研究生分子生物学实验讲义

分子生物学实验讲义

硕 士 研 究 生 试 用 教 材(第三版)

南方医科大学 生物化学与分子生物学教研室

二OO六年五月

分

子

生

物

学

实验讲义

硕 士 研 究 生 试 用 教 材（第三版）

编 写 人 员 (按姓氏笔画排列)

冯春琼 朱利娜 吴清华 宋艳斌 张兴梅 李 凌 肖应庆 肖维威 姜 立 胡子有 郭秋野 彭翼飞

南方医科大学 生物化学与分子生物学教研室

二OO六年五月

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前 言

分子生物学是二十世纪末发展最快的生命科学，其理论与技术的进步，不仅加速了自身体系的更新，同时也带动了医学科学的变革。随着科技的日新月异，分子生物学的研究手段也得到相应发展，PCR技术、克隆技术、基因芯片技术等的涌现，使得分子生物学溶入到生命科学的各个领域，并发挥着巨大作用。分子生物学是实践性非常强的一门课程，众多的理论知识必须在实验中进行验证，才能深刻地理解与应用。

开设分子生物学实验选修课程，是医学院校研究生层次人才培养的必要组成。为适应新形式下研究生教学的需要，我们在完善实验室仪器配置标准化的同时，安排了以基因重组体的构建为主线的一系列实验内容，旨在让研究生掌握分子生物学基本技术操作的同时，并能有严谨的实验思路，具备一定的分子生物学科研思维，避免在课题设计上出现不必要的误差。

此次编写的讲义，必然会有欠缺与不足，我们会在今后的工作中不断修正与补充。希望大家对本门课程提出宝贵意见，以帮助我们更好的开展分子生物学实验的教学工作。

生物化学与分子生物学教研室

二OO六年五月

2

目 录

第一章

基因克隆载体的制备………………………………………………… 1

实验一：质粒DNA的抽提与纯化……………………………… 1 实验二：质粒DNA的鉴定……………………………………… 6

第二章

目的基因的获取……………………………………………………… 8

实验三：基因的PCR技术…………………………………………8 实验四：DNA限制性酶切技术……………………………………10 实验五：酶切产物的鉴定………………………………………… 12 实验六：酶切产物的回收………………………………………… 15

第三章

基因重组子的构建…………………………………………………… 19

实验七：DNA重组连接……………………………………………19 实验八：T载体应用时的DNA重组连接……………………… 25 实验九：重组DNA的转化……………………………………… 29 实验十：重组子的鉴定…………………………………………… 31

第四章

SDS－PAGE检测蛋白………………………………………………… 34

实验十一：蛋白质聚丙烯酰胺凝胶电泳………………………… 34

第五章

附录……………………………………………………………………… 38

第一章

基因克隆载体的制备

实验一：质粒DNA的抽提与纯化

目的： 原理：

采用碱变性法，学习小规模制备质粒DNA的技术，

碱变性抽提质粒DNA的质粒DNA是基于染色体DNA与变性与复性的差异

而达到分离目的。在pH值高达12.6的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离，当以pH4.8的NaAc高盐缓冲液去调节其pH值至中性时，变性的质粒DNA又恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质－SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。

仪器与主要试剂： 仪器（见附录）： 主要试剂：

实验方法：

1． 将大肠杆菌菌落挑取一环接种在含有2毫升加入抗菌素的LB液体培养基的10毫

升试管里，37℃振培过夜，16～18小时

2． 转移以上菌液1.5毫升于EP管中，8000rpm离心30秒

3． 小心去除上清，并用吸水纸吸干残余液体，再将沉淀物在振荡器上振匀 4． 加入溶液I 100μl，盖紧EP管盖，翻转数次，冰上放置10分钟

5． 加入溶液II 200μl，温和翻转EP管5次(可观察到溶液逐步由混浊变为透明)，冰

溶液I：

50 mmol/L 葡萄糖

10 mmol/L EDTA(乙二胺四乙酸） 2毫克/毫升 溶菌酶 1% SDS（十二烷基硫酸钠）

25 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0) Tris（三羟甲基氨基甲烷） 溶液II： 200 mmol/L NaOH 溶液III： 3 mol/L NaAc (pH4.8)溶液 TE缓冲液：10 mmol/L Tris-HCl ,pH 7.5

1 mmol/L EDTA

1

上放置5分钟

6． 加入溶液III 150μl，将EP管盖紧后来回翻转2～3次，混匀后冰上放置20分钟 7． 12000rpm离心15分钟

8． 将上清转移到另一个EP管中(吸取时不可吸入底部的沉淀)。加入等体积的酚和氯

仿：异戊醇各抽提一次

9． 加入1毫升预冷的无水乙醇和1/10体积的NaAc(3 mol/L,pH5.2)，盖紧，并翻转

EP管数次混匀

10． 置于-20℃冰箱1～2小时

11． 15000rpm离心15分钟，去除上清，收集管底白色沉淀 12． 70%乙醇洗涤一次，空气干燥或真空抽干

13. 将沉淀溶于50μl TE缓冲液（×TE Buffer：10mM Tris-HCl 1mM EDTA PH=8.0 ）或去离子水，完全溶解后，-20℃保存

14. 取样5μl，在0.8%的琼脂糖凝胶上电泳，观察DNA条带。 附注：

1． 溶液Ⅰ——溶菌液

溶菌酶：它是糖苷水解酶，能水解菌体细胞壁的主要化学成分肽聚糖中的β-1，4糖苷键，因而具有溶菌的作用。当溶液中PH小于8时，溶菌酶作用受到抑制。

葡萄糖：增加溶液的粘度，维持渗透压，防止DNA受机械切力作用降解。 EDTA的作用： （1） （2）

螯合Mg2＋ Ca2＋等金属离子，抑制脱氧核酸酶对DNA的降解作用（DNase（脱氧核糖核酸酶）作用时需要一定的金属离子作辅基）。

EDTA的存在，有利于溶菌酶的作用，因为溶菌酶的反应要求有较低的离子强度的环境。

2． 溶液Ⅱ——NaOH-SDS液：

NaOH：核酸在pH大于5，小于9的溶液中，是稳定的。但当pH>12或pH<3时，就会引起双链之间氢键的解离而变性。在溶液Ⅱ中的NaOH浓度为0.2mol/L,加抽提液时，该系统的PH就高达12.6,因而促使染色体DNA与质粒DNA的变性. SDS：SDS是离子型表面活性剂。它主要功能有：（1）溶解细胞膜上的脂质与蛋白，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜。（2）解聚细胞中的核蛋白。（3）SDS能与蛋白质结合成为R-O-SO3…R┿-蛋白质的复合物，使蛋白质变性而沉淀下来。但是SDS能抑制核糖核酸酶的作用，所以在以后的提取过程中，必须把它去除干净，

2

防止在下一步操作中（用RNase去除RNA时）受到干扰。 3． 溶液Ⅲ——3mol/L NaAc(pH4.8)溶液

NaAc的水溶液呈碱性，为了调节pH至4.8,必须加入大量的冰醋酸.所以该溶液实际上是NaAc-Hac的缓冲液.用PH4.8的NaAc溶液是为了反pH12.6的抽提液,调回pH至中性,使变性的质粒DNA能够复性,并能稳定存在.而高盐的3mol/L NaAc有利于变性的大分子染色体DNA,RNA,以及SDS-蛋白复合物凝聚而沉淀之.前者是因为中和核酸上的电荷,减少相斥力而互相聚合,后者是因为钠盐与SDS-蛋白复合物作用后,能形成较小的钠盐形式复合物,使沉淀更完全. 4. 为什么用无水乙醇沉淀DNA?

用无水乙醇沉淀DNA,这是实验中最常用的沉淀DNA的方法.乙醇的优点是可以任意比和水相混溶,乙醇与核酸不会起任何化学反应,对DNA很安全,因此是理想的沉淀剂.

DNA溶液是DNA以水合状态稳定存在,当加入乙醇时,乙醇会夺DNA周围的水分子,使DNA失水而易于聚合.一般实验中,是加2倍体积的无水乙醇与DNA相混合,其乙醇的最终含量占67%左右.因而也可改用95%乙醇来替代无水乙醇(因为无水乙醇的价格远远比95%乙醇昂贵).但是加95%的乙醇使总体积增大,而DNA在溶液中有一定程度的溶解,因而DNA损失也增大,尤其用多次乙醇沉淀时,就会影响收得率.折中的做法初次沉淀DNA时可用95%乙醇代替无水乙醇,最后的沉淀步骤要使用无水乙醇.也可以用0.6倍体积的异丙醇选择性沉淀DNA.一般在室温下放置15-30分钟即可.

5. 在用无水乙醇沉淀DNA时，为什么一定要加NaAc或NaCl至最终浓度达0.1～

0.25mol/L?

在pH为8左右的DNA溶液中,DNA分子是带负电荷的,加一定浓度的NaAc或NaCl,使Na+中和DNA分子上的负电荷,减少DNA分子之间的同性电荷相斥力,易于互相聚合而形成DNA钠盐沉淀,当加入的盐溶液浓度太低时,只有部分DNA形成DNA钠盐而聚合,这样就造成DNA沉淀不完全,当加入的盐溶液浓度太高时,其效果也不好.在沉淀的DNA中,由于过多的盐杂质存在,影响DNA的酶切等反应,必须要进行洗涤或重沉淀.

6.加核糖核酸酶降解核糖核酸后,为什么再要用SDS与KAc来处理?

加进去的RNase本身是一种蛋白质,为了纯化DNA,又必须去除之,加SDS可使它们成为SDS-蛋白复合物沉淀,再加KAc使这些复合物转变为溶解度更小的钾盐形式的SDS-蛋白质复合物,使沉淀更加完全.也可用饱和酚，氯仿抽提再沉淀，去除RNase。在溶液中，有人以KAc代替NaAc，也可以收到较好的效果。 7．为什么在保存或抽提DNA过程中，一般采用TE缓冲液？

3

在基因操作实验中，选择缓冲液的主要原则是考虑DNA的稳定性及缓冲液成分不产生干扰作用。磷酸盐缓冲系统（pKa=7.2）和硼酸系统(pKa=9.24)等虽然也都符合细胞内环境的生理范围,可作DNA的保存液,但在转化实验时,磷酸根离子的种类及数量将与Ca2+产生Ca3(PO4)2沉淀;在DNA反应时,不同的酶对辅助因子的种类及数量要求不同,有的要求高离子浓度,有的则要求低盐浓度,采用Tris-HCL(pKa=8.0)的缓冲系统,由于缓冲液是TrisH/Tris,不存在金属离子的干扰作用,故在提取或保存DNA时,大都采用Tris-HCl系统,而TE缓冲液中的EDTA更能稳定DNA的活性.

8.如何选择聚乙二醇(6000)的浓度来沉淀DNA?

采用PEG(6000)沉淀DNA,大小不同的DNA分子所用的PEG的浓度也不同,PEG的浓度低,选择性沉淀DNA分子量大,大分子所需PEG的浓度只需1%左右,小分子所需PEG浓度高达20%.本实验选择性沉淀4.3Kb的pBR322质粒DNA,每毫升加入0.4毫升的30%PEG,其最终PEG浓度为12%.PEG选择性沉淀DNA的分辩率大约100bp.

9.抽提DNA去除蛋白质时,怎样使用酚与氯仿较好?

酚与氯仿是非极性分子,水是极性分子,当蛋白水溶液与酚或氯仿混合时,蛋白质分子之间的水分子就被酚或氯仿挤去使蛋白失去水合状态而变性.经过离心,变性蛋白质的密度比水的密度为大,因而与水相分离,沉淀在水相下面,从而与溶解在水相中的DNA分开.而酚与氯仿有机溶剂比重更大,保留在最下层.

作为表面变性的酚与氯仿,在去除蛋白质的作用中,各有利弊,酚的变性作用大,但酚与水有一定程度的互溶,大约10%～15%的水溶解在酚相中,因而损失了这部分水相中的DNA,而氯仿的变性作用不如酚效果好,但氯仿与水不相混溶,不会带走DNA.所以在抽提过程中,混合使用酚与氯仿效果最好.经酚第一次抽提后的水相中有残留的酚,由于酚与氯仿是互溶的,可用氯仿第二次变性蛋白质,此时一起将酚带走.也可以在第二次抽提时,将酚与氯仿混合(1:1)使用. 10.为什么用酚与氯仿抽提DNA时,还要加少量的异戌醇?

在抽提DNA时,为了混合均匀,必须剧烈振荡容器数次,这时在混合液内易产生气泡,气泡会阻止相互间的充分作用.加入异戌醇能降低分子表面张力,所以能减少抽提过程中的泡沫产生.一般采用氯仿与异戌醇为24:1之比.也可以采用酚,氯仿与异戌醇之比为25:24:1(不必先配制,可在临用前把一份酚加入一份24:1的氯仿互异戌醇即成),同时异戌醇有助于分相,使离心后的上层水相,中层变性蛋白相以及下层有机溶剂相维持稳定.

11. 为什么要用pH8的Tris水溶液饱和酚?呈粉红色的酚可否使用?如何保存酚不被

空气氧化?

4

+

因为酚与水有一定的互溶.苯酚用水饱和的目的是使其抽提DNA过程中,不致吸收样品中含有DNA的水分,减少DNA的损失.用Tris调节至pH为8是因为DNA在此条件下比较稳定.在中性或碱性条件下(pH5～7),RNA比DNA更容易游离到水相,所以可获得RNA含量较少的DNA样品.

保存在冰箱中的酚,容易被空气氧化而变成粉红色,这样的酚容易降解DNA,一般不可以使用.为了防止酚的氧化,可加入巯基乙醇和8-羟基喹啉至终浓度为0.1%。8-羟基喹啉是带有淡黄色的固体粉末,不仅能抗氧化,并在一定程度上能抑制Dnase的活性，它是金属离子的弱螯合剂。用Tris pH8.0水溶液饱和后的酚,最好分装在棕色小试剂瓶里,上面盖一层Tris水溶液或TE缓冲液，隔绝空气，以装满盖紧盖子为宜，如有可能，可充氮气，防止与空气接触而被氧化。平时保存在4℃或-20℃冰箱中，使用时，打开盖子吸取后迅速加盖，这样可使酚不变质，可用数月。

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实验二：质粒DNA的鉴定

――――――――紫外吸收检测DNA的浓度和纯度

目的： 原理：

了解紫外吸收检测DNA浓度与纯度的原理，掌握测定方法。 核酸的最大吸收波长为260nm，蛋白质为280nm，在波长260nm时，1OD

值相当于双链DNA浓度为50μg/ml，单链寡核苷酸的含量为30μg/ml，可以据此来计算核酸样品的浓度,还可通过测定在260nm和280nm的OD值的比值（OD260/OD280），估计核酸的纯度。纯净DNA的比值为1.8, RNA为2.0。若比值高于1.8说明DNA样品中的RNA尚未除尽，若样品中含有酚和蛋白质将导致比值降低。270nm存在高吸收表明有酚的干扰。 紫外分光光度法只能用于测定浓度大于0.25μg/ml的核酸溶液，对浓度更小的样品，可采用荧光分光光度法。

仪器与主要试剂：

实验方法：

1) 分光光度计先用水在260nm和280nm两个波长下校零。

2) 取质粒DNA样品2μl，用水稀释100倍，转入分光光度计的石英比色杯中。 3) 在260nm和280nm分别读出样品OD值。如果样品浓度单位为μg/μl，则样

品DNA浓度为OD 值的10倍，即如OD260=0.1，则样品浓度即为1μg/μl。 4) 若OD260/OD280大于1.8，说明仍有RNA，可以考虑用RNA酶处理样品，若

小于1.8，说明样品中含有蛋白质或酚，应再用酚/氯仿抽提，以乙醇沉淀纯化DNA。

-

紫外分光光度仪 提取的质粒DNA

――――――――琼脂糖凝胶电泳检测DNA

目的： 原理：

学习水平式琼脂糖凝胶电泳，检测质粒DNA的构型、分子量的大小。 琼脂糖是从海藻中提取出来的一种线状高聚物，可作为电泳支持物，适

用于分离大小范围在0.2-50kb的DNA片段。DNA分子的迁移率与分子量的对数值成反比关系。观察其迁移距离，与标准DNA片段进行对照，就可获知该样品分子量大小。在质粒抽提过程中，由于各种因素的影响，使质粒DNA呈现超螺旋的共价闭合

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环状、开环状分子、线状分子三种不同的构型，这三种分子有不同的迁移率。在一般情况下，超螺旋型迁移速度最快，其次为线状分子，最慢的为开环状分子。用荧光染料溴化乙锭（ethidium bromide, EB ）进行检测，溴化乙锭嵌入碱基对之间形成荧光络合物，在紫外线激发下发出红色荧光。

仪器与主要试剂： 仪器：

1) 2) 3)

电泳仪 水平电泳槽 紫外检测仪

主要试剂：

1) 提取的质粒DNA

2) 5×TBE：54gTris; 27.5g硼酸; EDTA (0.5mol/L, pH 8.0) 20ml, 加水至1L，用

前稀释10倍

3) 溴化乙锭（EB）：10mg/ml溶液 4) 溴酚蓝

实验方法：

1) 称取1g琼脂糖于100ml 0.5×TBE中，加热溶解，冷却至65℃左右再加入终

浓度为0.5%-1.0%的EB。

2) 电泳胶模两端用透明胶带封固，梳子至于适当位置，将冷却至65℃左右的琼

脂糖溶液慢慢倒在胶模上，厚度约3㎜。静置，待胶凝固后揭去胶模两端的透明胶带，放入电泳槽内，倒入适量电泳缓冲液（一般液面高出凝胶1㎝），小心拔出梳子。

3) 将5μg提取的质粒DNA样品，与等体积溴酚蓝指示剂混匀，加入凝胶点样

孔内，防止产生气泡和样品溢出。 4) 将电泳槽通电，80V恒压电泳30分钟。

5) 电泳完毕，关掉电泳仪，倒去电泳槽中的电泳缓冲液，小心取出凝胶置于紫

外灯下观察结果，质粒DNA条带发出红色荧光。

注意事项：

1) 防止紫外线对人皮肤及眼睛的损伤，避免直接照射皮肤与眼睛。

2) EB是强诱变剂，有致癌性，操作时要带手套，防止污染。所有含有EB的溶

液在弃置前应当进行净化处理。

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第二章

实验三：基因的PCR技术

目的基因的获取

目的：①学习PCR的基本原理与实验技术；②了解引物设计的一般要求

原理：聚合酶链式反应（polymerase chain reaction, PCR）是一种最常用的体外基因扩增技术，其工作的基本原理是以拟扩增的DNA分子为模板，以一对分别与模板5’末端和3’末端相互补的寡核苷酸为引物，在特殊的耐热DNA聚合酶的作用下，按照半保留复制的机制沿着模板链延伸直至完成新的DNA合成。通过多次循环反应，前一循环的产物DNA可继续作为后一循环的模板DNA参与DNA的合成，使得目的DNA片段的量按2方式呈指数级递增，所以该反应称为链式反应。组成PCR反应体系的基本成分包括：模板DNA、特异性引物、耐热DNA聚合酶、dNTP以及含Mg2+的缓冲溶液。

PCR包括三个基本反应步骤：①变性：将反应系统加热至95℃，使模板DNA完全变性成为单链，同时引物自身和引物之间局部双链也得以消除；②退火：将温度下降至适当温度，两个引物分别结合到靶DNA两条单链的3’末端；③延伸：将温度升至72℃，DNA聚合酶催化dNTP加到引物的3’末端，引物沿着靶DNA链由3’端向5’端延伸。上述三个步骤为一个循环，新合成的DNA分子继续作为下一轮合成的模板，经数小时的多次循环(25～40次)后，靶DNA片段的扩增倍数可达10～10。

PCR成功的关键往往在于寡核苷酸引物的正确设计。要保证PCR能准确、特异、有效地对靶DNA进行扩增，通常引物设计要遵守以下几条原则：①引物长度：15～25个核苷酸；②GC含量为40%～60%；③Tm值高于55℃；④引物与模板非特异性配对位点的碱基配对率小于70%；⑤两条引物间配对碱基数小于5个；⑥引物自身配对(特别是引物的3’末端)形成的茎环结构、茎的碱基对数不大于3。由于影响引物设计的因素比较多，实际应用中基本是利用专门的引物设计软件进行引物设计。

仪器与主要试剂：

1. 基因扩增仪(如PE GeneAmp PCR System 2400 或 9700)、微量加样枪、灭菌超薄PCR反应管

2. DNA模板：质粒DNA(含靶基因片段)

3. 引物： A： 5’ GTA AAA CGA CGG CCA GT 3’

8

6

9

n

B: 5’ CAG GAA ACA GCT ATG AC3’ 4. Taq酶：5U/μl (SWELLXin) 5. 4×dNTP: 10mM each

6. 10×buffer: 500mM KCl , 100mM Tris-HCl (pH 8.3) 7. MgCl2: 25mM 8. 灭菌去离子水

实验方法

(一) 准备PCR反应溶液(最好于冰上进行)：

1.

2×Premix的配制 无菌去离子水 10×buffer 4×dNTP MgCl2 Taq酶 共 2.

准备PCR反应溶液：

取0.2 ml PCR反应管一只，用微量加样枪按下述顺序分别加入各试剂(注意每5840μL 2000μL

400μL (终浓度：0.4mM) 1600μL (终浓度： 4mM) 160μL (终浓度约0.1U/μL)

10mL ，混匀，按需分装，-20℃ 保存

换一种试剂换一个新吸头)：

灭菌去离子水 2×Premix 引物1 引物2 质粒DNA 共

19μL 25μL 2μL 2μL

2μL ( 约3ng) 50μL 混匀

如配好的反应液较多沾到管壁上，可将PCR反应管置台式离心机中瞬时离心，使反应液集中于管底，然后将反应管放到基因扩增仪(PCR仪)上。 (二) PCR扩增反应条件：

94℃ × 5 min

94℃ 72℃

72℃ × 5min (三) 结果检测

9

30sec 30sec 60sec

30个循环 50℃

本实验所扩增的产物DNA片段长度约400bp, 可取1μL～5μL产物以1.5%琼脂糖凝胶电泳进行检测。具体操作方法见前。

实验四：DNA限制性酶切技术

目的：学习体外构建或鉴定重组DNA分子时，根据目的基因及载体选择合适的限制性内切酶。

原理：各种II型限制性内切酶能识别特定的DNA碱基序列。这样，利用特定的限制性内切酶就能切割靶DNA的特定部位，得到特定长度的DNA片段或是得到特定粘性末端。选用某种限制性内切酶切割DNA，不同来源的DNA因序列的不同而相应酶切位点的位置和数量不同，即有不同的酶切图谱，以此可对DNA进行鉴别。在基因工程重组体的构建中，一般也必须选用合适的一种或两种限制性内切酶分别作用于目的基因以及载体，以得到相互匹配的粘性末端。继而在连接酶的作用下连接成为重组DNA分子。一般来说，对目的基因使用某种限制性内切酶，相应的载体也要用同样的酶。

只用一种限制性内切酶时的酶切反应即单酶切，酶切后的产物两个末端相同。单酶切反应较简单，但目的基因片段经单酶切处理后能以两个方向插入到载体中，甚至靶基因DNA片段能串联后再插入到载体中，且可自连(同样处理的载体也有类似不足)，因而重组效率较差，不利于重组子的筛选。用两种不同的限制性内切酶切割目的基因称为双酶切，酶切反应本身稍复杂，但得到的靶基因片段只能以单方向插入载体，一般也不存在自连现象，理论上重组效率更高。

仪器与主要试剂：

恒温水浴锅

纯化的质粒DNA(约3000bp, 100ng/μL)

限制性内切酶(TaKaRa)： Hind III (15U/μL), EcoR I (12U/μL) 酶的贮存缓冲液： Hind III EcoR I

10mM Tris-HCl 10mM Tris-HCl 400mM KCl 100mM KCl 0.1mM EDTA 0.1mM EDTA 1mM DTT 1mM DTT 0.01% BSA 0.15% Triton X-100 50% 甘油(pH 7.5) 0.01% BSA 50% 甘油(pH 7.5)

10

10 × Buffer: 100mM Tris-HCl(pH 7.5) 100mM 10mM 500mM

MgCl2 DTT NaCl

无菌去离子水

实验方法(以双酶切法为例)：

在0.5ml Eppendorf管中按顺序依次加入下述试剂，混匀后即成酶切反应体系：

无菌去离子水: 10 × buffer 质粒DNA Hind III (15U/μL) EcoR I (12U/μL) 共

将反应管置37℃水浴1～3h

反应结束后取10μL反应产物以1.5%琼脂糖凝胶电泳进行检测并观察结果，酶切产物应为2700bp和350bp两个片段。

11

11μL 2μL

5μL(共500ng) 1μL 1μL 20μL

实验五：酶切产物的鉴定

目的：对所克隆的目的基因片段进行鉴定。在基因工程操作过程中，经常需要所克隆目的片段进行鉴定，常用的方法有：PCR扩增技术、限制性内切酶酶解反应等。这里简单介绍一下酶切产物的鉴定。

原理：酶切产物的鉴定通常采用在下列情况：①当获得友人所赠的含有目的基因时，通常根据原作者所提供的酶切图谱采用此法进行鉴定（图1）。②当自己克隆目的基因片段或亚克隆到另一载体上的时候亦可用此法（原理同图1）。③选择适当的内切酶鉴定基因在表达载体上是正义或反义连接（图2）。

该法可按酶解产物分子量的大小分离DNA片段，小片段比大片段迁移快，凝胶上迁移的距离与分子量的对数成反比。如果要准确地确定DNA片段的大小，必须用DNA分子量标准物同时进行电泳对照。常用的分子量标准是λDNA的HindⅢ酶解片段以及λDNA的HindⅢ+EcoRⅠ的酶解片段，不同分子量标准品可从各生物技术公司的产品目录中查到，（如Takara公司等），可根据不同需要采用合适的酶。

BamH IoriPXX(900bp)M 1 2BamH IpMD18-XX(+)3500 bpLac Z20001000750500250100图1 质粒酶切鉴定示意图

在载体上，基因XX（900bp）两端有BamH I酶切位点，可以通过BamH I进行酶解反应鉴定，右侧为酶解反应的示意图，M为Marker，Lane1为没有酶切的质粒，Lane2为质粒酶切后的电泳结果，可以看到一个预期的片段。

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BamH I200bpBamH I700bporiPXX(900bp)pMD18-XX(+)3500 bpLac ZM 1 2 3 4 BamH I 700bp BamH I 200bp XX(900bp) pMD18-XX(-) 3500 bp Lac Z ori P 20001000750500250100

图2 利用酶切的方法鉴定基因在载体上的接入方式

分别在载体上和基因上选择一个酶切位点，可以相同也可以不相同，而此酶切

位点在其它处没有。在基因上的酶切位点不能在基因的中间位置，否则不能进行鉴定，通过对所得产物可以判定基因的接入方式，M为Marker，Lane1、Lane2分别为质粒A未有酶切和酶切后的电泳后的结果，Lane3、4分别为质粒B未有酶切和酶切后的电泳后的结果。从图中可以判定质粒A为正义，而B为反义。

应该指出的是，质粒酶切鉴定是一种简便的方法，但不是金标准，尤其是从外

国学者获得的质粒，最好是进行测序验证。

实验方法： 小量酶解反应操作：

一般的反应是20μl体积中含0.2-1μgDNA，酶切反应体系如下：

质粒DNA 10×缓冲液 限制酶

10μl 2μl 1μl

13

双蒸去离子水 总体积

操作方法

按下列顺序加入试剂：

7μl 20μl

（1） 在一灭菌的新的Ep管中加入7μl双蒸水。 （2） 加入10×缓冲液2μl。 （3） 加限制内切酶1U （4） 最后加入质粒DNA10μl （5） 稍离心，混合 （6） 37℃水浴1-1.5h。 （7） 取出后电泳分析鉴定。

注意事项

（1） 双蒸水为可变体积，当其他反应成分确定后，用双蒸水将反应体积补足。 （2） 质粒DNA最后加入，以防止操作不当引起试剂的污染。

（3） 为保持限制内切酶的活性，将酶从低温冰箱取出后立即置于预先准备的冰浴

中，操作应迅速，用后立即放回低温冰箱中。

（4） 大多酶多以浓缩液存放，吸取时需严格取量。若要取多种酶，每种酶必须单

独使用吸头，避免交叉污染。

（5） 大多数限制内切酶加50%甘油缓冲液置于-20℃保存，其活力稳定，但在配制

反应混合物时，酶的加入量应准确限制小于总体积的1/10，否则甘油会抑制酶解反应。

（6） 欲节省酶的用量，可增加酶解时间，但酶解时间过长，易出现杂酶活性。 （7） 当样品加入反应管中后，必须将管盖盖严，避免温育时水蒸气进入管内。

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实验六：酶切产物的回收

在重组DNA或探针标记等实验中，常常需要从凝胶中回收和纯化DNA，常用的方法有：压碎浸泡法、低熔点琼脂糖和DEAE-纤维素膜法等。 一、 DNA的回收

（一） 压碎浸泡法

本法适用于从3.5%～5%聚丙烯酰胺凝胶中回收小分子量（小于1kb）的DNA片段，亦适用于从琼脂糖凝胶上回收大分子的DNA片断。本法的优点是简单，从聚丙烯酰胺中分离的DNA纯度高，不含酶抑制物及对转染细胞有毒性的杂质，但回收率低，不能回收大片段的DNA片段。 仪器与主要试剂：

（1） 洗脱缓冲液

0.5mol乙酸铵 10mmol乙酸镁 1mmol EDTA（pH0.8） 0.1% SDS （2） TE缓冲液

（3） 3mol乙酸钠（pH5.2） （4） 100%和70%的乙醇 实验方法：

（1） 用刀片将凝胶中的DNA片段连同保鲜膜一同切下，然后从保鲜膜中拿出

所需的凝胶条。回收放射显影确定的DNA时，先在X线片上和所需DNA片段相对应的位置切一个小方洞，然后将凝胶和X线片对齐，切下所需的凝胶条。

（2） 将凝胶条放入Ep管中，用小玻璃棒捣碎凝胶。

（3） 估计凝胶条的体积，向离心管中加入1～2倍体积的洗脱缓冲液。 （4） 盖紧管盖，在37℃下轻摇，小片段（小于500bp）洗脱3～4h，大片段

DNA则需要洗脱12～16h。

（5） 4℃离心12 000g×1min,用拉长的别吸管将上清液转至另一个新的离心管

中，转移时要小心，不要带上聚丙烯酰胺凝胶的碎片。

（6） 再加0.5体积的洗脱缓冲液，混匀后，离心，合并两部分上清液。 （7） 将上清液通过一个装有硅烷化玻璃棉的一次性100μl吸头，除去残余的聚

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丙烯酰胺凝胶的碎片。

（8） 加2.5倍体积的乙醇，置-20℃30min，12000g离心10min，回收沉淀的

DNA。

（9） 用200μl的TE（pH8.0）溶解DNA，等体积酚和氯仿：异戊醇各抽提一

次，将水相转移至另一Ep管中。

（10） 加1/10体积的3mol乙酸钠，和2.5倍体积的乙醇再次沉淀DNA，置

-20℃30min。

（11） 离心，12000g ×15min弃去上清液，用70%的乙醇淋洗沉淀，真空干燥后，

将DNA溶解于10～20μlTE缓冲液（pH8.0）中。

附：冻溶法从琼脂糖凝胶中回收DNA [操作方法] （1） （2） （3） （4） （5）

从琼脂糖凝胶中将含有拟回收DNA片段的胶块切下，置于Ep管内。 用玻璃棒将胶块充分捣碎，加等体积平衡酚混匀后，置液氮10min。 取出立即离心，5000g ×5min。 小心地将水相转移到另一EP管中。

在原EP管内加200μlTE缓冲液（pH8.0），充分混匀。必要时可用玻璃棒再次捣碎，置液氮10min。

（6） （7） （8）

离心，5000g ×5min。将水相转移并合并至含有是次水相的Ep管中。 加等体积酚和氯仿：异戊醇各抽提一次。

在转移出的水相中加1/10体积的3mol乙酸钠（pH5.2）和2.5倍体积的无水乙醇置液氮10min。

（9）

离心，12000g ×15min，弃去上清液，用70%的乙醇洗一次，真空干燥。

（10） 将沉淀用20μlTE缓冲液（pH8.0）溶解，-20℃保存备用。

（二） 低熔点琼脂糖法

有许多型号的低熔点琼脂糖可在65℃时熔化成液体，在30℃时凝固成凝胶。由于双链DNA的解链温度高于65℃，所以可熔化凝胶而DNA并不变性，在凝胶成液态时回收DNA片段。该法的优点时可直接在熔化的凝胶中进行各种酶反应，如合成同位素探针、进行限制酶切割和连接反应等。 仪器与主要试剂：

低熔点琼脂糖 TE缓冲液 平衡酚

氯仿：异戊醇（24：1） 10mol/L乙酸钠

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100%和70%乙醇 实验方法：

（1） 用一般琼脂糖凝胶的制备和电泳方法进行低熔点琼脂糖的电泳； （2） 电泳结束后，将含有所需DNA片段的凝胶条切下，放入Ep管中，加入

3倍体积的TE缓冲液，在70℃保温10min，以使凝胶熔化。

（3） 冷却至室温后，加入等体积的酚，充分混匀后以4000g离心10 min，回

收水相，主意不要将截面的白色物质（即粉状的琼脂糖）吸出，再用等体积氯仿：异戊醇抽提一次。

（4） 将上清液转移到一个新的小离心管中，加入0.2倍体积的10mol/L乙酸铵

和2倍体积的乙醇，混合液在室温中放置10min，然后离心沉淀核酸。

二、 回收DNA的纯化 实验方法：

（1） 用20 倍体积含0.6mol/LNaCl的TE（pH7.6）悬浮DEAE-Sephacel，树脂

沉淀后，吸去上清液，再加20倍体积的同种缓冲液，轻轻地悬浮树脂，等树脂再次沉降后吸去大部分上清液，4℃下贮存经平衡处理的树脂。

（2） 将足以结合20μgDNA的0.6ml DEAE-Sephacel悬浮液装入小柱。 （3） 分别用下列缓冲液洗柱：

含0.6mol/L NaCl的TE（pH7.6） TE（pH7.6） 含0.1mol/L NaCl的TE（pH7.6）

3ml 3ml 3ml

（4） 将DNA与加样缓冲液混合上样，将收集的洗脱液加回到柱上。 （5） 用含0.3mol/L NaCl的1.5ml TE（pH7.6）洗柱2次。

（6） 用含0.6mol/L NaCl 1.5ml TE（pH7.6）洗柱3次收集DNA 洗脱液。 （7） 将洗脱液转移到离心管，加等体积的异丙醇，混匀后在室温下放置15min，

4℃12000g离心10min沉淀DNA。

（8） 70%乙醇洗涤沉淀，真空干燥后，溶于200μl TE（Ph7.6）中。 （9） 用等体积分和氯仿：异戊醇各抽提一次，转移水相至一Ep管中。 （10） 加入1/10体积的3mol/L乙酸钠（pH5.2）和2.5倍体积的无水乙醇置-20℃

30min。

（11） 离心，12000g ×15min，弃去上清液，用70%的乙醇洗一次，真空干燥。 （11） 将沉淀用50μlTE缓冲液（pH8.0）溶解，-20℃保存备用。

目前有许多生物技术公司开发出进行此项操作的试剂盒，使用方便、快速，可参照说明书进行。下面附上海生工公司的试剂盒以供大家参考

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主要用途：从TBE或TAE琼脂糖胶中回收DNA片段。 主要特点：

i. ii. iii.

适用范围广，适合于从TBE和TAE琼脂糖胶中回收60bp～40kb的DNA片段，回收效率在80％以上。 省时，全部操作过程仅需20分钟。 操作过程中不需要酚抽提，乙醇沉淀。

50个 50个 20ml 25ml 2 ml

试剂盒组成：

UNIQ-5 columns Collection tubes Binding buffer Wash solutiona Elution buffer

首次使用前必须在Wash solution中加入等体积的无水乙醇，充分混匀后使用，每次使用之后将瓶盖盖紧，以保持Wash solution中的乙醇含量，如果您发现Wash solution由于运输或保管不当造成容量严重不准，请用量筒定容后再加入等体积的乙醇。 操作步骤：

1) 用琼脂糖胶电泳将目的片段与其它DNA尽可能分开，然后用干净的手术刀

片割下所要回收的DNA琼脂糖块，放入1.5ml离心管中。

2) 按每100mg琼脂糖胶加入400μl Binding buffer，置于60度水浴中10分钟，

使胶彻底融化，加热融胶时，每2分钟混匀一次。

注意：对于高浓度的胶如1.5%～2％，每100mg加入700μl Binding buffer，加热融胶的进间可以延长到15min，以保证胶全部融化。

3) UNIQ-5 columns放入Collection tubes中，将融化的胶溶液转移至UNIQ-5

columns中，室温放置2分钟，室温离心(8000rpm)1min。

4) 取出UNIQ-5 columns，弃去收集液，将UNIQ-5 columns再次放入Collection

tubes中，加入450μl Wash solution，室温离心(8000rpm)1min。 5) 重复步骤4。

6) 取出UNIQ-5 columns，弃去收集液，将UNIQ-5 columns再次放入Collection

tubes中，室温离心(12000rpm)1min。

7) 将UNIQ-5 columns放入一个新的Ep管中，在柱膜中央加入30μl的Elution

buffer，室温放置2min。

8) 室温离心(12000rpm)1min，离心管中的液体即含有回收的DNA片段，可立

即使用或者-20℃贮存。

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第三章

实验七：DNA重组连接

基因重组子的构建

DNA重组子的构建中一般使用DNA连接酶，该酶是1967年在三个实验室同时发现的能封闭DNA链上缺口的酶，它借助ATP或NAD水解提供的能量催化DNA链的5'-PO4与另一DNA链的3'-OH生成磷酸二酯键。但这两条链必须是与同一条互补链配对结合的(T4DNA连接酶除外)，而且必须是两条紧邻DNA链才能被DNA连接酶催化成磷酸二酯键。

大肠杆菌的DNA连接酶是一条分子量为75KD的多肽链。对胰蛋白酶敏感，可被其水解。水解后形成的小片段仍具有部份活性，可以催化酶与NAD(而不是ATP)反应形成酶-AMP中间物，但不能继续将AMP转移到DNA上促进磷酸二酯键的形成。DNA连接酶在大肠杆菌细胞中约有300个分子，和DNA聚合酶Ⅰ的分子数相近，这也是比较合理的现象。因为DNA连接酶的主要功能就是在DNA聚合酶Ⅰ催化聚合，填满双链DNA上的单链间隙后封闭DNA双链上的缺口。这在DNA复制、修复和重组中起着重要的作用，连接酶有缺陷的突变株不能进行DNA复制、修复和重组。

噬菌体T4DNA连接酶分子也是一条多肽链，分子量为60KD，其活性很容易被0.2mol/L的KCl和精胺所抑制。此酶的催化过程需要ATP辅助。T4DNA连接酶可连接DNA-DNA，DNA- RNA，RNA-RNA和双链DNA粘性末端或平头末端。另外，NH4C1可以提高在大肠杆菌DNA连接酶的的催化速率，而对T4DNA连接酶则无效。无论是T4DNA连接酶，还是大肠杆菌DNA连接酶都不能催化两条游离的DNA链相连接。

DNA连接酶所催化的整个过程是可逆的。酶-AMP复合物可以与NMN或PPi反应生成NDA或ATP及游离酶;DNA-AMP也可以和NMN及游离酶作用重新生成NAD。该逆反应过程可以在AMP存在的情况下使共价闭环超螺旋DNA被连接酶催化，产生有缺口的DNA-AMP，生成松弛的闭环DNA。

在真核生物细胞中也存在DNA连接酶，且有两型，分别称为连接酶Ⅰ和Ⅱ，反应中利用ATP所提供的能量。DNA连接酶Ⅰ分子量约为200KD，主要存在于生长旺盛细胞中，DNA连接Ⅱ分子量约85KD，主要存在于生长不活跃的细胞中(resting cell)。

目的：用T4DNA连接酶将EcoR I酶切并经碱性磷酸酶（CIP）处理的载体pUC18的DNA片段，与目的基因被同一内切酶EcoR I 处理的片段连接起来，构建体外重组DNA分子，同时学习几种DNA连接的方法。

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原理：重组DNA分子是在Mg2＋、ATP或NAD存在的连接缓冲液系统中，DNA连接酶利用NAD或ATP中的能量催化两个核酸链之间形成磷酸二酯键，将两种 DNA分子进行连接。

（一） DNA连接作用步骤

1． 辅助因子NAD+或ATP将其腺苷酰基转移到DNA连接酶的一个赖氨酸残基的ε─氨基上形成共价的酶-AMP复合物（腺苷酰酶），同时释放出烟酰胺单核苷酸(NMN)或焦磷酸。

2． 酶-AMP复合物再结合到具有5’-磷酸基和3’-羟基切口的DNA上，将酶-AMP复合物上的腺苷酰基再转移到DNA的5'-磷酸基端，形成一个焦磷酰衍生物，即DNA-AMP。

3． 这个被激活的5'-磷酰基端可以和DNA的3'-OH端反应，产生一个新的磷酸二酯键，把缺口封起来，同时释放出AMP，见下图。

DNA连接酶所催化的整个过程是可逆的。酶-腺苷酸复合物可以与NMN或PPi反应生成NDA或ATP及游离酶；DNA-AMP也可以和NMN及游离酶作用重新生成NAD。该逆反应过程可以在AMP存在的情况下使共价闭环超螺旋DNA被连接酶催化，产生有缺口的DNA-腺苷酸，生成松弛的闭环DNA。

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（二） DNA的连接方式

在T4DNA连接酶作用下的DNA连接反应，一般是随机的，但也可以通过对载体、目的基因的处理以控制与调整DNA的有效连接。

连接方式有：

1．自连，如pUC18 EcoR I片段的自连，可以通过CIP处理克服。目的基因片段的自连由于不带复制起始点，不能在抗性平板上生出菌落，而且可以通过调整DNA浓度比与缩小连接体积减少自连的机率。

2．两种片段相连接，如两个目的基因片段之间，目的基因片段与载体DNA片段之间，前者在抗性平板上不能生长。

3．三个片段以上的自连与互连，一般这种机率较少，双酶切的DNA片段机率更少。总之，连接的组合方式有多种，通过控制载体DNA与目的DNA片段的分子比例，可以影响重组率。一般情况下，对分离片段来讲，载体DNA的摩尔数与目的基因的摩尔数之比为1比5。但目的基因的比例太高，容易产生基因自连后插入载体的多聚体。连接体积太大自连机会增多。 （三） 连接反应条件

1． 缓冲液： 一般都配成5倍到10倍的缓冲液，有Mg、ATP作为辅助因子，提供能量，同时也有些保护与稳定酶活性的物质，如DTT（二硫苏糖醇）以防止酶的活性基因氧化失活。BSA（小牛血清白蛋白）维持一定的蛋白量，以防止因蛋白浓度太低导致酶变性失活。

2． 温度： 连接反应的温度在37℃时有利于连接酶的活性，但是在这个温度下，粘性末端的氢键结合是不稳定的，EcoR I酶切所产生的末端，仅仅通过四个碱基对相结合，这不足以抵抗该温度下的分子热运动。因此做实际操作时，DNA分子粘性末端的连接反应，其温度是折中采取催化反应与末端粘合的温度，为12～16℃。

3． 时间： 12～16小时（过夜）。TaKaRa公司的T4 DNA连接酶在22℃条件下，只需1小时。

仪器与主要试剂：

1． pUC18 EcoR I –CIP处理的DNA片段 2． 目的基因的EcoR I回收片段。 3． T4 DNA连接酶 4． 高浓度的贮存液 （1）1mol/L MgCl2溶液。 （2）1mol/L DTT溶液。 （3）100mmol/L ATPNa2

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2＋

称55.2毫克于灭菌Eppendorf管中，加1毫升无菌水，溶解后存于－20℃备用。

5. 10×T4DNA连接酶缓冲液

660mmol/L Tris-HCl(pH7.5); 50mmol/L MgCl2 50mmol.L DTT 10mmol/L ATP

配制方法: 吸取高浓度贮存液

1mol/L Tris-HCl （pH7.5） 660μl 1mol/L MgCl2 50μl 1mol/L DTT 50μl 100mmol/L ATP 100μl 加ddH2O至1000μl，混匀-20℃贮存备用。 6． 电泳试剂同前。

实验方法：

1． 取3只灭菌的Eppendorf管，用记号笔做好标记，①号管做重组连接，②号管做载体片段未经CIP的处理的自连，③号管做载体片段经CIP处理的自连。

2． 各自的反应体系如下：

反应体系 ① ② ③ CIP处理的载体片段 5μl（100ng） 3μl（60ng） 未经CIP处理的载体片段 3μl（60ng） 目的基因片段 5μl（约400ng）

10XT4连接酶缓冲液 2μl 2μl 2μl ddH2O 7μl 14μl 14μl T4连接酶 1μl（2U） 1μl（2U） 1μl（2U） 总体积 20μl 20μl 20μl

用微量进样器加样，顺序为ddH2O，10×T4连接酶缓冲液，DNA片段，最后加T4DNA连接酶（放于冰浴中）。连接酶用后立即放回－20℃保存。

3． 盖紧盖子用手指轻弹Eppendorf管或用微量进样器混匀反应液，于台式离心机转2秒钟，以集中样品。

4． 将各反应管置温度已调至12℃的保温瓶内，盖紧瓶盖，过夜。

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5． 第二天上午各管取约25ng的DNA连接产物进行琼脂糖凝胶电泳，观察连接反应效果，电泳时需以载体酶切片段、目的基因酶切片段作为对照。

6． 操作中药注意微量取样的准确性，加入溶液多，不可漏加或误加，取样时Tip头要从溶液的表面吸取，放样要彻底。

7． 12℃水浴连接反应时要盖紧盖子，以防止水渗入管内。 提示：

（一） 外源DNA与质粒载体的连接

外源DNA片段与线状质粒载体的连接，也就是在双链DNA的5’磷酸和相邻的3’羟基之间形成的新的共价键。如质粒载体的两条链都带5'磷酸，可生成４个新的磷酸二酯链。但如果质粒DNA已去磷酸化，则仅能形成２个新的磷酸二酯链。在这种情况下产生的两个杂交体分子带有２个单链切口，当杂交体导入感受态细胞后可被修复。相邻的5’磷酸和3’羟基间磷酸二酯键的形成可在体外由两种不同的DNA连接酶催化，这两种酶就是大肠杆菌DNA连接酶和噬菌体T4DNA连接酶。实际应用中，噬菌体T4DNA连接酶是首选用酶，这是因为在一定反应条件下，它能有效地将平端DNA片段连接起来。

在基因工程中，外源DNA片段与载体DNA之间的连接方式很多，如粘性末端连接、平端连接、人工接头法等、

1． 粘性末端连接法，利用单一内切酶或两种不同的内切酶将DNA切出粘性的末端，DNA粘性末端间的碱基可互补配对，这种碱基间的识别配对可在较低的温度下完成，然后利用连接酶将缺口封闭。如本实验中使用的EcoR I酶切即是产生粘性末端。对于两个不同粘性末端的载体与目的基因，连接后转化子重组的机率很高，而且转化子的目的基因以一个方向插入载体质粒中。EcoR I酶相对其它内切酶来说，制备方法成熟、产量高，是最便宜的一种内切酶，因而被广泛使用。

2． 平端连接法，即不用专一性限制性内切酶酶切位点，而利用某些酶对DNA能切出平整的末端，然后用T4DNA连接酶将两者连接，这就是平头(blunt end)连接法。它要求DNA的浓度高，连接酶的用量比粘性末端的连接大20～100倍，因此较少被采用。

3． 人工接头（linker）法，它是在要连接的外源DNA或载体DNA的末端，先接上一段互补的人工接头，该接头上有内切酶识别位点（已有多种人工接头商品出售，如BamH I接头EcoR I接头、Pst I接头等等）。这些接头可在用一种或二种限制性内切酶将其切开，产生粘性末端，将外源基因与载体DNA连接。几种接头的连接所产生的转化效率不同。也有用平端接头的，但较少使用。使用人工接头方法的优点法还在于可以根据接头设计通用引物，对克隆进行PCR鉴定。

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上述几种连接方法，连接效率也各不相同。平头连接产生的转化中，载体自连的机率高，重组质粒在载体与目的基因结合处的限制性酶切位点消失，而且，在重组质粒中往往有目的基因的多聚体。对于两个不同粘性末端的载体与目的基因，在连接前最好要对各片段分别纯化，这样，连接后转化子重组的机率很高。对如相同粘性末端的载体与目的基因的连接，转化子自连机率高（可以用CIP处理，减少自连），而且重组子中目的基因以两个方向插入载体质粒中，重组子中往往也带有目的基因的多聚体。一般情况下，粘性末端连接产生的重组子的载体与目的基因结合处的限制性内切酶位点尚可保留，但也有例外：如BamH I、Bcl II酶切后粘端相同，但连接重组后，各自的识别位点都失去，也就不能切割了。因此，在连接液中加入BamH I或Bcl II进行酶切，就可以减少载体自连。 （二） 影响基因连接的因素

1． 连接酶的用量： 在一般的情况下，酶浓度高反应速度快、产量也高， 但是当使用的连接酶单位下降时，要加入大量的连接酶，而连接酶是保存在50％甘油中，因此在连接反应体系中由于甘油含量的过高，会影响连接效果。如果连接酶的纯度欠佳，加进的连接酶达到一定浓度后，再增加酶量对加快反应速度并不明显，而杂酶（如降解酶）的作用变得明显，从而影响产率。

2． 作用时间与温度：反应时间是与温度有关的，因为反应速度随温度的提高而加快。在我们的实验中，采用12℃～15℃与8℃～9℃两种温度，也有人尝试采用4℃～5℃反应一周，效果良好。但在选择反应温度与时间关系时，要考虑反应系统中的其它因素的影响。

3． 底物的浓度：一般采用提高DNA的浓度来增加重组的比例，但是当底物浓度过高，反应体积太小（即浓度太大）时，连接效果也很差，这可能是分子运动受到阻碍。当DNA连接浓度太低与连接体积太大也易于造成DNA的自连而产生重组子中的多聚体。

4．干扰因素： 在酶切与连接反应中，除了要求较高质量的纯酶以外，也要排除其它干扰因素，如EDTA的存在会抑制酶的活性，DNA样品中如有蛋白质、RNA存在，也会妨碍酶与DNA的直接作用，因而影响酶切与连接效果。当酶切结束，为了除去加进的内切酶以及在终止酶切反应时所加进去的EDTA，都需要进一步提纯DNA样品，如果采用直接混合DNA酶切样品进行连接，势必会产生一些干扰作用。所以一般只能用加热方法终止酶切反应，由于采用两者直接混合连接，在酶切时就要计划好酶切后的连接体积与浓度，不可能依靠进一步纯化样品时来浓缩与控制DNA连接体积。

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实验八：T载体应用时的DNA连接

目的：学习一种简单快速的DNA重组连接方法，即T载体连接法(也称TA克隆法)。将PCR扩增的基因片段经纯化后直接与一种特殊载体即pMD 18－T载体进行连接，构建体外重组DNA分子。

原理：大部分耐热性DNA聚合酶反应时都有在PCR产物的3’末端添加一个或几个―A‖碱基的特性；pMD 18－T载体是在pUC18载体的多克隆位点处的Xba I和Sal I 识别位点之间插入了EcoR V识别位点。用EcoR V进行酶切反应后，再在两侧的3’端添加―T‖而成。利用PCR产物3’末端的―A‖碱基与T载体3’末端的―T‖碱基间的互补配对，经连接酶作用，完成PCR产物与载体的连接。

仪器与试剂：

1． pMD 18－T Vector（TaKaRa公司） 2． PCR扩增产物 3．T4 DNA连接酶

4．10×T4DNA连接酶缓冲液（同第一节） 5．电泳试剂同上一章

5． PCR产物纯化试剂或试剂盒

实验方法：

（一）PCR产物的准备

PCR产物与T载体连接前最好进行纯化，以减少引物及其它杂质对连接的影响。纯化方法可以采用PCR产物纯化试剂或试剂盒。下面介绍常规纯化方法。

1． 加等体积氯仿于PCR反应产物中室温高速离心1-2 min。 2． 去除管底的石蜡油。

3． 再离心2 min，去除管底微量的石蜡油，务必除尽。 4． 在PCR产物中加等体积的异丙醇，振荡，室温放置30min。 5． 4℃全速离心20mins，70%乙醇洗涤。 6． 真空干燥。

7． 重悬 DNA于 8-10μl ddH2O中, 加loading buffer 并上样于 1.5% 琼脂糖凝

胶进行DNA分离， DNA量越多越易克隆。 8． 切下条带，尽量减少紫外光下暴露时间。

（说明：1.在使用热盖PCR扩增时，多不加石蜡油，因此可省去操作1～3; 2. 若是构建cDNA文库，例如限制性cDNA文库，因PCR产物中含有多种cDNA片段，则应

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该用PCR产物纯化试剂盒进行纯化）。 （二） PCR产物同T载体的连接

1． 65℃加热凝胶条10min， 置37℃水浴。 2． 微型离心管中加入下列连接反应液， 反应体系 10×连接缓冲液 pMD 18－T 载体

① 2μl 1μl

② ③ 2μl 1μl

10μl

15μl 1μl 20μl

7μl 1μl 20μl

16μl 1μl 20μl

2μl

④ 2μl 1μl

PCR扩增产物（凝胶） 10μl ddH2O T4DNA连接酶 总体积 3． 12℃保温过夜。 4． 加入100μl H2O。 5． 68℃加热混合物5min。

6． 用酚、酚：氯仿及氯仿抽提，除去凝胶。 7． 加10μl 3M NaAc（pH5.2） 用乙醇沉淀。

6μl 1μl 20μl

Control Insert DNA 1μl

8． 用70%的乙醇洗涤沉淀，真空干燥，转化前溶入5μl H2O。

说明： 对于②、 ④ 则不进行5～6步的操作） 2. 若用PCR产物用试剂盒纯化，则可按如下反应体系进行： 反应体系

10X 连接缓冲液 pMD 18－T 载体 PCR扩增产物 ddH2O T4DNA连接酶 总体积

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① 1μ 1μl

② 1μl

③ 1μl 3μl 5 μl 1μl 10μl

④ 1μl 1μl 7μl 1μl 10μl

1μl 1μl 6μl 1μl 10μl

3μl 4μl 1μl 10μl

Control Insert DNA

提示

－、 常见问题:

1. 非重组子多（即蓝斑数多）：载体消化不完全，和插入片段太少导致载体自连。 2. 没有转化子(假设感受态细菌很好)：太多或太少载体－插入片段复合体；连接酶缓冲液有问题（通常是ATP）；连接酶有问题。

3．PCR产物难以插入载体：确认PCR反应使用的DNA聚合酶在PCR产物的3’端加了―A‖，有些DNA聚合酶扩增的PCR产物是平端，如TaKaRa公司的Pyrobest DNA聚合酶等；PCR产物中短片段杂质DNA太多，应切胶纯化DNA片段；确认感受态细菌的质量。 二、 注意事项：

1．在进行克隆时，载体DNA与插入DNA的摩尔比一般为1：2～10。在TaKaRa公司的pMD18-T载体试剂盒中，1μl（50ng）载体的摩尔数约为0.03pmol, 对照插入DNA 1μl (50ng)的摩尔数约为0.15pmol。

2．克隆时使用的插入片段（PCR产物）尽量进行切胶回收纯化，PCR产物中的短片段DNA（甚至是电泳也无法确认的非特异性小片段）、残存引物等杂质、DNA片段的立体结构、片段的长度等都会影响TA克隆的效率。一般情况下，大片段DNA的克隆效率小于短片段DNA。

3．本实验操作连接后，直接进行转化时连接液的体积不要超过20μl。 4．连接反应应在16℃以下进行，温度升高（大于26℃）较难形成环状DNA。 5．连接效率偏低时，可适当延长连接时间至数小时。

6．当进行转化DNA用量较大或准备进行电转化时，需对连接液进行乙醇沉淀精制DNA后再进行转化。

7．T载体应一直保存在－20℃。当以干粉状态保存时，则可以保存更长时间。

附： pMD 18－T Vector连接试剂盒使用说明（TaKaRa公司）

1． 微型离心管中加入下列连接反应液， 反应体系 ① pMD 18－T Vevtor 1μl PCR扩增产物 1μl

Control Insert DNA 1μl ddH2O 3μl 3μl Solution I 5μl 总体积 10μl

5μl 10μl ② 1μl

（注：在连接单一外源DNA片段时，T载体取0.5μl实验也可得到满意的效果）

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2． 用微量进样器加样，顺序为ddH2O， T 载体，PCR产物，最后加Solution I（放于冰浴中）。用后立即放回－20℃保存。

3． 盖紧盖子用手指轻弹Eppendorf管或用微量进样器混匀反应液，于台式离心机转2秒钟，以集中样品。

4． 将各反应管置温度已调至16℃的保温瓶内，盖紧瓶盖，反应30分钟以上（过夜反应不一不能影响效果）。

5． 各管取约25ng的DNA连接产物进行琼脂糖凝胶电泳，观察连接反应效果，电泳时需以载体酶切片段、目的基因酶切片段作为对照。

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实验九：重组DNA转化

目的：在体外连接组装而成的重组DNA分子只能转入合适的受体细胞，才能大量地进行复制、增殖和表达。通过实验学会重组DNA转化的最基本的操作以及如何提高转化效率的基本思路。

原理：带有外源DNA片段的重组体分子在体外构建成后，需要导入适当的宿主细胞内进行繁殖或表达出具有一定生物活性的蛋白。能够作为重组体转化的受体，主要有动物细胞、植物细胞、微生物细胞等。导入受体细胞的途径主要有转化（转染），显微注射和电穿孔等多种不同的方式。可以根据不同的受体选择不同的导入方式。一般情况下，细菌一类的原核生物和酵母这样的低等真核细胞可用转化方式导入，而高等动植物细胞则需采用显微注射或电穿孔来进行。

细菌表面通过CaCl2处理后，局部失去细胞壁或细胞壁溶解，DNA分子能够通过质膜进入细胞。其进入细胞的方式是完整的双链DNA分子首先吸附到细胞表面，双链DNA分子解链变成单链，单链DNA分子一条进入受体细胞内，另一条被降解。进入细胞内的单链DNA则复制成双链环状DNA，随同复制子同时复制，并被转录翻译。

仪器与主要试剂：

（一） 仪器

1． 隔水式电热恒温培养箱 2． 超净工作台 3． 高速冷冻离心机 4． 水浴锅 （二）主要试剂

1． LB液体培养基：1%蛋白胨、0.5%酵母提取物、1%NaCl，用5mol/L NaOH

调节PH值至7.4，于103.42kPa（15磅）灭菌20分钟。

2． LB固体培养基：在配制的液体培养基三角烧瓶中加入2%琼脂，于

103.42kPa（15磅）灭菌20分钟。 3． 抗菌素：

（1） （2）

氨苄青霉素(Amp)用前在无菌试管中,用灭菌水配制,母液浓度链霉素（Str）用前在无菌试管中, 用灭菌水配制,母液浓度为

为100mg/ml。 50mg/ml。

4． 100mmol/L CaCl2 溶液：称取无水CaCl25.6克，加重蒸水至500 毫升，

于103.42kPa（15磅）灭菌20分钟。

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5． 50%的PEG6000溶液：称取50 克聚乙二醇6000加重蒸水溶解，定容

至100毫升，103.42kPa（15磅）灭菌20分钟。

实验方法（用CaCl2制备新鲜的感受态细胞转化法）：

感受态细菌制备

（1） 挑取平板上活化菌落接种于2毫升LB培养液中，37C培养过夜。 （2） 按1%挑取过夜培养菌接种于50mlLB培养液中，370C振荡培养2～

2个半期小时（OD600约在0.2～0.4） 。

（3） 培养物放冰浴中冷却10分钟。

（4） 分装在离心管中，4C 5000rpm离心5min，收集菌体，培养液尽量

倒干净。

（5） 把菌体悬浮于10 ml的100mmol/L CaCl2 溶液，置冰浴中20min，

40C5000rpm离心5min，收集菌体。

（6） 再将菌体悬浮于1-2ml的100mmol/L CaCl2 溶液中，40C保存，12-24

小时后即可作为感受态细胞进行转化。

转化实验

（7） 取200?l感受态菌，加入待转化的重组DNA（体积应小于10?l，

DNA?50 ng）混匀后置冰浴中30min（一般同时要做阳性对照和阴性对照。阳性对照为加入已知量的未重组质粒DNA的感受态菌，用于检测转化效率。阴性对照为完全不加质粒DNA的的感受态菌，用于检测感受态细菌有无污染及检测抗生素的活性）。

（8） 放入冰浴中30 min，转入420C水浴90s，再冰浴1-2 min，加入培养

液800?l，放370C振荡培养45min。

（9） 将适当体积已转化的感受态细胞均匀铺于含有X-gal和IPTG的琼脂

平皿上。

（10） 待平皿中液体吸收后，倒置平皿，于370C培养12-16小时可出现菌

落。根据兰白斑进行重组子的筛选。

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0

0

实验十：重组子的鉴定

目的：从转化细菌菌落中筛选出含有阳性重组子的菌落，并鉴定重组子的正确性。了解重组子鉴定常用的几种方法及其原理，掌握其中一、两种鉴定方法的操作步骤。 原理：不同的克隆载体及相应宿主系统，其重组子的筛选和鉴定方法不尽相同。根据重组子遗传表型改变进行筛选，有?-互补、插入灭活等方法；根据重组子结构来筛选，方法有限制酶切分析、PCR法以及杂交筛选等。通过这些方法的鉴定，我们可以确定是否在载体中插入了外源DNA，但是，如果该DNA片段来源于PCR扩增，或经突变改造后的产物，还要最终通过DNA序列分析，进行确定其是否与我们所要研究的目的基因的序列完全一致。 A． ?-互补法

现在使用的许多载体（如PUC系列）都带有一个大肠杆菌DNA的短区段，其中含有?-半乳糖苷酶基因lacZ的调控序列和N端146个氨基酸的编码信息。这个编码区中插入了一个多克隆位点，它并不破坏阅读框，但可使小数几个氨基酸插入到?-半乳糖苷酶的氨基端。这种载体适用于可编码?-半乳糖苷酶碳端部分序列的宿主细胞。虽然宿主和质粒编码的片段各自都没有酶性，但它们可融为一体，形成具有酶学活性的蛋白质。这样，lacZ基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的?-半乳糖苷酶阴性的突变体之间实现互补，这种现象叫?-互补。有?-互补产生的Lac+细菌易于识别，因为它们在生色底物5-溴-4-氯-3-吲哚-?-D-半乳糖苷（X-gal）存在下形成蓝色菌落。然而外源DNA片段插入到质粒的多克隆位点后，破坏了原有的阅读框，即产生无?-互补能力的氨基酸片段。因此，在相同条件下，带重组质粒的细菌形成白色菌落。 B．插入失活法

该法只能用于比较老的质粒（如PBR322），这些载体带有两个或更多个抗生素抗性基因和分布适宜的限制性酶切位点。待插入的DNA及已纯化的质粒DNA都用限制酶消化，这些酶的识别位点只位于一个抗生素抗性基因区内（terr）。在适宜温度下将两个DNA连接后，用连接产物转化大肠杆菌，选择对第二个抗生素(氨苄青霉素)有抗性的转化体。在氨苄青霉素存在下生长的菌落，一些含有重组质粒，而另一些可能含有无外源DNA而在连接过程中自身环化的质粒DNA。为区分两种转化体，可以用两种分别含有氨苄青霉素和四环素的平板，在相互对应的位置上，各自接入同一菌落，照此将一批菌落接种于平板的各处。在四环素平板中存活并生长的菌落含有带活性ter基因的质粒，这样的质粒不可能有外源DNA插入。在四环素平皿中不生长而在氨苄青霉素平板中生长的菌落含有带失活的terr基因的质粒，这些质粒可能带有外源DNA序列。

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C．PCR法

挑取一些独立的转化质粒进行小规模培养，按碱裂解法少量制备质粒DNA，然后用与插入片段两端互补的特异引物进行PCR扩增，扩增出与目的序列大小一致的特异片段的转化子为阳性重组子。有关抽提质粒DNA和PCR操作方法请参阅质粒DNA的抽提和基因的PCR扩增技术。 D．限制性酶切法

挑取一些独立的转化质粒进行小规模培养，按碱裂解法少量制备质粒DNA，然后用插入片段两端互补的限制酶进行消化，以释放出插入片段，然后通过凝胶电泳检测插入片段和载体的大小。若外源DNA是经单酶切后插入，即两端是同一个内切酶，这时除了对转化子进行单酶切，以观察是否有相同大小的外源DNA插入外，还要对插入片段的方向进行鉴别。有关质粒DNA抽提和限制性酶切分析方法的操作请参阅质粒DNA的抽提和DNA限制性酶切分析技术。 E．杂交筛选

将平板上待筛选的菌落转移到硝酸纤维膜上，然后在膜上原位裂解细菌并使释出的DNA非共价结合于滤膜上。在对滤膜上尚未结合DNA的其它活性部位作杂交封闭处理后，滤膜与标记的特异核酸探针杂交。由于探针与靶DNA有很好的碱基配对关系，故能牢固结合于靶DNA上，而非特异结合在膜上的探针，则很容易在以后的洗脱过程中洗去。洗涤后的滤膜，贴压上X-光胶片，暴光一段时间后，作显影、定影处理。如果待筛菌落中含有靶DNA序列，则在自显影胶片上可见到阳性杂交信号，与滤膜对应的平板上的菌落即为所需的克隆。 F．DNA序列分析

由于DNA序列分析费时、费钱，故本法不作常规筛选之用。只有在经过其它筛选手段仍不能确定是否为目的克隆的情况下，对最有希望的克隆作序列分析，最终予以确认或否定。

仪器与主要试剂：

（二） 仪器

1． 隔水式电热恒温培养箱 2． 超净工作台 （三） 试剂

1． LB固体培养基：1%蛋白胨、0.5%酵母提取物、1%NaCl，用5mol/LnaOH

调节PH值至7.4后，加入2%的琼脂，于103.42kPa（15磅）灭菌20分钟。

2． X-gal储存液：将X-gal溶于二甲基甲酰胺中，配成20mg/ml浓度的溶液，

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装于玻璃或聚丙烯管中，用锡箔纸包裹，储存于-200C。

3． IPTG溶液：将2克IPTG溶于8 ml水中，用水调节体积至10ml。用0.22?m

的一次性过滤器过滤除菌，分装成1ml小份，储存于-200C。

实验方法（以?-互补法为例）：

1． 在一事先制备好的含相应抗生素的琼脂平板上加40?lX-gal储存液和4?l异丙

基硫代-?-D-半乳糖苷（IPTG）溶液（浓度为200mg/ml）。

2． 用无菌玻璃涂布器把溶液涂布于整个平板的表面，于370C培养直至所有的液

体消失。由于二甲基甲酰胺挥发度低，如使用新制备的平板则需要3-4小时。 3． 将待检细菌接种到平板上，可用接种环或牙签划线接种，也可将100?l细菌

悬液涂布在琼脂培养表面。接种物吸收后，倒置平板于370C培养12-16小时。 4． 于40C将平板放置数小时，使蓝色充分显色。带有?-半乳糖苷酶活性蛋白菌

落中间为蓝色，外周为深蓝色。白色菌落偶尔也在中央出现一个淡蓝色斑点，但其外周无色。

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第四章

SDS－PAGE检测蛋白

实验十一：蛋白质聚丙烯酰胺凝胶电泳

目的：掌握SDS-PAGE的基本原理，学会使用该方法来分析所表达的蛋白质，蛋白质大小、形状和所带电荷不同，在SDS-PAGE中的迁移率就不同，因此可采用该方法来推算所表达的蛋白质的分子量。

原理：聚丙烯酰胺，即丙烯酰胺和少量交联剂甲叉双丙烯酰胺，在催化剂过硫酸铵作用下聚合形成凝胶。反应液中还加有四甲基乙二胺用来引发和控制聚合反应。反应混合物在底部用1.5%琼脂封闭，反应液顶覆盖一层水层，保证凝胶表面平坦，同时起到隔离大气中氧气的作用，因为氧气可抑制聚合反应。

在蛋白质溶液中加入SDS，这种阴离子去污剂能够与蛋白质相结合，破坏蛋白质内部、分子之间以及其他物质的非共价键，使蛋白质变性而破坏原有的空间构象。按照1.4gSDS/1g蛋白质结合，形成SDS-蛋白质复合物。由于SDS带负电，使各种蛋白质的SDS-多肽复合物都带上相同密度的负电荷，它的量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，因而掩盖了不同种类的蛋白质原有的电荷差别；同时，不同蛋白质的SDS复合物形状也相似，都呈长椭圆形。因此，在自由电泳时，它们的泳动率基本相同，而在某一适宜浓度的聚丙烯酰胺凝胶电泳介质中电泳时，由于凝胶的分子筛作用，电泳迁移率就取决于蛋白质-SDS复合物的大小，也可以说是取决于蛋白质分子量的大小。

根据经验得知，当蛋白质分子量在11.7-165KD之间时，蛋白质-SDS复合物的

电泳迁移率与蛋白质分子量的对数成线性关系，符合直线方程式；lgMW=-bX+K（MW为蛋白质的分子量，X为蛋白质-SDS复合物电泳的相对迁移率，K和b均为常数），将已知分子量的标准蛋白质在SDS-PAGE中电泳迁移率对分子量的对数作图，即可得到一条标准曲线。只要测得未知分子量的蛋白质在相同条件下的电泳迁移率，就能根据标准曲线求得其分子量。

仪器与主要试剂： 1. 主要器材：

电泳仪、垂直电泳仪、进样器、镊子、注射器、烧杯、旋涡器、离心机 2. 主要试剂： （1） （2） （3）

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低分子量标准蛋白质液10?l； 菌体培养液一支1.5ml；

2×蛋白质样品缓冲液，组成如下：

Tris β-巯基乙醇 溴酚蓝 甘油 SDS 蒸馏水

3. 试剂

30%丙烯酰胺 10%过硫酸铵 TEMED 上胶缓冲液 下胶缓冲液

0.15g 1.0ml 0.02g 2.0ml 0.4g 7.0ml

称29g丙烯酰胺，1g甲叉丙烯酰胺，溶于蒸馏水并定容至100ml，滤纸过滤后置棕色玻璃瓶内室温保存 1g过硫酸铵溶于蒸馏水定容至10ml N，N，N’，N’-四甲基乙二胺，棕色瓶保存

Tris12.1g， SDS0.4g溶于60ml蒸馏水，用盐酸调pH6.8，定容至100ml

Tris12.1g， SDS0.4g溶于60ml蒸馏水，用盐酸调pH8.8，定容至100ml

1×甘氨酸电泳缓冲液 25mmol/L Tris（3.02g），250mmol/L 甘氨酸（18.8g），

0.1%SDS（1g）

染色液 脱色液

实验方法： 1. 安装电泳槽

先将二块玻璃板洗干净，干燥，嵌入胶带的凹槽中，装在电极槽上，拧紧外螺丝，使其夹紧（不能过紧以防玻璃破裂）。为避免制胶时胶液由狭缝漏掉，灌胶时可先在槽底部和两边用溶化的1%琼脂封闭，使其液面高度与外挡板一致，待琼脂凝固后再配制聚丙烯酰胺分离胶（下胶）。 2. 凝胶的制备

由冰箱中取出储液平衡到室温后开始配胶，在50ml烧杯内按下列配方配制：

10%SDS-PAGE配方 30%丙烯酰胺

缓冲液

H20

10%过硫酸铵 TEMED 总体积

17

17

ml ml ml ?l ?l ml 下胶10% 6.67 4.25 5.89 120

上胶4% 0.65 1.25 3.04 50 5 5

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0.5g考马斯亮蓝R250，90ml甲醇，20ml冰乙酸，加水至200ml

与染色液成分相似，无考马斯亮蓝R250

3. 灌胶

迅速将配好的丙烯酰胺溶液灌入两片玻璃板的间隙中，留出灌注浓缩胶所需的空间（梳子齿长再加1厘米），用细管小心地在丙烯酰胺溶液上覆盖上一层蒸馏水，防止因氧气扩散进入凝胶而抑制聚合反应。待分离胶聚合完全后（约30min），倾出覆盖水层。

再按上表配置4%浓缩胶（上胶）立即混合，在已聚合的分离胶上直接灌注后，立即在上胶溶液中插入干净的Teflon梳子，两边平直，小心避免气泡混入，将凝胶垂直放置于室温下10-15min，待浓缩胶凝固后，将梳子小心拔出，然后用水冲洗加样槽以除去未聚合的丙烯酰胺，用针头把加样槽之间的胶齿弄直，并在电泳槽内加入Tris-甘氨酸电泳缓冲液。 4. 样品处理 （1）

待测蛋白质样品处理

经37℃培养过夜的大肠杆菌菌液1.5ml， 6000rpm离心10min，弃上清加入TE缓冲液（0.1molTris，10mmol/L EDTA）50?l，将菌体再旋涡器悬浮，再加入2×样品缓冲液50?l混匀，在100℃水浴中煮沸5min。 （2）

标准蛋白质样品的处理

将已分装好的10?l标准蛋白质样品中加入10?l样品缓冲液，混匀，在100℃水浴中煮沸5min。 5. 加样

待样品冷却后，用微量进样器（接上小吸管），吸取30-40?l样品，按号依次加入样品槽，因样品液内有甘油，可使样品沉降在凝胶面上。 6. 电泳

加样完毕，将前槽接负极，后槽接正极，打开直流电源，先把电压调至8v/cm（80v），待染料前沿进入分离胶成狭窄带时，将电压提高到12v/cm（120v），电泳4-6h后，直到溴酚蓝指示剂迁移到接近凝胶底部时立即停止电泳。 7. 剥胶

从电泳槽上卸下凝胶板，放置在纸巾上，用刮勺撬开玻璃板。 8. 染色以及脱色

将电泳后的凝胶板轻轻取下，放入染色液中染色，约1h后，把染色液倒回瓶中，加入脱色液，脱色4-8h，其间更换脱色液3-4次。可将凝胶浸于水中或固定在20%甘油中或抽干，干燥后成胶片保存或拍照。 五、蛋白质分子量计算

电泳迁移率的计算：

按下列公式计算蛋白质样品的相对迁移率（MR）

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