新一代的流行性乙型脑炎疫苗

新一代流行性乙型脑炎疫苗

张 卓 光

（成都生物制品研究所 成都 610023）

摘要 流行性乙型脑炎是疫苗可预防疾病，近年开发新的Vero细胞乙型脑炎疫苗是一个热点。本文介绍了五种以Vero细胞为基质的乙脑疫苗，它们的研制情况及特点。

关键词 流行性乙型脑炎 Vero细胞 疫苗

流行性乙型脑炎病毒，简称乙脑病毒。属于黄病毒科，黄病毒属，1935年在

日本分离。乙脑病毒颗粒为球形、有包膜，直径45nm左右，其中核心30nm[1]。含有一条正链RNA编码一个多聚蛋白，它们分别裂解加工成结构蛋白C、PrM、M、E和非结构蛋白NS1、NS2a、NS2b、NS3、NS4a、NS4b、NS5。E蛋白是乙脑病毒的重要抗原，含有与病毒毒力密切相关的决定性氨基酸，能诱导产生中和抗体[2]。

它侵犯人中枢神经系统，所致流行性乙型脑炎(简称乙脑)是一种急性传染病，以蚊为传播媒介,主要在夏秋季流行。全球每年有约50，000例报告，主要分布于亚洲。20世纪90年代以来，乙脑流行区域有所扩大，一些原来为非乙脑流行的国家或地区也发生乙脑流行。如1990年美属塞班岛（位于西太平洋马里亚纳群岛）[3]，同年7～11月在印度的西北部[4]，澳大利亚最北部的托雷斯海峡（Torres Strait）的巴度（Badu）岛都首次报告发生乙脑[5]。乙脑不仅病死率高（30%），而且后遗症严重，约50%的幸存者有神经系统的后遗症。近年国内的广东、广西等地都有局部的暴发流行，现在对乙脑的防治措施主要是防蚊和接种疫苗。

1954年，日本学者开发出乙脑Nakayama株鼠脑灭活纯化疫苗，86年改为北京-1株[6]；70年代，中国学者开发出乙脑P3株地鼠肾细胞灭活疫苗；89年又研制出乙脑SA14-14-2株地鼠肾细胞减毒活疫苗。由于发现乙脑病毒适应于Vero细胞，而Vero细胞无外源因子和易于培养被WHO推荐做为生产疫苗的细胞基质，而以Vero细胞为基质已成功开发了狂犬和脊灰疫苗,并已广泛使用。因此，近年中、美、日三国学者都在以Vero细胞基质研制新一代的乙脑疫苗，虽然有乙脑的DNA疫苗（带有Pre-M+E基因）等新技术疫苗的报道[7]，但它们的应用还需要一定的时间。目前进展最快的，还是以Vero细胞为基质的新一代乙脑疫苗，而

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且它们有希望大规模应用，现在对它们做一个介绍。 1、乙脑P3株Vero细胞纯化灭活疫苗

北京生物制品研究所的丁志芬等，采用乙脑病毒P3株，在Vero细胞上传代适应，发现P3株在Vero细胞上传10代以后，免疫原性下降。故把P3株在Vero细胞10代以内制备毒种和疫苗[8]。转瓶技术培养Vero细胞和乙脑P3株，滴度一般在7.0LgPFU/ml以上，病毒悬液经灭活、澄清、浓缩、硫酸鱼精蛋白处理、蔗糖密度梯度离心纯化，制备成冻干疫苗。

其CF抗原在1∶16～32，相当于中国乙脑疫苗标准品（1∶4）和日本鼠脑提纯乙脑疫苗标准品（1∶4）的4～8倍，其蛋白含量在25～29ug/ml，低于日本鼠脑提纯乙脑疫苗标准（80ug/ml）；疫苗效力高于中国乙脑疫苗和日本鼠脑提纯乙脑疫苗标准品[9]。

用此疫苗除初免第1针有一过性发热外（体温中强反应率为12.4%），无其他不良反应。免疫2针后1个月中和抗体阳转率和几何平均滴度（GMT）分别为100.0%和1∶27.7[10]。

2、乙脑SA14-14-2株Vero细胞纯化减毒活疫苗

武汉生物制品研究所吕文利等，用乙脑SA14-14-2株，接种于Vero细胞，3、6天收液，超滤浓缩、硫酸鱼精蛋白处理、Sepharose4FF凝胶过滤介质纯化疫苗，制成纯化Vero细胞乙型脑炎减毒活疫苗。滴度达7.2LgPFU/ml，免疫原性小鼠ED50为10-5PFU，蛋白含量20ug/ml,纯毒试验、外源因子、脑内致病力、乳鼠传代返祖试验全部合格[11]。

3、乙脑SA14-14-2株Vero细胞纯化灭活疫苗(JE-PIV)

美国Walter Reed军事研究所Ashok k.Srivastava等，采用乙脑SA14-14-2株在原代狗肾细胞（PDK）传8代后的病毒，JESA14-14-2 PDK-8,在Vero细胞上，经传两代后，病毒滴度就增加了1000倍，从4.0LgPFU/ml到大于7.0LgPFU/ml,更多代次未见病毒滴度增加。以Vero细胞4代建立主种子批，5代为工作种子批，6代为疫苗。

Vero细胞种毒后，3、5、7、9天收毒，滴度在7.0～8.0LgPFU/ml,第7天的滴度最高。病毒原液离心过滤去除细胞碎片，超滤浓缩，硫酸鱼精蛋白处理，蔗糖密度梯度离心，福尔马林灭活，Al(OH)3吸附，加硫柳汞，配制成Vero细胞纯

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化灭活疫苗(JE-PIV)。

把Vero细胞纯化灭活疫苗(JE-PIV)与现在国际通用的日本鼠脑纯化乙脑灭活疫苗（JE-VaX），在小鼠模型做免疫原性和保护力对比，半数有效免疫剂量（ID50 ）JE-PIV是4ng，JE-VaX是15ng。JE-PIV引起100%中和抗体阳性的最低剂量是32ng。免疫小鼠后，用乙脑SA14株≤1000LD50的病毒量攻毒，需要保护50%的免疫小鼠的半数有效剂量（ED50）JE-PIV是2.6ng, JE-VaX是1.5ng。保护100%免疫小鼠的JE-PIV的最低剂量是150ng。

疫苗的纯毒试验，用RT-PCR，分析核苷酸序列与公布的SA14-14-2株比较，只有5311核苷酸不同。疫苗是胸腺嘧啶（T），而公布的SA14-14-2株是胞嘧啶（C）。

此疫苗的优点是：（1）Vero细胞培养乙脑病毒，可用无血清培养基并达到较高的滴度（7.0～8.0LgPFU/ml）；(2)可反复收毒，易于大规模生产；（3）无血清培养基培养乙脑病毒，增加了疫苗的安全性，并可用简易、经济的纯化方法。在小鼠模型中，JE-PIV较JE-VaX在相同剂量下，都能保护小鼠，JE-PIV有更强的免疫原性。JE-PIV安全、有效、经济，将在志愿者中进行I期临床观察[12]。 4、乙脑北京-1株Vero细胞灭活纯化疫苗

日本Chemo-sero Therapeutic Research研究所的Keishin Sugawara等，以乙脑北京-1株，Vero细胞为基质开发出灭活纯化疫苗。细胞库：Vero细胞122代购自ATCC，126代建立主细胞库，129代建立工作细胞库。然后对细胞库进行生物安全检查合格。病毒库：使用无血清培养基培养北京-1株，种毒5天后收毒。在第2代建立主种子批（MVB），第4代建立工作种子批（WVB），第9代建立扩大种子批（EVB）。无菌试验，外源因子检测合格，核苷酸序列分析各种子批都一致。

为了便于大规模的工业生产该疫苗，开发了一条易于放大的工艺流程。采用培养罐、微载体技术培养Vero细胞，5L、50L、500L培养罐逐级放大，种毒后用无血清培养基培养病毒，第3天病毒滴度达高峰（9.0LgPFU/ml左右），第4天E蛋白酶标抗体（E-ELISA）检测达高峰，第4天收毒。去除细胞及碎片，超滤浓缩，福尔马林灭活，蔗糖密度梯度离心，柱层析，再加附加剂制成Vero细胞灭活纯化疫苗。Vero细胞DNA含量223.0〒41.39（pg/mg）,ELISA检测Vero细胞的蛋白质（HCP）含量159.7〒19.60(ng/mg)。

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把Vero细胞和鼠脑乙脑灭活纯化疫苗的物理化学和免疫原特性做一比较，见表1。

表1 Vero细胞和鼠脑乙脑灭活纯化疫苗的物理化学和免疫原特性比较

疫苗 名称 Vero细胞 鼠脑

电镜观察病毒直径 46.7〒0.19nm 46.7〒0.43nm

蔗糖密度梯度离心 病毒都浓缩 在43%蔗糖处

SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 （SDS-PAGE） 结果相似 都观察到 6条带

蛋白质印迹 （Western blot） 都观察到 E抗原呈 双带

免疫双向扩散 抗原和 免疫原性没有差异

效力（病毒中和滴度Log10） 2.85【2.25】 2.87【2.31】 2.74【2.25】 2.33【2.31】

两者 相似 免疫血清中和病毒谱

【】：参考疫苗

从表1可知，乙脑北京-1株在Vero细胞和鼠脑上制备的疫苗，物理化学特性和免疫原性相似[6]。

对Vero细胞和鼠脑乙脑北京-1株灭活纯化疫苗的安全和效果，进行了动物和I期临床观察。在小鼠、狗、兔中一剂量的异常毒性观察，未显示有毒性；致畸性试验，结果阴性。两组志愿者各30名血清乙脑抗体阴性（对乙脑北京-1株中和抗体滴度<101），分别接种Vero细胞和鼠脑乙脑北京-1株灭活纯化疫苗。两组局部药物反应，头痛和不舒服轻微，Vero细胞组反应率6.7%，鼠脑组20.0%。两组接种3针后，血清阳转率都是100%，几何抗体平均滴度（GMT）Vero细胞组是102.35，鼠脑组是102.03[13]。

5、黄热乙脑嵌合病毒（ChimeriVax-JE）Vero细胞减毒活疫苗

黄热病毒（YF）17D株，制备黄热病减毒活疫苗有60年的安全和有效的使用历史。用乙脑SA14-14-2株的结构蛋白PrM和E的基因去替换黄热病毒17D株cDNA的相应位置，而核心蛋白（C）、非结构蛋白基因与病毒复制有关的部分，则保留黄热病毒17D株的基因序列，构成黄热乙脑嵌合病毒（ChimericYF/JE-S）。在体外转录为RNA后，转染Vero细胞，培养后出现细胞病变或蚀斑经检定证实为感染性嵌合体病毒后，则可继续传代保存[14]。

黄热乙脑嵌合病毒（prM-E）在脊椎动物和蚊来源细胞上较乙脑SA14-14-2株繁殖良好，在Vero细胞培养五天，滴度达到>8LgPFU/ml，E蛋白仍保留乙脑病毒的抗原性和生物学特性。在FRhL细胞上的prM-E基因序列与乙脑SA14-14-2株一致，与乙脑强毒株SA14和Nakayama在包膜上有6 个氨基酸不同（E107、E138、E176、E279、E315、E439）。106PFU脑内注射小白鼠无神经毒性，而黄热病毒17D

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株在小白鼠神经毒力较黄热乙脑嵌合病毒大。黄热乙脑嵌合病毒在细胞传18代，鼠脑中传6代后，与减毒和毒力有关的氨基酸位点都存在，保持不变，显示黄热乙脑嵌合病毒的基因稳定性。在小鼠皮下接种≥103PFU的黄热乙脑嵌合病毒一针，就能保护乙脑强毒株的腹腔攻毒。在猴脑内接种6.6LgPFU的黄热乙脑嵌合病毒，只引起短暂的病毒血症，没有脑炎病征，引起高滴度的乙脑抗体，能抵御乙脑强毒株的脑内攻毒。对攻毒30天后猴的神经组织进行病理检查，没有或仅有轻微的脑炎病理改变；用WHO规定的黄热病毒17D株的猴神经毒性试验，检测黄热乙脑嵌合病毒符合WHO规程标准[15-17]。

美国Acambis公司的Thomas P.Monath等，用黄热乙脑嵌合病毒，在Vero细胞上培养的3、4和5代分别作为主种子批、工作种子批和疫苗。收获Vero细胞培养嵌合病毒的上清液作为疫苗原液，用核酸酶处理以消化Vero细胞的核苷酸，使用500-kDa膜，正切流微过滤和透析过滤纯化疫苗原液，加入乳糖和人血白蛋白做保护剂，制成黄热乙脑嵌合病毒Vero细胞减毒活疫苗。Vero细胞DNA<0.1ng/人份（0.5ml）, Vero细胞库、嵌合病毒种子库、疫苗经检测无外源因子[18-19]。

黄热乙脑嵌合病毒减毒活疫苗对小鼠脑内无致病力，以2.0、3.0、4.0、5.0LgPFU的剂量，猴皮下接种。所有猴都出现低病毒血症（平均滴度高峰，1.7～2.1LgPFU/ml，平均持续时间，1.8～2.3天），6～10天开始出现中和抗体，到第30天各剂量组的中和抗体反应相似，对同源毒株中和抗体滴度较异源毒株高。在第54天，用5.2LgPFU病毒量的强毒株攻毒，免疫猴都没有引起病毒血症、脑炎病征和轻微的残留脑部损害。而对照组，则出现病毒血症、临床脑炎病征和严重的组织病理损害。攻毒后，免疫猴的血清和脑脊髓液中的中和抗体显著升高（≥4倍）。黄热乙脑嵌合病毒减毒活疫苗对猴的神经毒力较黄热病17D株减毒活疫苗小，而两者有相似的免疫原性和保护效果

[17]

。

黄热乙脑嵌合病毒减毒活疫苗Ⅰ期临床观察：一个36例随机、双盲与黄热病毒17D株减毒活疫苗的对比观察，副反应轻微，采用4和5LgPFU两个剂量组。在试验者体内只有短期、低水平的病毒血症，中和抗体阳转率都是100%，中和抗体水平高剂量组较低剂量组高，黄热病17D株减毒活疫苗对黄热乙脑嵌合病毒减毒活疫苗没有免疫干扰作用，两者安全性和免疫原性相似[18]。

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