉴定了该重组质粒的正确性,IBV S1基因毕赤酵母表达载体的构建为进一步利用毕赤酵母表达IBVS1蛋白提供了基础材料,并对表达产物的免疫原性和禽传染性支气管炎基因亚单位疫苗及特异性诊断抗原的研究打下了基础.

9.学位论文 周红玲 海水养殖鲈鱼Hepcidin抗菌肽的基因克隆及毕赤酵母表达载体pAO815/hepcl的构建 2004

Hepcidin抗菌肽是近年来发现的一类具有独特性质的抗菌肽,富含半胱氨酸,除已证明具有抗菌活性外,还初步发现其能调节体内的铁平衡,对于治疗人的炎症性贫血和血色素沉着病有很好的应用前景.迄今只有国外报道从人和杂交斑纹鲈鱼(Morone chrysops×M.saxatilis)分离出了hepcidin成熟肽,并从其他动物如鼠(Mus musculus)、日本比目鱼(Paralichthys olivaceus)、大西洋鲑(Salmo salar)和虾虎鱼(Gillichthys mirabilis)等的表达序列标签中预测出有hepcidin基因序列.国内尚未见有hepcidin抗菌肽的研究报道.该项研究利用分子生物学技术首次从中国海水养殖鲈鱼分离克隆出两个hepcidin抗菌肽类似基因:hepc1和hepc2,序列分析和氨基酸预测证明从中国鲈鱼新分离获得的hepc1和hepc2基因与国外报道的杂交斑纹鲈鱼的

hepcidin抗菌肽基因具有很高的同源性(同源性分别为80％、90％),并且含有hepcidin抗菌肽基因共同具有的八个半胱氨酸保守序列;因而把这两个新分离的基因归为hepcidin基因家庭.并分别通过3'-RACE和5'-RACE获得了hepc2基因全长序列(GenBank接收号:AY604195),预测了其ORF(258bp,编码

86a.a.)588bp.将新分离克隆的hepc1、hepc2基因序列提交国际GenBank检索比较证明,从中国鲈鱼获得的hepc1、hepc2两个hepcidin抗菌肽基因属于新基因(GenBank,接收号:AY547281,AY604195).另外,通过基因工程技术,将新分离的hepc1抗菌肽基因与质粒pAO815连接,构建了中国鲈鱼hepc1抗菌肽表达载体pAO815/hepc1,酶切与序列分析都表明表达载体pAO815/hepc1构建正确;该项工作的完成为深入探讨hepcidin的表达机制、抗菌效应及其它功能奠定了研究基础.

10.会议论文 向延芳.何畏.梁志清.史长旭 FSH-occludin重组基因毕赤酵母表达载体的构建与鉴定 2006

目的：构建FSH与occludin重组基因的毕赤酵母分泌型表达载体,为生物学功能及临床应用研究奠定基础.

方法：利用RT-PCR技术,从小鼠新鲜脑组织中提取总RNA扩增获得FSH-β亚单位,同法从小鼠新鲜睾丸组织中提取总RNA扩增occludin,通过双重PCR扩增,可获得FSHβ-亚单位基因序列和闭锁因子第二个胞外环序列的耦合片段,构建重组质粒pPIC9KFSH-occludin.

结果：通过双酶切分析、PCR鉴定确定FSH-occludin基因被克隆到巴氏毕赤酵母表达载体pPIC9K中.

结论：成功构建了含有目的基因序列的巴氏毕赤酵母表达载体pPIC9KFSH-occludin质粒.

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：2010年7月7日

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