大肠杆菌培养基配制及培养方法

更新时间:2023-03-13 03:38:01 阅读量: 教育文库 文档下载

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大肠杆菌培养

一、菌种冻存液的制备

含有足量细菌的液体培养基离心后在沉淀中加入等量40%甘油,-80oC冻存。 二、培养基制备

LB培养基配方(胰化蛋白胨(Trypton):10 g/L;酵母提取物(Yeast Extract):5 g/L;NaCl:10 g/L;pH 7.4)

液体培养基

胰化蛋白胨 10.0g 酵母粉 5.0g 氯化钠 10.0g 水 1000ml pH 7.4

固体培养基在液体培养基的基础上再加入1.5%-2.0%的琼脂 三、平板的制备

1)称取胰化蛋白胨10.0g,酵母粉5.0g,NaCl 10.0g,加入800mL二次水溶解,并用玻璃棒搅拌均匀,用1mol/L的NaOH调pH至7.4左右,定容至1L,调pH 7.4(若溶液pH大于7.4,用1mol/L HCl回调)。

2)分装在锥形瓶中,每瓶量不宜太多,没过瓶底一指左右。如需固体培养基在分装后的液体培养基内加入约2%的琼脂(150mL液体培养基加入2.5g琼脂)。 3)在锥形瓶口依次覆盖带滤纸通气小孔的塑料膜和硬质纸,用皮筋捆好。所有锥形瓶如上述操作。用记号笔注明培养基名称、配制日期。 4)高压蒸汽灭菌锅121 oC灭菌15min。

5)灭菌后的培养基取出置电热鼓风干燥器内60oC烘干,待锥形瓶的封口纸干燥后取出。液体培养基可直接保存或使用,此时加有琼脂的培养基不会凝固,可在预先紫外杀菌30min以上的无菌操作台上,将培养基倒入培养皿内,每个培养皿培养基约10-15mL(直径90mm),在培养皿中厚度大约4mm左右。将平皿叠放在无菌操作台上,放置10min左右,待琼脂基本凝固可涂平板。 6)若平板不直接使用,灭菌后将培养基在锥形瓶中保存,待需制备平板时,微波炉中火加热约3min,使琼脂熔化,室温冷却20min至不烫手可制备平板。 四、接种大肠杆菌

1)取实验室储备的大肠杆菌BL21冻存液, 管口用酒精灯灼烧,打开离心管。 2)接种方法一:用灭菌枪头蘸取冻存液在平板边缘上划横条,每三道为一组,旋转平皿一圈,最后中间划之字;接种方法二:用移液枪吸取100uL溶液于平板上,用酒精灯灭菌厚的涂抹棒划十字,涂布平板。

3)因实验一般都要求挑取单菌落,故涂平板适应考虑冻存液内细菌数量,若菌量过大应适当稀释。一般方法一获得单菌落的可能性比较大。涂平板应在酒

精灯附近进行,若冻存液涂完的平板应倒置,防止平皿盖上产生水蒸气。 五、大肠杆菌的培养

1)将接种好的平皿倒置放入37℃的恒温培养箱中培养,大约十几小时后长出菌落。

2)挑取生长状态好,特征明显的单个菌落,接种于新鲜灭菌的LB液体培养基中37℃,220rpm/min恒温振荡培养9-12h。菌落特征:乳白色,圆形,菌落边缘整齐,表面光滑,表面和背面颜色一致。

本文来源:https://www.bwwdw.com/article/u7uo.html

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