分子生物学实验技术实验报告

2013年分子生物学实验技术实验报告

实验名称：口蹄疫病毒VP1蛋白的表达

姓名： 学号： 班级 成绩

一、实验目的

本实验从口蹄疫病毒核酸的提取、分离、纯化、鉴定等实验技术入手，通过DNA技术、RNA技术和蛋白技术实验技术的应用，训练学生掌握分子生物学的基本试验方法和操作技能，进一步巩固理解分子生物学的基础知识和相关理论，从而为毕业论文选题和开展分子生物学方面的研究项目奠定基础。 二、实验材料与器材

1、病毒样品：口蹄疫病毒强毒株和阳性口蹄疫冰帝VP1重组质粒

2、仪器设备：凝胶图像分析系统、PCR仪、恒温水浴锅、培养箱、高速台式离心机、超低温冰箱、漩涡混合器、微量移液器等

3、试剂：pMD -18载体、PCR胶回收试剂盒 ，反转录试剂盒等

4、溶液：LB液体培养基，电泳缓冲液，0.1mol/l Cacl2溶液，氨苄青霉素母液，10％SDS，10％过硫酸铵，1.5M Tris-HCL，1M Tris-HCL，考马斯亮蓝染色液，脱色液，电转缓冲液，包被液，显色液等 三、实验方法

（一）反转录聚合酶链反应（RT-PCR） 1、口蹄疫病毒总RNA的提取

1.1将250μL液体口蹄疫病毒样品加入1.5mL离心管中，再加入750μL预冷的冰RNAiso Reagent。 1.2 将样品剧烈混合后，在室温静置5分钟。

1.3 加入200μL氯仿，颠倒离心管混合两次，并剧烈震荡混匀，使液体充分混匀呈乳白状（无分相现象）后，再室温静置5分钟。 1.4在4℃ 条件下，以12000×g 离心15分钟。

1.5将上层水相转移到一个新的1.5mL离心管中，加入等体积的异丙醇并上下颠倒混匀，然后在室温静置至少10分钟。

1.6在4℃ 条件下，以12000×g离心15分钟后，小心并尽可能地除去全部上清液。

1.7用1ml 75%乙醇洗涤RNA沉淀和管壁，4℃ 12000×g 离心5分钟后小心弃去乙醇。 1.8将RNA沉淀进行干燥（不能完全干燥）处理后，用10μL无RNase污染的水（RNase-Free water）将RNA溶解并于-20℃保存备用。

（二）反转录

1、反应体系（10μl）如下：

组 份 5×Buffer dNTPs RNA酶抑制剂 下游引物 反转录酶AMV 提取的RNA 总体积

体 积 2μL 3μL 0.5μL 0.5μL 0.5μL 3.5μL 10μL

2、加完后的体系，轻弹混匀，瞬离。 3、反应条件：42℃，1小时。

4、完成以后进行下一步实验或者放-20℃保存备用。 （三）聚合酶链反应（PCR） 1、反应体系（25μl）：

组 份 ddH2O 10×PCR Buffer

dNTPs P1 P2 Taq酶 cDNA template

Totle

体 积 16.25 μL 2.5 μL 2 μL 1 μL 1 μL 0.25 μL 2 μL 25 μL

2、设立阳性对照组和阴性对照组。

3、加完体系后，轻弹混匀，瞬离，上PCR仪。 4、特异性反应条件为：

预变性 94℃ 5min 变性 94℃ 1min

退火 55℃ 1min 30 Cycles 延伸 72℃ 1min 终延伸 72℃ 10min

（四）PCR产物检测：琼脂糖凝胶电泳 1、电泳缓冲液TBE（10×）的配制：

称取Tris-base 54g，硼酸27.5g，并加入0.5M EDTA(PH 8.0) 20 mL，定容至1000mL。

2、1.0%琼脂糖凝胶的配制：

称取1.0g琼脂糖于三角锥形瓶中，加入10mL 10×TBE缓冲液，并加水定容至100mL,加热溶解后加入5μL EB（10mg/mL），摇匀后倒入插有梳子的电泳槽，待其凝固后拔去梳子即可用于电泳。 3、电泳检测：

取PCR产物5μL 于Loading Buffer 1μL混合，加入到琼脂糖凝胶点样孔中，同时在样品孔旁加入5μL DL2000 DNA Marker 作对照，以100V电压，50mA电流进行电泳，约15min后于紫外灯下观察结果。 基因克隆

（一）DNA片段与载体的连接 1、反应体系（10μL）：

组 份

Ligation SolutionI PCR回收产物 pMD18-T 总体积

体 积 5 μL 4.5 μL 0.5 μL 10 μL

2、反应条件：16℃，4小时以上。 （二）感受态细胞的制备

试剂的配制： 1、LB液体培养基：

称取蛋白胨（Tryptone）10g，酵母提取物（Yeast extract）5g，氯化钠10g，溶解于800mL去离子水中，用氢氧化钠调PH至7.5，加去离子水定容至1L，高温高压灭菌20min。 2、0.1mol/L 氯化钙溶液：

称取1.11gCaCl2（无水，分析纯），溶于超纯水中，定容至100mL,高温高压灭菌或0.22μm滤膜过滤除菌。 3、无菌甘油：

取甘油100mL，高温高压即可。 操作步骤（无菌操作）：

1、从生长有大肠杆菌DH5α的平板上挑取一个单菌落，接种于2mL LB液体培养基中，37℃ 200rpm，震荡培养过夜，作为一级种子。

2、将一级种子按照1:50比例无菌转接到5mL LB液体培养基中，37℃ 200rpm震荡培养约2-3小时，至细菌的OD600达到0.5左右。

3、在无菌条件下将细菌转移到一个无菌的1.5mL离心管中，冰浴30min。 4、4℃，4000rpm离心10min，弃上清。

5、加入1mL预冷的冰的0,1mol/L CaCl2，轻轻重悬。悬浮的感受态细胞可直接用于转化，若要保存，则需加入无菌甘油至终浓度为15%，分装100μL/管，-70℃保存备用。 （三）连接产物的转化 试剂配制：

1、氨苄青霉素（Ampicillin, Amp）母液：

用灭菌的ddH2O将氨苄青霉素粉配成100 mg/mL水溶液，经0.22μm滤膜过滤除菌后，置-20℃保存备用。 2、Amp+抗性的LB液体培养基：

在LB液体培养基中加入1μL 100mg/mL的氨苄青霉素母液后混匀即可，一般现配现用。

3、Amp+抗性的LB固体培养基：

在LB液体培养基中加入1.5%的琼脂粉，15磅高压蒸汽灭菌20min。待培养基温度降至50℃左右，加入1μL 100mg/mL的氨苄青霉素母液后，铺制平板。待培养基凝固后，于4℃保存备用。 操作步骤：

1、去-70℃冻存的感受态细胞于冰上融化后，加入连接产物5μL，轻轻混匀，冰浴30min。

2、42℃水浴热激90sec，再迅速放回冰上2min。

3、加入400μL LB液体培养基，37℃ 200rpm-220rpm震荡培养45min后，以恢复质粒的抗性。

4、4℃，4000rpm 离心5min，弃上清400μL，将剩余100μL菌液混匀后涂氨苄平板，37℃培养30min（平皿正放），待菌液吸收完全，再将平皿倒置培养约12-16小时，至单菌落出现。 （四）质粒的抽提

操作步骤：

1、用灭菌牙签挑取单菌落于5mL含氨苄青霉素的LB液体培养基中37℃ 200rpm震荡培养12-16小时。

2、用1.5mL离心管收集1.5-5mL菌液，离心收集菌体，弃尽上清。（注：在1.5mL离心管中加入1.5mL菌液，离心收集菌体，弃上清后再加入1.5mL菌液，收集菌体，如此反复。）

3、加入250μL Solution I/ RNase A重悬菌体。

4、加入250μL Solution II，轻轻颠倒混匀4-6次，使细菌裂解，室温放置2min，使菌液变清亮。（注：混匀时用力不宜过度，看到溶液变粘即可。）

5、加入350μL Solution III，轻轻颠倒混匀数次直至出现白色沉淀，12000rpm离心10min。

6、将离心后的上清全部转移到HB离心柱中，室温12000rpm离心1min。（注：此时HB离心柱置于收集管中。）

7、弃掉收集管中的液体，向HB柱内加入500μL Buffer HB，室温12000rpm离心1min。 8、弃掉收集管中的液体，向HB柱内加入700μL DNA Wash Buffer，室温12000rpm离

心1min。（注：目的是将Resin上吸附的蛋白质、盐等杂质洗脱。） 9、重复步骤8.

10、空柱12000rpm离心1min，以甩干剩余液体。（注：主要是去掉残余的乙醇，以利于DNA的溶解。）

11、将HB离心柱置于新的1.5mL离心管中，向柱中加入50-100μL 灭菌的去离子水，12000rpm离心1min，离心管管底即为质粒DNA，置于-20℃保存备用。 12、1.0% 琼脂糖凝胶电泳检测，观察结果。

（五）重组质粒的酶切鉴定

1、反应体系（20μL）：

组 份 重组质粒 10× Buffer RcoR I BamH I ddH2O 总体积

体 积 5 μL 2 μL 1 μL 1 μL 11 μL 20 μL

2、反应条件：37℃，3小时以上。

3、结果检测：取酶切产物10μL与2μL Loading Buffer混合后，用1%琼脂糖凝胶电泳检

测，同时设DL10000 DNA Marker作对照。

外源基因在大肠杆菌中的表达

（一）含有表达质粒的重组细菌的诱导表达

操作步骤：

1、将重组质粒和对照载体分别转化BL21（DE3）感受态细胞，待长出菌落后在转化的平皿中各挑取一个单菌落接种于3mL含Amp的新鲜LB液体培养基中，37℃培养过夜。

2、将培养的细菌按1:50比例加入到5mL含Amp的新鲜LB液体培养基中，37℃震荡培养至OD600在0.4-1.0之间（最好0.6，大约3小时）。

3、取1mL菌液作为未诱导的对照组，余下的加入IPTG诱导剂至终浓度为0.5mM作为实验组，两组继续37℃震荡培养3小时。

4、分别取菌液1mL于1.5mL离心管中，12000×g离心30s，收获菌体。

5、用100μL无菌去离子水将菌体吹散混匀，然后加100μL 2×SDS凝胶加样缓冲液，混匀

后沸水浴5min。

6、通过SDS-PAGE电泳检测外源蛋白的表达情况。

（二）SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）

实验原理：

细菌体中含有大量蛋白质，具有不同的电荷和分子量。强阴离子去污剂SDS与某一还原剂（如巯基乙醇或二硫苏糖醇DTT）并用，通过加热使蛋白质解离，大量的SDS结合蛋白质，使其带相同密度的负电荷，在聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）上，不同蛋白质的迁移率取决于分子量。采用考马斯亮蓝快速染色，可及时观察电泳分离效果。因而根据预计表达蛋白的分子量，可筛选阳性表达的重组体。 试剂配制：

1、30%丙烯酰胺贮存液（30% (w/v) Acrylamide)：

丙烯酰胺29.2g，亚甲双丙烯酰胺0.8g，加入ddH2O充分搅拌溶解并定容至100mL，棕色瓶存于4℃。

2、1.5M Tris-HCl（pH 8.0）：

Tris-base 18.17g加ddH2O溶解，浓HCl调节pH至8.0，定容至100mL，4℃保存。 3、1M Tris-HCl（pH 6.8）：

Tris-base 12.11g加ddH2O溶解，浓HCl调节pH至8.0，定容至100mL，4℃保存。 4、10%SDS：

电泳级SDS 10.0g，加ddH2O，68℃助溶，浓盐酸调pH至7.2，定容至100mL。 5、电泳缓冲液（pH 8.3）：

Tris 3.02g，甘氨酸 18.8g，10%SDS 10mL，加入ddH2O溶解，定容至1000,mL。 6、10%过硫酸铵（AP）：

1g过硫酸铵，加入10毫升ddH2O，搅拌溶解。 7、2×SDS电泳上样缓冲液：

1M Tris-HCl（pH 6.8） 1.0mL，β-巯基乙醇 1.0mL，SDS 0.4g，甘油 2.0mL，0.1%溴酚蓝 1.0mL，ddH2O 5.0mL。 8、考马斯亮蓝染色液：

考马斯亮蓝R-250 0.25g，甲醇45mL，冰醋酸10mL，ddH2O 45mL。 9、脱色液：

甲醇45毫升，冰醋酸10mL，ddH2O 45mL。

操作步骤：采用垂直式电泳槽装置 1、安装电泳槽。

2、配制分离胶（12%）（10mL）:

组 份 ddH2O 30%丙烯酰胺贮存胶 1.5M Tris-HCl 10% SDS 10% AP TEMED 总体积

体 积 3.3 mL 4.0 mL 2.5 mL 0.1 mL 0.1 mL 4.0 mL 10 mL

以上溶液混匀后灌入玻璃板间，以水封顶，注意使液面水平。（凝胶完全聚合需30-60min）。

3、配制浓缩胶（5%）（3mL）：

组 份 ddH2O 30%丙烯酰胺贮存胶

1M Tris-HCl 10% SDS 10% AP TEMED

体 积 2.1 mL 0.5 mL 0.38 mL 0.03 mL 0.03 mL 3.0 μL

总体积 3.0 mL

将分离胶上的水倒去，并用滤纸吸干多余的水份，加入上述混合液，立即将梳子插入玻璃板间，完全聚合需要15-30min。

4、待浓缩胶完全聚合后，小心拔出梳子，然后将玻璃板固定在电泳槽上。

5、样品处理：将样品加入等量的2×SDS上样缓冲液，100℃加热3-5min，12000×g离心1min，取上清作SDS-PAGE分析，同时将SDS低分子量蛋白质Marker作平行处理。 6、上样：取10μL诱导与未诱导的处理后的样品加入样品池中，并加入20μL低分子量蛋白Marker作对照。

7、电泳：在电泳槽中加入1×电泳缓冲液，连接电源，电泳时，浓缩胶电压80V，分离胶电压120V，电泳至溴酚蓝至电泳槽下端停止。

8、染色：将胶从玻璃板中取出，置于考马斯亮蓝染色液中染色，室温4-6小时。 9、 脱色：将胶从染色液中取出，放入脱色液中，多次脱色至蛋白带清晰。

10、凝胶摄像和保存：将脱好色的凝胶摄像，凝胶可保存于双蒸水中或者70%乙酸溶液中。 （三）Western Blot

实验原理：

Western 免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测；对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。

与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。

试剂准备：

1、SDS-PAGE试剂：见电泳实验。

2、匀浆缓冲液：1.0M Tris-HCl（pH 6.8） 1.0mL，10%SDS 6.0mL，β-巯基乙醇 0.2mL，ddH20 2.8mL。

3、电转缓冲液：甘氨酸 2.9g，Tris 5.8g，SDS 0.37g，甲醇 200mL，加ddH20定容至1000mL。

4、TBS（pH8.0）：Tris base 1.211g，NaCl 8.766g，加ddH20溶解后用HCl调节pH至8.0，定容至1000mL.

5、TBST：在TBS中加入终浓度为0.05% Tween-20即可。

6、包被液（5%脱脂奶粉，现配）：脱脂奶粉1.0g，溶于20mLTBST中。 7、显色液：DAB 6.0g，TBS 10mL，30%H2O2 30μL。 操作步骤：

1、蛋白质样品获得：细菌诱导表达后，可通过电泳上样缓冲液直接裂解细胞；真核细胞加匀浆缓冲液，机械或者超声波室温匀浆0,5-1min，然后4℃，13000×g离心15min，取上清液作为样品。

2、电泳：制备聚丙烯酰胺凝胶，进行SDS-PAGE。

3、转移（半干式转移）：?电泳结束后将胶条切割至合适大小，用点转移缓冲液平衡，5min×3次。?膜处理：预先裁好与胶条同样大小的滤纸和NC膜，浸入转膜缓冲液中10min。?转膜：转膜装置从下至上依次按阳极碳板、3层滤纸、NC膜、凝胶、3层滤纸、阴极碳板的顺序放好，滤纸、凝胶、NC膜精确对齐，每一步去除气泡，上压500g重物，将碳板上多余的液体吸干。接通电源，恒流1mA/cm2在，转移1-2小时。转移结束后，断开电源取膜将膜取出做免疫印迹。

4、免疫反应：?用TBST洗膜，5min×3次。?加入包被液，平稳摇动，室温2小时。?弃包被液，用TBST洗膜，5min×3次。④加入一抗（按合适稀释比例用TBST稀释，液体必须覆盖膜的全部），平稳摇动，室温1min。⑤弃一抗，用TBST洗膜，5min×4次。⑥加入辣根过氧化物酶偶联的二抗（按合适稀释比例用TBST稀释），平稳摇动，室温0.5-1小时。⑦弃二抗，用TBST洗膜，5min×3次。⑧再将膜转入TBS中洗2遍，每次5-10min。⑨加

入显色液，避光显色至出现条带时立即放入双蒸水中终止反应。

四、实验结果及分析

1. PCR 结果

口蹄疫RNA反转录的cDNA与口蹄疫VP1基因阳性质粒进行PCR，1%的琼脂糖凝胶电泳显示，cDNA PCR在600bp附近有一条较清晰的条带（左箭头），同时还有较为明显的引物二聚体，阳性质粒在600bp附近有一条明亮清晰的条带（右箭头）。结果可知PCR扩增出了VP1基因，但浓度较低。原因可能是cDNA量太少。（图1）

图1 PCR扩增的凝胶电泳结果

2. PCR 纯化

对阳性质粒与cDNA的PCR结果进行切胶回收，凝胶结果上几乎看不到条带，同组的条带是maker后的一号孔口，条带隐约可以看见，而其他组可以明显看到大于600bp的片段。造成的原因可能是初次切胶没有把含有较多DNA胶切下来，从而使得纯化的DNA的浓度过低，凝胶上没有条带出现。（图2）

图2 PCR纯化结果

3. 连接产物的转化结果

将感受态细胞与连接产物进行转化，培养16小时后，可观察到在平板上长出白色的单菌落，菌落数量较多，大小均一，说明感受态细胞制备成功，连接产物的转化较好。（图3）

图3 转化结果

4. 质粒的抽提结果

1%琼脂糖凝胶电泳结果显示出现较亮的条带，与marker相比，而出提取出的质粒的浓度高且质粒基本没有开环断裂，实验较为成功。（图4）

图4 质粒的抽提结果

5. 重组质粒的酶切鉴定结果

经RcoR I和BamH I酶切后，琼脂糖凝胶电泳可以看到两条条带，说明质粒进行双酶切后，环形质粒被酶切为质粒载体（约为3000bp）和目的条带（约为600bp），说明目的条带成功的连接到质粒上并且可以在大肠杆菌中复制。但目的条带较弱，说明复制量不高。(图5)

图5 重组质粒的酶切鉴定结果

6. SDS-PAGE 结果

SDS-PAGE电泳结果看到较为明显的阳性条带，说明蛋白在大肠杆菌内表达。（图6）

图6 SDS-PAGE结果

7.Western Blot 结果

在硝酸纤维素薄膜上可以看到有清晰的阳性条带，说明此次表达的蛋白是目的蛋白。但是中间的条带有明显的拖带现象，造成的原因可能是上样量太多，蛋白浓度较大而进行分离胶的电泳时使用为80v电压，时间不够久，导致不能有效的将蛋白分开（图7）

图7 Wester Bolt 结果

五、实验总结与讨论：

1. 在口蹄疫病毒的总RNA的提取过程中，并没有严格的在超净工作台中进行，但实

验后的RNA进行反转录和PCR扩增均有阳性结果。说明此次使用的口蹄疫病毒强毒株的总RNA提取较为容易。

2. PCR产物的纯化切胶时，由于第一次切胶，没有把目的胶带正确的切下来，导致获

取的目的DNA较少，下一步跑胶时没有出现较明显的条带。

3. 连接转化后，大肠杆菌在氨苄青霉素抗性的培养基上生长出的菌落与其他组对比

较少，分析原因为，纯化的目的DNA浓度较低，连接效率不高，使得长出的阳性菌落较少或是由于制作的感受态细胞由于机械外力作用破裂，如：Cacl2重旋用力过大，或是涂板方式不正确等。

4. 口蹄疫病毒VP1基因的表达的整个的实验过程，要提前做好实验准备工作，正确

操作，搞懂每步骤作用和注意事项，避免出错，才可以将所需要的蛋白表达出来。因此在以后的试验中要多加练习自己不熟悉的实验操作，减少不必要的操作失误，才有可能提高实验的成功率。

5. 通过本次实验让我更加了解分子生物学技术基本原理和方法，为以后进行相关研

究打下基础。

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