羊肉发酵香肠中生物胺含量的变化学士学位论文

摘 要

在发酵食品如发酵香肠、酸奶、泡菜及葡萄酒中，大都含有生物胺。胺在生活细胞中具有重要的生理功能，但当人体吸收过量时，可能会引起头痛、呼吸紊乱、心悸、血压变化等过敏性反应。此外，生物胺还是亚硝胺的前体，后者具有致癌效应，Wandekerckhove报道在老化和霉菌成熟型的发酵香肠中，生物胺的含量可达到100mg/Kg,有时甚至高达1000mg/Kg[1],因此，近年来，发酵食品中的生物胺含量的问题引起了人们的重视，本文采用高效液相色谱法监测了加有单一发酵剂（内蒙古农业大学肉品微生物实验室储存的植物乳杆菌）和复配发酵剂（3内蒙古农业大学肉品微生物实验室储存的植物乳杆菌+1肉葡萄球菌为混合发酵剂）的实验室自制羊肉发酵香肠在发酵过程中生物胺含量的变化，并得出不同发酵剂对Β-苯乙胺、腐胺、尸胺、酪胺的影响结论。

关键字：羊肉发酵香肠，生物胺，发酵剂，高效液相色谱法

Abstract

In fermented foods such as fermented sausages, yogurt, pickles and wines, mostly containing biogenic amines. Amines have important physiological functions in living cells, but may cause headaches, respiratory disorders, heart palpitations, blood pressure changes and other allergic reactions when the human body absorbs too much In addition, the precursor of biogenic amines or nitrosamines, which have carcinogenic effects, fermented sausage Wandekerckhove reported in the aging and mold mature type, the content of biogenic amines can reach 100mg/Kg, sometimes even up to 1000mg/Kg[1], therefore, in recent years, biological amine content in fermented food problems aroused people's attention in this paper, using high performance liquid chromatography monitoring with single fermentation agent (Lactobacillus plantarum storage meat Microbiology Laboratory of Inner Mongolia Agricultural University) and mixed fermentation agent (lactobacillusplantarum storage 3 Inner Mongolia Agricultural University Laboratory of Microbiology +1 meat meat Staphylococcus as mixed starter) change of home-made fermented mutton sausage in the fermentation process of biogenic amines content, and the influence of different fermentation agent on beta phenylethylamine, putrescine, cadaverine, tyramine conclusion.

Keywords: Mutton fermented sausage, biogenic amine, starter, HPLC

目 录

摘 要 ............................................................ 1 Abstract ............................................................ 2 1 引言 .............................................................. 4 2 生物胺 ............................................................ 5

2.1 生物胺的概念 ................................................ 5 2.2 生物胺的种类 ................................................ 5 2.3 生物胺产生条 ................................................ 5 2.4 生物胺的危害和来源 .......................................... 5 3．发酵香肠 ......................................................... 6

3.1羊肉发酵香肠中生物胺的产生 ................................... 6 3.2发酵香肠中生物胺的种类 ....................................... 6 4.试验材料 .......................................................... 7

4.1 材料 ........................................................ 7

4.1.1 主要原辅材料 ........................................... 7 4.1.2 发酵剂 ................................................. 7 4.1.3 发酵香肠的加工配方 ..................................... 7 4.2 发酵香肠加工工艺流程 ........................................ 7 4.3 发酵香肠加工工艺条件 ........................................ 8 5 试验方法（高效液相色谱法） ........................................ 8

5.1 高效液相色谱法的分析原理和特点 .............................. 8

5.1.1 高效液相色谱法的分析原理 ............................... 8 5.1.2 高效液相色谱法的特点 ................................... 9 5.2 高效液相色谱仪 .............................................. 9 6 高效液相色谱法测定羊肉发酵香肠中生物胺含量 ........................ 9

6.1试剂及药品 ................................................... 9 6.2 主要仪器，设备 ............................................. 10 6.3实验原理 .................................................... 11 6.4试验方法 .................................................... 11

6.4.1 试验设计 .............................................. 11 6.4.2 生物胺含量的测定 ...................................... 11

7 结果统计 ......................................................... 14 8 结果分析 ......................................................... 14

8.1 Β-苯乙胺 .................................................. 14 8.2 腐胺 ....................................................... 16 8.3 尸胺 ....................................................... 17 8.4 酪胺 ....................................................... 19 参 考 文 献 ..................................................... 21 致 谢 ........................................................... 22 附录 ............................................................... 23

1 引言

发酵香肠中生物胺是由氨基酸脱羧产生的，因为生产发酵香肠所使用的乳酸菌如乳杆菌、片球菌和微球菌等的大多数菌株具有对氨基酸脱羧能力，因而能够在发酵香肠中产生生物胺，发酵剂是影响发酵香肠中生物胺含量和种类的重要因素。发酵过程对产品中生物胺含量的影响极其复杂，不同菌种可能造成不同生物胺的累积，同时也可能与原料中微生物产生的残余脱羧酶活性有关。本研究采用了传统的发酵香肠制作工艺，发酵剂选取单一乳酸菌和乳酸菌及葡萄球菌的复合发酵剂，应用高效液相色谱法测定羊肉发酵香肠在发酵过程中生物胺含量的变化，最终得出结论。

2 生物胺

2.1 生物胺的概念

生物胺是一类含氮的脂肪族、芳香族或杂环类低分子化合物，是生物活性细胞必不可少的组成成分，若在体内积累到一定程度时便会产生毒性，如可引起心律增加、偏头疼、低血压等症状【2】 2.2 生物胺的种类

根据结构可以把生物胺分成3类： （1）脂肪族：腐胺、尸胺、精胺、亚精胺等 （2）芳香族：酪胺、苯乙胺等 \（3）杂环族：组胺、色胺等

腐胺、精胺、亚精胺和尸胺等是生物活性细胞必不可少的组成部分，在调节核酸与蛋白质的合成及生物膜稳定性方面起着重要作用。部分重要生物胺的前体物质主要有：

组氨酸—组胺 酪氨酸— 酪胺 色氨酸—色胺 赖氨酸—尸胺

精胺酸—精胺、亚精胺 鸟氨酸—腐胺 2.3 生物胺产生条件：

（1）可做生物胺前体物质的游离氨基酸存在； （2）有发生脱羧反应的条件； （3）适宜微生物生长的环境。 2.4 生物胺的危害和来源

在人和动物机体细胞中，适当含量的生物胺（组胺、色胺、精胺、尸胺等）在调节生长，增强代谢活力、控制血压、消除自由基等方面具有显著作用；酪胺和组胺在人和动物激素介导、多巴胺和羟色胺在中枢神经系统传递方面也具有重

要作用[3]。

通常人们摄入的食品中所含的少量生物胺不会对人体产生影响，而当生物胺积累到一定浓度时便具有潜在毒性作用，如色胺和Β-苯乙胺可导致特定病人的高血压和偏头痛，组胺可导致食源性中毒，造成腹部痉挛、呕吐和腹泻等症状

[4-5]

，亚硝胺作为一种强烈的致癌物也可以由一些生物胺和亚硝酸盐反应生成。 生物胺广泛存在与各类食品中，在富含蛋白质和氨基酸的食品中相对更多，

如乳酪及奶制品，鱼、肉及其制品，巧克力、酒及各类发酵制品和水果、蔬菜等，特别是鱼类及其制品，乳酪、肉制品和发酵类食品。生物胺的产生依据单胺和多胺而存在一定的差别其中单胺可由对应的氨基酸在脱羧酶作用下产生，二胺可由二胺反应而得。食品中存在一定的氨基酸，在储藏和加工过程中部分蛋白质也会分解成氨基酸，当食品被细菌污染后，游离的氨基酸在细菌脱羧酶的作用下产生相应的生物胺，如组氨酸脱羧后产生组胺，赖氨酸脱羧后产生尸胺，腐胺可由谷氨酸、精氨酸和鲱精胺产生。同时，生物胺的含量可以作为食品受污染的的程度及新鲜度的指标。

3．发酵香肠

发酵香肠是采用正常屠宰的牛、羊、猪等畜肉，绞碎后同糖、盐、发酵剂和香辛料等混合后灌入肠衣，经过微生物对碳水化合物、蛋白质、脂肪等底物的分解、降解等作用而制成的具有发酵香味的肉制品[6]。 3.1羊肉发酵香肠中生物胺的产生

生物胺除存在于各种动植物的组织中外，在食品中也普遍存在，尤其是蛋白质含量丰富的食品。除具有生理功能的多胺外，食品中的生物胺主要出微生物产生的脱羧酶催化氨基酸脱羧而产生。它的产生需要3个条件，即能分泌氨基酸脱羧酶的微生物的存在；生物胺前体物质(氨基酸)的存在；以及适宜这些微生物生长和分泌氨基酸脱羧酶的环境条件。 3.2发酵香肠中生物胺的种类

发酵香肠中常见的生物胺有酪胺、组胺、腐胺、尸胺、苯乙胺和色胺，它们由相应的氮基酸前体酪氨酸、组氨酸、鸟氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸和色氨酸经脱羧作用产生。其中以酪胺在干发酵香肠中的含最最高。据研究资料报道，酪胺在某些干发酵番肠中的最高含量可达600mg／Kg以上，平均值也高达20mg／Kg。因

此，虽然酪胺的相对毒性要小于腐胺、尸胺，但其在发酵香肠中的危害性更大。

4.试验材料

4.1 材料

4.1.1 主要原辅材料

原料肉：羊后腿肉和羊尾肥膘，内蒙古呼和浩特市； 肠衣：市售直径30~32mm的天然猪肠衣；

调味料：黑胡椒粉、孜然、食盐，蔗糖、葡萄糖、抗坏血酸、硝酸钠、亚硝酸钠均为分析纯药品；

2-苯乙胺、腐胺、尸胺、酪胺、单磺酰氯、1,7-二氨基庚烷等标准品：Sigma公司；

甲醇、正己烷和丙酮均为色谱纯药品。 4.1.2 发酵剂

单一发酵剂：内蒙古农业大学肉品微生物实验室储存的植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)；

复配发酵剂：内蒙古农业大学肉品微生物实验室储存的植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)和肉葡萄球菌(Staphylococcus carnosus)为混合发酵剂(3:1).

4.1.3 发酵香肠的加工配方

羊尾肥膘20%、羊后腿肉80%、食盐2.5%、蔗糖0.5%、葡萄糖0.5%、硝酸钠100 mg/kg、亚硝酸钠70 mg/kg、黑胡椒粉0.5%、孜然粉0.5%、抗坏血酸0.05%、发酵剂107 cfu/g。

4.2 发酵香肠加工工艺流程

加入发酵剂腌制剂搅拌制馅 瘦肉切碎，肥肉切丁原料肉

干燥

腌制 灌肠 排气

发酵

成品

成熟

4.3 发酵香肠加工工艺条件

工艺条件见表1

表1 发酵香肠加工工艺条件

加工阶段 腌制 发酵 干燥 成熟

温度（℃） 0—4 24—25 14—15 13—14

时间（h） 12—15 70—72 70—72 70—72

相对湿度（%） 98 85 75 70

5 试验方法（高效液相色谱法）

高效液相色谱又称高压液相色谱、高速液相色谱、高分离度液相色谱，是20世纪60年代末70年代初发展起来的一种新型分离分析技术，随着不断的改进与发展，目前已成为应用极为广泛的化学分离分析的重要手段[7]。它是在经典液相色谱的基础上，引入了气象色谱的理论，在技术上采用了高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器，因而具备速度快、效率高、灵敏度高、操作自动化的特点。 5.1 高效液相色谱法的分析原理和特点 5.1.1 高效液相色谱法的分析原理

高效液相色谱法是在经典液相色谱法基础上发展起来的。高效液相色谱法是在高压条件下溶质在固定相和流动相之间进行的一种连续多次交换的过程，它借助溶质在两相之间分配系数、亲和力、吸附力或分子大小的不同引起排阻作用的差别是不同溶质得以分离[8]。

5.1.2 高效液相色谱法的特点

从分离原理上讲，高效液相色谱法和经典液相色谱法没有本质的差别，但由于它采用了新型高压输液泵、高灵敏度检测器和高效微粒固定相，因而使经典的液相色谱法焕发出新的活力。经过近30年的发展，现在高效液相色谱法在分析速度、分离效能、检测灵敏度和操作自动化方面都达到了与气象色谱相媲美的程度，并保存了经典高效液相色谱对样品适用范围广、可供选择的流动相种类多和便于制备色谱的优点。其优点概括如下：采用高效微粒固定相使色谱分离效能大大提高；采用新型高压输液泵是分离时间大大缩短；使用高灵敏度的检测器使仪器的检测灵敏度大大提高；由于PHLC具有高柱效、流动相可以控制和善于分离过程的特点，故其选择性高[9]。 5.2 高效液相色谱仪

高效液相色谱仪的主要部件有：贮液罐、高压输液泵、进样器、色谱柱、检测器、记录仪和数据处理装置。其基本工作流程是：贮液罐中的流动相被高压泵打入系统，样品溶液经进样器进入流动相，被流动相载入色谱柱内，由于色谱柱内的各组分在两相中具有不同的分配系数，在两相中相对运动时，经过反复多次的吸附-解吸的分配过程，各组分在移动速度上产生较大的差别，被分离成单个组分依次从柱内流出，通过检测器时，样品浓度被转换成电信号传送到记录仪，数据以图谱形式打印出来，如下图就是本实验检测使用的高效液相色谱仪。

6 高效液相色谱法测定羊肉发酵香肠中生物胺含量

6.1试剂及药品

试剂与药品见表2。

表2 试剂与药品

药品名称

组胺，酪胺,色胺,2-苯乙胺，单磺酰氯, 1,7二氨基庚烷 甲醇 正己烷 丙酮

色谱纯 色谱级 色谱纯

上海星科生化有限公司 天津市光复精细化工研究所 上海星科生化有限公司

药品级别

购买厂家 均购自SIGMA

无水乙醚 正丁醇 三氯甲烷 NaOH

分析纯 分析纯 分析纯 分析纯

国药集团化学试剂有限公司 天津市风船化学试剂科技有限公司

国药集团化学试剂有限公司 天津市风船化学试剂科技有限公司

NaHCO3 盐酸

三氯乙酸（TCA） 氯化钠 乙醚：重蒸

分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯

天津市科盟化工工贸有限公司 天津市化学试剂三厂

国药集团化学试剂有限公司 天津市化学试剂三厂

谷氨酸钠 分析纯 氯化钠 三氯乙酸 组胺盐酸盐 Β-苯丙乙胺标准品 酪胺盐酸盐标准品 腐胺标准品 尸胺标准品 色胺标准品 亚精胺标准品 精胺标准品

7-二氨基庚烷内标标准品 丹磺酰氯标准品 磺酰氯衍生剂溶液

分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯

6.2 主要仪器，设备

仪器，设备称见表3。

表3 仪器，设备

仪器，设备名称

生产厂家

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