WB试验常见问题解答

[1] 各位朋友：请教关于SDS-PAGE的问题。

我的配胶体系如下： 15%分离胶 4%浓缩胶 水 2.3ml 2.7ml

30%丙烯酰胺 5.0ml 0.67ml Tris-HCL PH8.8 2.5ml PH6.8 0.5ml 10%SDS 0.1ml 0.04ml 10%APS 0.1ml 0.04ml TEMED 0.004ml 0.004ml

我的蛋白分子量是11kd，浓缩胶60V,40min，分离胶90V，70min。跑胶时总是跑不直，呈抛物线型，请问是什么原因？我的试剂都是新配置的。谢谢！！！ 答：【1】胶的配制方法；

配制不同体积15%胶 SDS-PAGE分离胶所需各成分的体积(毫升) 15%胶 (毫升) ： 5 －－ 10 －－15－－ 20－－ 30－－ 50 蒸馏水 ： 0.5 －－ 1.0－－ 1.5 －－ 2.0 －－ 3.0 －－5.0

30?r-Bis(29:1)： 2.5 －－ 5.0 －－ 7.5 －－ 10.0 －－ 15.0－－ 25.0 1M Tris, pH8.8： 1.9－－ 3.8 －－ 5.7－－ 7.6－－ 11.4 －－ 19.0 10%SDS ：0.05－－ 0.1－－ 0.15 －－ 0.2－－ 0.3－－ 0.5 10%过硫酸铵： 0.05 －－ 0.1 －－0.15－－ 0.2 －－ 0.3 －－ 0.5 TEMED： 0.002－－ 0.004 －－ 0.006 －－ 0.008 －－ 0.012 －－ 0.02

配制不同体积4%胶 SDS-PAGE浓缩胶所需各成分的体积(毫升) 4％浓缩胶（两块胶，5ml） 超纯水 ： 3.16ml

40％Acr/Bic（37.5：1） ： 0.5ml

0.5 mol/L Tris?HCl（pH6.8） ： 1.26ml 10％SDS ： 50 微升?

微升?10%AP（过硫酸胺） ： 25 TEMED ： 5 微升?

加TEMED后，立即混匀即可灌胶。

【2】注意玻璃板一定要洗干净，这一点比较重要。如果玻璃板洗不干净，很容易造成楼主所说的现象。

【3】注意电泳液不要出问题（是否过期了，是否把转移液当成电泳液了？），电泳液如果出问题，也会造成楼主所说的现象。

[2] pvdf膜到底能不能用丽春红染色来查看蛋白是否转上去 ？

我转过很多次了，都没有看到过丽春红显色。但是有看到有人说能染上，是在是不知道，请教给

位大大了

答：【1】PVDF膜肯定可以用丽春红染色的。我们这里的很多人基本上用 的都是PVDF膜，染膜用的都是丽春红。大多数时候都能染出条带的。 【2】下面是丽春红的配方：

10X丽春红染液 丽春红S 2g 三氯乙酸 30g 磺基水杨酸 30g 蒸馏水至 100ml 使用时将其稀释10倍。

当然现在有很多公司直接卖配好的丽春红，因为其可以回收重复利用，所以可以买配好的丽春红。下面是一份丽春红的说明书：

1.将PVDF膜、硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜浸没在丽春红染色液中，摇动3-5分钟或更长时间，直至出现清晰条带。对结果作适当 记录。

2.用蒸馏水，PBS或其它适当溶液漂洗2-3次，每次3-5分钟，去除丽春红，进行后续的Western检测。

从使用说明中，我们可以看出，PVDF膜是可以用丽春红染色的。

【3】我的染色方法是：转膜完成后，取出膜在甲醇里泡1分钟，然后在双蒸水中过一下，放入丽春红里染色，室温，摇床上，时间是5－30分钟。然后把染好的膜放到双蒸水中洗一下，不要洗的太久，把表面的丽春红洗掉就可以了。这时就可以看到红色的蛋白条带了。然后把膜放在TBST中，室温，摇床上洗3次，每次10分钟。然后就可以往下做了。

【4】丽春红的染色敏感性和ECL敏感性差的很远呢。也就是说，及时丽春红染色染不出来，ECL 也有可能曝光曝出来的。

【5】感觉丽春红染色效果不是很好的，有时候清楚，有时候也不是很清楚。而且染色后再往下做后面的结果会收到一定的影响。所以，如果熟练了，后面就可以不染色了。也可以上样的时候都上两个孔的样，转膜后把这两个孔对应的膜剪下来染色，如果染上了，说明其他的也会染上的。

[3] 我做WB，曾跑出过条带，就是有非特异性条带，准备摸一抗和二抗浓度，但后来就什么条带都显不出来了，就算换成有条带时的浓度，条件也没变，就是做不出来，转膜后膜上能清晰看见预染的彩虹marker，但用丽春红染膜，却没明显的蛋白条带，就能看见泳道，请教实验室其它人，就说是我转膜弥散，求助个位大侠，我该怎么做？ 说说我的wb条件：蛋白大小：50kd 5％积层胶，10％分离胶 电泳先100v，后180v

转膜条件：冰水中恒压100v 1h 湿转（在转时电流在200—400ma变，先小，后大，还有就是转移缓冲液在转时会冒好多泡泡），我用的是NC膜，滤纸两边个四层

答：【1】转膜的时候最好用衡流，试一下380毫安，半小时。转移液注意最好现配先用，不要用很多次，这很重要，我一般应用不超过两次。

【2】转膜的时候，夹胶和膜的夹子的松紧要适中，可以通过调节滤纸的张数来控制夹子的松紧。 【3】电泳的电压太大，减小电泳的电压。可以先用80伏20分钟，然后120伏。也可以一直用80伏。也可以先用60伏，然后80伏。 【4】可以适当增加曝光时间试一下。

[4]目的蛋白不表达。的leilaliu wrote:

这是我的操作步骤：取0.1g 组织，加1ml裂解液（1 mol/l tris.hcl 2.5ml ,NaCl 0.438g, TritonX-100 0.5ml, 蒸馏水至50ml，使用时加了100ug/ml的PMSF)，机械匀浆2分钟，冰上裂解30分钟，然后14000g 10分钟离心，取上清液。取20ug上样量，然后80V浓缩胶，130V分离胶，然后80V，180mA转膜2个小时，然后5%封闭一个小时，室温。然后一抗1：500（5%脱脂奶粉加TBST里面）孵育一个晚上，TBST清洗3次，每次10分钟。然后二抗1：2000处理方式同一抗，孵育时间为1个小时，室温，TBST清洗3次，每次10分钟。再用ECL 处理等等。

但是，我的目的蛋白：CaMKIIa总是做不出来。狂哭。分子量是50KD。

答：【1】上样量一般是20－100微克，你的上样量是20微克，你的条带很弱或者出不来，为什么不加大上样量呢？可以加到100微克左右呀（这点其实挺重要的）。

【2】你说：“80V，180mA转膜2个小时”。一般转膜的时候只能衡流或者衡压吧，怎么你的电流电压都是恒定的呢？转膜感觉还是衡流好。我一般用380毫安湿转30分钟。当然转膜很多条件都是可以的。

【3】一抗孵育最好在摇床上，一抗孵育后，TBST清洗3次，每次5分钟就可以了。 【4】可以适当增加曝光时间。蛋白不 [的蛋【】]【打飞人头儿就可突破

[5] 各位好，我现在遇到的问题是，立春红显色后效果很好（师姐和实验老师都这么认为），虽

然不知道蛋白条带（45KD）的具体位置，但是比对Marker还是可以感觉到那部分的条带很清晰的。但是我始终做不出结果，现把步棸详解如下，希望大家帮我分析一下： 1，封闭（5％的脱脂奶粉）一小时，室温下摇床上进行。 2，TBS/T洗膜3次，每次5分钟。用滤纸去尽残液。

3，孵育一抗（cell signaling，单克隆抗体），比例是1:1000(说明书上标示)。先室温摇床上1小

时，再放在4度冰箱过夜。

4，TBS/T洗膜3次，每次5分钟。用滤纸去尽残液。

5，孵育二抗（博士德），比例是1：5000（我用的说明书上的最大标示）。室温摇床2小时。 6，TBS/T洗膜3次，每次5分钟。用滤纸去尽残液。 7，加入pierce显色试剂（按说明书要求进行）。

8，曝光5分钟，显影（至今为出现目的条带），定影。（把膜拿到暗室观察什么都没有，只有一些荧光液的残留痕迹，成隐约大片状，多出现于膜的边缘处，绝对不成条带状。） 答：【1】细节决定成败！

【2】你说你的显色液都是荧光了。我估计你每次做完了，显色用的器具都不洗吧？其实很多人都不在意，这点其实很重要的，就是凡是和膜接触的东西都要干净，要洗的很干净，当然夹膜用的镊子更是要干净。

【3】整个显色曝光都应该在暗室里呀。你放外面显色干什么呀？这是一个连续的过程，没必要分开吧，感觉分开反而跟浪费时间呀。

【4】具体问题具体分析。显色的时间不是固定的，如果膜放到显色液里，荧光很强，迅速拿出，放到保鲜膜上，然后曝光就可以了。如果膜放到显色液里，荧光很弱，可以多放一会，其实不用放很长时间也是可以的。可以把膜放到保鲜膜上，因为保鲜膜上会粘有显色液的，在保鲜膜上照样可以进行显色反应的。如果膜很亮（就是说荧光很强），曝光时间可以很短的，如果荧光很弱或者看不到荧光，可以曝光很长时间的。如果荧光很强，我会曝光最短的时间，也就是说，把曝光盒（压片暗盒）盖上然后用最快的速度打开就可以了，如果荧光弱的话，我就用黑塑料袋把曝光盒装起来然后放入抽屉，去吃饭或者干其他事情，回来继续显影定影，条带照样很清楚的，哈，有时候那是相当的清楚。

【5】我把你的步骤改了一下。供参考。

1，封闭（5％的脱脂奶粉）4小时，室温下摇床上进行。（说明：封闭是很重要的一步，这步应该多话时间。一般来说，2小时也可以的，但是1小时有些短了）。 2。此步删掉。

3，孵育一抗（cell signaling，单克隆抗体），一抗用5％的脱脂奶粉稀释，比例是1:1000(说明书上标示)。放在4度冰箱过夜。（一抗孵育不是时间越长越好，应该适度，如果越长越好，那直接在室温或者在37度放一夜不是更好。一抗用5％的脱脂奶粉稀释效果远好于用TBST等稀释，这是我的亲身经历。封闭过后不用洗脱。）

4，TBS/T洗膜3次，每次5分钟，摇床上。（可以不用滤纸吸，直接放入二抗孵育）。 5，孵育二抗（博士德），比例是1：5000（我用的说明书上的最大标示）。室温摇床1小时（二抗1小时足够了）。

6，TBS/T洗膜3次，每次10分钟。（可以不用滤纸吸）。 7，加入pierce显色试剂（按说明书要求进行）。

8，曝光5分钟（曝光时间可以按实际情况的不同而不同），显影（至今为出现目的条带），定影。（把膜拿到暗室观察什么都没有，只有一些荧光液的残留痕迹，成隐约大片状，多出现于膜的边缘处，绝对不成条带状。）

[6] 本人在做一个18KD蛋白的wb，转膜后预染marker各个条带都可见，不知道就是目的条带都不能曝光出来。内参的B-actin条带清晰，背景也没有。 想请教各位大侠：

1.胞浆蛋白的提取是不是有什么特殊要求。有什么提取方法比较好！ 2.18kd蛋白的转膜甲醇的浓度是不是要比较高。 3.其他。。。

希望能够有好的回答，最好能提供好的参考文献。谢谢！

答：【1】你转膜后预染marker各个条带都可见，说明转膜没有问题。 【2】感觉还是用试剂盒好一些。 【3】可以适当减少电泳的时间。

【4】测过蛋白浓度吗？蛋白浓度是多少呀？如果蛋白浓度不是很高，上样量不是很大的话，可以增加上样量，增加蛋白浓度。

【5】增加一抗浓度，增加一抗孵育时间。 【6】增加显色时间。

【7】增加曝光时间，可以曝光很长时间的。

【8】当然是0.2μm的膜好一些，但是18KD的蛋白用0.45的膜也可以的。注意转膜时间不要太长。

[7]请问有人做过19KD的蛋白吗？已经做了一段时间了，可是还是没有什么起色啊。现在跑胶倒是已经可以了。但是转膜后染色看不到我要的条带啊。那条带在胶上就是很淡的，但是基本能看到。可是转膜后就真的什么都看不到了似的。有没有什么办法可以成功将量少的蛋白条带转膜啊（可以肯定的说我的转膜条件没有将我所需要的条带转过）。谢谢了。 答：【1】没有问题，继续往下做就可以了。

【2】很多人都在考马斯兰染色的胶上或者在丽春红染色的膜上找自己的目的条带，看到一个条带就说是自己的目的条带。其实真的是自己的目的条带的可能性很小。组织蛋白或者细胞蛋白中含有很多种蛋白的，所以碰巧是目的蛋白的可能性是很小的（尽管从预染MARKER知道分子量是相近的）。我们染胶或者染膜的目的并不是看自己的目的蛋白是否在胶上或者是否转到了膜上。而是看胶上是否有蛋白，是否有比较清楚的蛋白条带。染膜就是看蛋白是否转到了膜上。通过整体的蛋白的情况来推测自己的目的蛋白的情况。并不是非要找出自己的目的蛋白。

【3】要知道ECL的敏感性要比丽春红强很多的，也就是说比丽春红敏感很多倍的，染色染不出的蛋白，显色或者曝光照样可以出条带的。

【4】你的膜上都看到了蛋白，说明整体上还是可以的，可以继续往下做。

【2】你的上样量是多少呀？如果胶上没有条带最大的可能就是上样量不够。蛋白浓度是多少？最好都测一下，因为最大的可能就是蛋白的浓度不够。

【3】蛋白放置过久，裂解液没有放蛋白酶抑制剂都会导致蛋白浓度不够。

【4】如果用的细胞的话，细胞浓度过小，提取细胞时没有提取好都会导致蛋白浓度过小。

【32】sigma的HA抗体，现在做WB杂带不少，背景也很深，请教达人们：如何摸索一抗二抗的稀释倍数呢？

答：【1】抗体的说明上，都给出了一个范围，可以以这个范围为根据摸索。开始的时候可以把膜剪成几小块，每一块用不同的一抗二抗浓度，这样就可以比较快的摸出适宜的浓度。有些时候也有一定的经验的：我用的是SANTA CRUZ的抗体，一抗建议的稀释比是1：200－1000，我用的是1：400效果挺好的。周围的人用的这个公司的其他一抗也是建议这个稀释比，他们也是稀释成了1：400，效果也挺好的。所以，如果用的是这个公司的一抗，如果建议的稀释比和上面相同的话，建议先用1：400试一下。

【2】如果背景深，考虑二抗浓度高了，可以降低二抗浓度。当然没封闭好等很多其他原因也可以引起背景过高。

【3】如果杂带较多，可以考虑降低一抗的浓度。如果没有条带，则可以考虑增加一抗的浓度。

【4】当然，在摸索抗体浓度的同时，要保证其他步骤的完善、合理性：转膜成功、封闭的要好、上样量是否合理（不要太大了）等。

【33】今天用新买的抗体做了一下WB 我的蛋白是33KD 具体步骤如下，电泳80V 30分钟,120V 60分钟 转膜 湿转 0.2A 1 小时

封闭 37度 2小时 5%脱脂奶粉

一抗 Sant cruz的抗体 建议范围是1;200----1:1000 我用的是1：400的稀释 室温摇床上3小时 4度过夜

TBST 洗涤 10分钟X3次

二抗 建议的范围是1：200---500 我用的是1：350 37度3小时 TBST 洗涤 10分钟X3次

发光液刚加上去，在暗室里就看到膜上是一片荧光啊 根本不敢曝光了

不知问题处在哪里了 我自己怀疑是二抗的浓度太高了，也可能是二抗孵育过后洗涤膜的时候没有洗干净，可是可能性不大，要是没洗干净不会整块膜上都是荧光的吧，打算明天点膜试试看 请高手指教！！

答：【1】转膜应该没问题吧？膜上能保证有蛋白条带吧？

【2】建议延长封闭时间，可以室温4小时，奶粉一定要溶好，要完全溶解，没有沉淀。 【3】一抗一般4度过夜就可以了，不是越长越好。一抗最好用5％的脱脂奶粉稀释。 【4】减少二抗孵育的时间，一般室温1小时就可以了。37度的话，一般30分钟就可以了。适当降低二抗的浓度。

【5】你的二抗是进口分装的，不知道是分装的什么公司的。我的二抗是Sant cruz公司的，它建议的范围是：1：2000－100000（1：2千到10万），范围的跨度比较大。建议你可以把膜剪开，剪成几段，然后用不同的二抗稀释浓度，摸一下二抗的适宜浓度。建议用1：500。1：1000，1：2000都试一下。

【6】TBST 洗涤时用的器具要干净。这一点也挺重要的。

【7】减少上样量或者降低蛋白浓度，这也是挺重要的一步。不知道你的上样量和蛋白浓度时多少。

【34】我用的是Bio-rad的垂直电泳仪，短玻璃板约7cm高，8cm宽，我的梳子是12齿的，做出的孔，最多加25ul的样，如果我用中瓶养细胞，长满了就收，几瓶细胞裂出的蛋白，才够一个上样孔用的呀？25ul里要含多少蛋白才合适？ 答：【1】这要看你养细胞的水平和提取细胞的水平。

【2】我用的是50毫升的培养瓶（中等的培养瓶），我先把细胞用消化液消化下来，用PBS清洗，离心后倒掉上清液，然后我加入50微升的裂解液，提出大约60微升左右的蛋白（因为清除上清液的时候，会有少量液体的残留，所以加上50微升的裂解液共60微升左右）。我测了一下浓度，大约在3－4微克/微升（毫克/毫升）。我每孔上样20微升，一般能用三次左右（就是说一瓶的细胞够用3次，也就是说一瓶提取的蛋白可以放到3个孔里）。不过我培养瓶内的细胞密度一般比较大，我是用消化液提取的细胞，比用细胞刮子提取的细胞要多。一般提蛋白的话，可能要小于我的。

【3】一般每孔上样量（你的是25微升）要含蛋白20－30微克就可以了。如果提取的蛋白含的目的蛋白较少的话，可以含蛋白100微克。也就是说可以含蛋白20－100微克。根据你的具体情况定。

【35】我用的是Santa Cruz的抗体，用2％的BSA封闭，一抗1：500用含1％BSA的TBST稀释，二抗1：2000用含1％BSA的TBST稀释，结果什么都没有？请问各位高手怎么办? 答：既然你以前做出来过，整体上应该是没有问题了，估计问题出在细节上了。

【1】什么东西都有一个度，不是越长越好的。一抗4度过夜已经足够了，没有必要再室温一小时的。

【2】我以前也出现过你的这种情况。哈，荧光条带比较明显（但不是很漂亮），但曝光总是马马虎虎的。后来的改进方法其实说出来挺可笑的。就是封闭用的，TBST洗用的器具（我用的是培养皿）都要非常认真的清洗，而且每次都要换新的（清洗过没用过的）培养皿。曝光用的桌子，保鲜膜都保持很干净。枪头都是高压过的。总之，从转膜完成后的膜接触过的东西，都要保持干净，应该说是非常的干净的。所以我的培养皿是非常多的，用完了，就用洗涤精洗干净，然后用自来水冲干净，放入恒温干燥箱内。如果用TBST冲洗的话，先用TBST冲洗一遍，然后再用。感觉这一点很重要。还有就是不要把包有膜的保鲜膜放到金属器具（比如金属桌子）上，金属会导致荧光淬灭的。

【3】抗体的浓度要摸一下，这也挺重要的。一般进口的一抗，如果建议稀释比例是1：200－1000的话，一般用1：400差不多，效果一般挺好的。

【4】如果放入ECL 中没有荧光可以适当然长在里面的时间，有时候过一会就可能看到荧光了。放置的时间较长的话，即使出来荧光，曝光的话，也挺难出现非常漂亮的条带。但是这可以告诉我们，做法是对的，适当提高一抗的浓度或者增加蛋白浓度一般会有较好的效果。

【36】我用的是Santa Cruz的抗体，用2％的BSA封闭，一抗1：500用含1％BSA的TBST稀释，二抗1：2000用含1％BSA的TBST稀释，结果什么都没有？请问各位高手怎么办? 答：既然你以前做出来过，整体上应该是没有问题了，估计问题出在细节上了。

【1】什么东西都有一个度，不是越长越好的。一抗4度过夜已经足够了，没有必要再室温一小时的。

【2】我以前也出现过你的这种情况。哈，荧光条带比较明显（但不是很漂亮），但曝光总是马马虎虎的。后来的改进方法其实说出来挺可笑的。就是封闭用的，TBST洗用的器具（我用的是培养皿）都要非常认真的清洗，而且每次都要换新的（清洗过没用过的）培养皿。曝光用的桌子，保鲜膜都保持很干净。枪头都是高压过的。总之，从转膜完成后的膜接触过的东西，都要保持干净，应该说是非常的干净的。所以我的培养皿是非常多的，用完了，就用洗涤精洗干净，然后用自来水冲干净，放入恒温干燥箱内。如果用TBST冲洗的话，先用TBST冲洗一遍，然后再用。感觉这一点很重要。还有就是不要把包有膜的保鲜膜放到金属器具（比如金属桌子）上，金属会导致荧光淬灭的。

【3】抗体的浓度要摸一下，这也挺重要的。一般进口的一抗，如果建议稀释比例是1：200－1000的话，一般用1：400差不多，效果一般挺好的。

【4】如果放入ECL 中没有荧光可以适当然长在里面的时间，有时候过一会就可能看到荧光了。放置的时间较长的话，即使出来荧光，曝光的话，也挺难出现非常漂亮的条带。但是这可以告诉

我们，做法是对的，适当提高一抗的浓度或者增加蛋白浓度一般会有较好的效果。

【37】我用0441的marker,湿转，2个小时，电压100伏，正负极没有放反，没有短路，电转液也试着更换新配的，但是就是转不上去。愁死了！！！！2个小时后，marker还在胶上，就跟没转似的，我要疯了！！！！！求有经验的指导啊！！！！ 答：这样的情况不多，一般不会一点也转不过去的。

【1】转移的时候有放冰袋或者冰降温吗？如果没有，转移完后，转移液应该是有比较明显的温度升高，即使放了冰袋或者冰，转完后电转液的温度也会有一定的升高（可以用手摸一下转移液，很容易摸出是否有温度的升高），如果转完后没有温度升高（和初始的转移液温度相同），说明根本就没有有效的转移。可能是转移槽的盖子没盖紧，电源没接上，转移槽支架上的金属丝断了，或者某个地方的电线接触不好。请注意这一点，感觉转移完成后，转移液的温度并没有升高的可能性比较大，如果这样，转不过去的原因就如上述。感觉问题在此点的可能性比较大。 【2】电转液（转移液）是怎么配制的？我用的是如下配方，尽管配方并不都是相同的，但应该还是差不多的，看一下，是不是电转液有问题。

转移缓冲液（48mmol/L Tris，39mmol/L甘氨酸，0.037％ SDS，20％甲醇） 甘氨酸（MW75.07） 2.9g Tris（MW121.14） 5.8g SDS 0.37g 甲醇 200ml 蒸馏水至 1000ml

溶解后室温保存，次溶液可重复使用3～5次。

上面是1×的，配制时可以配成10×的，然后应用时再稀释成1×的。 【3】转膜一般还是用衡流好一些，所以最好不要用衡压，而用衡流。

【4】即使胶和膜的位置放反了，或者夹膜的夹子黑面和白面放反了，胶上的蛋白也会转走的，转不到膜上，也会转到其他地方的，而不会在胶上的。

【38】做WB几个月了，一直不成功，很郁闷，请各位战友帮忙分析一下问题出在哪了，先在这里谢过！！

我做的目的蛋白有两个，分子量分别为28KD和57KD，内参是action，分子量42KD，使用蓝色预染蛋白Marker，跑胶结束后可以看到Marker条带，基本与说明书上的图示吻合，用考蓝G250染色，可以看到Marker以及蛋白样本的条带。

重新跑胶后转膜，半干转0.65mA/cm2，2小时，可以看到PVDF膜上的Marker条带，不是很清晰（个人考虑与上样量有关，5微升），丽春红染色未见条带，封闭2小时，一抗（1：500）孵育，室温2小时或更长时间，洗膜3次，每次10分钟，同法二抗（1：1000）孵育、洗膜后显影。

压片5分钟到30分钟都用过，暗室中看不到条带荧光，显影、定影后也是白板一块，没有一点痕迹。

（用孵育后的二抗稀释液和发光液直接反应可以看到荧光，觉得可以排除发光液和二抗的问题。） 请各位战友帮我分析一下问题在哪儿，感激不尽！！！

答：【1】ECL的灵敏度远大于丽春红，所以丽春红染色染不出，曝光的时候同样可能曝出来的。 大家说丽春红的敏感性比较低，所以现在已经不做丽春红了，但是曝光还是一片白板，说明前面肯定有比较关键的错误

答：一般做的比较熟练的，或者做的比较成功的这一步可以不做的。象这么长时间结果还没出来，这一步最好做一下。你可以上样时多加几个孔，转膜完成后把这几个孔用剪刀剪下来，去丽春红染色。其他的继续做。

【2】转膜是挺重要的一步，膜先要用甲醇泡，然后用转移液泡。可以先测量一下蛋白浓度，看蛋白浓度是不是合适。

我用的PVDF膜，每次用100%甲醇浸泡10-15分钟，然后转膜液浸泡10-20分钟，是否达到要求？蛋白浓度1-2微克/微升，上样量25微升（胶厚0.75mm，只能上这么多了），上样量是否够？

答：甲醇一般不用泡那么长时间的。一般来说是15秒－20分钟的时间，只要泡透就行了，在甲醇里，膜一般是很容易透的。我都是泡1－2分钟。然后放入转移液，我在转移液中放的时间是比较长的，一般泡1－2小时，就是早早的就把滤纸，海绵，膜等物质放入里面。

上样量一般来说20－30微克就可以了。如果目的蛋白低表达的话，可以把上样量加到100微克。你的是什么蛋白？组织还是细胞？蛋白浓度怎么这么小呀？你最好还是提高一下蛋白浓度。 【3】一般MARKER 要看的很清楚是比较难的。但是仔细辨认应该还是应该能看到的。 Marker每次都比较模糊，有时候条带不全，不知道是转过还是没有转够？

答：预染的MARKER一般来说，所有的条带都很清楚的转到膜上挺难的，但是有一些条带还是应该比较清楚的。其他条带仔细辨认一般也能看的清楚的。

【39】各位前辈请给我指示指示，我在做western blot ,5*电泳缓冲液没了，各位师兄师姐又不在，我就按下面比例配了，但不知道 合适不？tris 15.1g, gly94g, sds5g,加去离子水至1000ml,混匀。用时取了200ml,加去离子水调至终浓度1000ml。还有个问题，为什么电泳液使用时要配成1*的？往蛋白里加的loading buffer终浓度也要调至1*？

答：【1】所谓的1×就是说是应用时应该应用的浓度。所以应用的时候，都应该配成1×的。 【2】配成5×或10×就是为了方便，免得每次都要配的麻烦。

【3】下面是1×电泳液的配制方法，你的是5*的。正好是5倍的关系，你的配方是正确的。 电泳液缓冲液（25mmol/L Tris，0.25mol/L甘氨酸，0.1％ SDS） Tris（MW121.14） 3.03g 甘氨酸（MW75.07） 18.77g SDS 1g

蒸馏水至 1000ml

溶解后室温保存，次溶液可重复使用3～5次。

【40】版上精华区、归档区的帖子我也都看过了。对于western显色荧光淬灭的解释都是蛋白浓度、一抗或者二抗浓度过高的缘故。我也曾试过我二抗浓度降到推荐的最低，可是还是不行。下面我把我的具体情况给大家说一下，希望同仁们多多帮助，不吝赐教！

我是提取细胞裂解液上样，最初的时候因为要检测的蛋白表达量低所以上样60ug，用的的PIERCE的荧光显色，开始1：2000稀释二抗，显色结果很好，荧光也非常亮，非常持久，stripping 3次以后还是能得到持久的荧光显色。但是不知道从什么时候开始，莫明的就出现了荧光很快淬灭的现象。就是加上显色底物以后，荧光就迟也在2分钟内消失。我在版上和PIERCE的说明书上仔细的学习过了，都是说二抗的浓度高，后来我就把二抗降到说明书推荐的1：5000,在暗室中观察加上显色底物荧光非常暗，但还是会很快消失。后来我又把上样时的蛋白总量减半但还是不能解决问题。 我的问题有这么几个：

1. 以前1：2000的二抗浓度，荧光有量又持久，而现在二抗降的再低都不行，这是为什么呢？ 2. 荧光消失以后再补加显色底物，荧光亮一下，消失的更快，而且把底片在膜上一压，荧光就马上淬灭，这又是为什么呢？

3. 我还发现如果一张膜杂一个抗体时淬灭，stripping后杂别的抗体都会淬灭

现在都快疯了，和以前做实验的步骤方法都没有差别，但现在一曝光就淬灭，恳求大家帮帮忙啊！！ 答：很多情况都会导致荧光淬灭，可能每个人的情况并不相同。

【1】用保鲜膜包好的带荧光的膜，千万不要放到金属表面，碰到金属表面，荧光会迅速的淬灭。因为有些桌子是金属的，所以放到上面会导致荧光迅速淬灭。这是亲身经历的。有些战友提到用镊子碰到膜会导致荧光淬灭，可能是因为镊子是金属的缘故。

【2】不注意的时候，把ECL的A和B混合了，以后再用，也会导致荧光淬灭。各溶液使用后，请盖紧瓶盖，以防失效。特别是B液，含有氧化剂，比较容易被还原而失效。

【3】荧光可能对一些物质敏感，导致荧光淬灭。所以，尽量使和荧光接触的物品都是干净的。我以前都是用保鲜包裹膜，然后曝光，但是保鲜膜太薄，容易卷起来，我就用较厚的塑料袋，但是发现荧光一接触塑料袋就迅速淬灭，我估计可能是因为后塑料袋上不干净，有些导致淬灭的物

质。后来继续应用保鲜膜，就没有出现类似情况了。

【4】荧光淬灭和蛋白抗体等也有原因。我以前就碰到过，我的是5个条带，发生淬灭的时候，有快有慢，不是5个条带一起淬灭。尽管后来都淬灭了。所以，估计和蛋白抗体等也有关系，但可能并不是主要的原因。

【41】我因为做western blot 总是没结果，就严格按照cell signa的说明书进行操作，将多抗用5%的BSA稀释成10ml后4度冰箱孵育过夜，但是依然无结果。我将稀释后的 抗体准备重复使用，但是原来未稀释前在-20度时抗体不结冰，现在稀释后则结冰，这样用时反复冻融会不会影响结果。还是抗体在稀释后应放4度保存？ 另外我想问一下这样的抗体一般可用几次。

如果是在室温下孵育的抗体可不可以重复用，上次我用此抗体，连原来做出来的都未出结果。 答：【1】的确有的一抗可以反复应用很多次的，有的用几次就不好用了。主要跟抗体的特性、质量等有关，跟储存等情况也有关。所以，一种一抗稀释液用多长时间，一般只有用了才知道。 【2】当然用一次也可以的，我就是用一次。每次的用量是400微升～1毫升。效果也是很好的。我就是用塑料袋做成小袋子，然后把膜放到里面，然后把一抗稀释液放到里面。然后用封膜机把口封上。这样一抗稀释液就可以把膜全包上了。

【3】二抗也可以这样用，也是很省的，不用重复应用的。

【42】求助各位战友，转膜完用丽舂红染色有条带，但是一抗二抗孵育后ECL显影照相没条带，急

答：【1】目的条带没出来，首先确定样品里有没有这种蛋白，含量如何？ 【2】可以加大上样量，或/并提高蛋白浓度。

【3】蛋白不要放太长的时间，防止蛋白降解。（提取蛋白时，裂解蛋白时不要忘了放蛋白酶抑制剂）

【4】加大一抗的浓度，就是降低稀释比例。 【5】增加一抗的孵育时间。

【6】（曝光后白板一张，不存在背景过强的问题），可以增加二抗的浓度，增加二抗的孵育时间。

【7】可以增加膜放在ECL中的时间。增加曝光时间。

【8】另外注意二抗的HRP 活性太强，将底物消耗光的可能。前面的方法都用了，还不行的话，就要注意这一点了。可以降低二抗浓度，或者更换二抗

【43】最近打算做ECL发光(以前用DAB显色),但是没见过师兄师姐用过,关于显影定影问题,有很多都不懂,望各位老师帮帮忙.

1.据说显影定影液要避光低温保存,是不是避光后(铝箔纸包住瓶子)放4度冰箱,还是室温就可以?(现在天气开始转热了,不知道室温是否可以)

2.产品说明书上说显影液约1个月可能就失效,定影液大概是2个月.请问我一次大概配多少mL溶液比较好?(我买的是粉剂,直接加水就可以用).是不是只要显影液定影液能浸泡过胶片就可以? 3.盛装显影液和定影液的容器有没有特殊要求?我打算用普通的玻璃瓶装,外面包一层铝箔纸,可以吗?

4.请问整个实验过程大概要用几升的显影定影液?我买了显影定影粉各一包(各可以配成一升溶液),不知道够不够用?如果是两个月内天天做,大概要用多少? 过几天就要开始做显影定影了,麻烦各位老师帮帮忙,非常感谢

答：1.据说显影定影液要避光低温保存,是不是避光后(铝箔纸包住瓶子)放4度冰箱,还是室温就可以?(现在天气开始转热了,不知道室温是否可以)

【1】放室温可以的，当然，放在4度冰箱就更好了。用铝箔纸包住当然可以，其实用那种有颜色（棕色）的玻璃瓶装也可以的。

2.产品说明书上说显影液约1个月可能就失效,定影液大概是2个月.请问我一次大概配多少mL溶液比较好?(我买的是粉剂,直接加水就可以用).是不是只要显影液定影液能浸泡过胶片就可以? 【2】你说的很对，就是能把胶片淹没就好了，所以要看你胶片的大小和盛放胶片的容器的大小。我显影和定影液各自配了500毫升。显影液和定影液用久了，曝光的效果就不好了，逐渐混浊，有杂质。所以，最好用一个月就换一下。

3.盛装显影液和定影液的容器有没有特殊要求?我打算用普通的玻璃瓶装,外面包一层铝箔纸,可以吗?

【3】没有特殊要求，你说的完全可以。当然，前面已经说了。可以用带染色的玻璃瓶（起避光的作用）装。

4.请问整个实验过程大概要用几升的显影定影液?我买了显影定影粉各一包(各可以配成一升溶液),不知道够不够用?如果是两个月内天天做,大概要用多少?

【4】哈，这要看你胶片的大小和盛放胶片的盒子的大小。如果放500毫升液体就能把胶片淹没的话，如果两个月做完的话，正好够用。

【44】各位大虾，本人现在做一低分子6.5KDa大小的蛋白，其有复合物25KDa（二硫键结合）。复合物本人使用非还原loding buffer已经做出了，证明抗体应该没有问题。

而6.5KDa的蛋白，我使用tricine系统，还原的loding buffer，且加热了。用浓缩胶4％，分离胶10％＋16％的方法，0.2um的PVDF膜，转膜为湿转，30V，60min，70min，80min都试过，预染Marker最小为10KDa，膜上出现了，胶上还剩下一点。但是敷育抗体后没有做出。仪器为Bio Rad 的1.5 cm的mini胶。

请各位指导一下到底是什么，不胜感激！

答：分子量有些小，不太容易出结果。最好每一步都做的更加仔细、更加到位。

【1】分子量小，电泳的时候不要时间太长。下面的兰色跑到胶的1/3左右一般就可以了。跑的久了，小分子量的蛋白很容易跑散了。

【2】如果没有把握，可以一步一步来。先用考马斯兰染一下胶，证明胶上有。然后可以用丽春红染色（这步熟了以后最好不要做，因为这会对以后的结果有影响。）。 【3】转膜还是以电流算好一些吧。一般都是衡流吧。最好电流小一些。

【4】看你写的，可以看到10KD的Marker,但是膜上和胶上都有，说明还是不放心。正常应该全部转到膜上才好，估计你也是担心小分子的转过头了。所以，你现在首先要确定目的蛋白转到膜上了。其实，不用丽春红染色，用眼直接看，比用丽春红染色的还要清楚。方法是，但转膜完成后，把膜拿出来，在膜逐渐干燥的过程中，膜会逐渐变成白染色。当膜刚变成白染色的时候，上面就会出现一些湿的、未干的条带，这些条带就是蛋白条带。当然，再过一会，这些条带也会变白的，所以，要一直看着。

【5】综合一下，最好一步一步来，每一步的条件摸准。先保证胶上有，然后湿保证膜上有，然后再曝光。这样就可以做到结果没出来的时候，心中有数，到底是哪里出了问题。

【45】92kd的蛋白应选什么浓度的分离胶和浓缩胶啊 答：【1】分离胶的浓度和最佳分离范围：

（1）SDS-PAGE分离胶浓度 －－－ 最佳分离范围 （KD)

6%胶 －－－－ －－－－－－－－50-150 8%胶 －－－－ －－－－－－－－30-90 10%胶 －－－－－－－－－－－－20-80 12%胶 －－－－－－－－－－－－10－40

（2）分离胶浓度（％） －－－ 线性分离范围（KD) 15 －－－－－ －－－－－－ －－12-43 10 －－－－ －－－－－－－－－16-68 7.5 －－－－－－－－－－－－36-94 5.0 －－－－ －－－－－－－ －57-212

【2】浓缩胶一般都是选4％或者5％ 下面是5％胶的配制方法：

成分 ----- 配制不同体积SDS-PAGE浓缩胶所需各成分的体积(毫升) 5%胶 － － 2 － － 3 － － 4 － － 6 － － 8 － － 10

蒸馏水 － － 1.4 － － 2.1 － － 2.7 － － 4.1 － － 5.5 － － 6.8

30?r-Bis(29:1) － － 0.33 － － 0.5 － － 0.67 － － 1.0 － － 1.3 － － 1.7 1M Tris, pH8.8 － － 0.25 － － 0.38 － － 0.5 － － 0.75 － － 1.0 － － 1.25 10%SDS －－ 0.02 －－ 0.03 － － 0.04 －－ 0.06 － － 0.08 － － 0.1 10%过硫酸铵 － － 0.02 －－ 0.03 － － 0.04 － － 0.06 －－－ 0.08 － － 0.1 TEMED － － 0.002 －－ 0.003 －－ 0.004 － － 0.006－ － 0.008 － － 0.01

【46】beta-actin 为43kd ，用的是湿转，200MA 1h, NC膜，可以成功将蛋白转到膜上，今天用的是pvdf膜，0.22um孔径，同样是湿转 200MA 1h,结果转膜后丽春红染膜未见条带，请高手指点!不胜感激！

答：1.转PVDF膜时,首先膜要先用甲醇浸泡,浸泡时间一般是1-20分钟,我用的是5分钟,甲醇浸泡后用转移液浸泡,浸泡时间我用的是比较长,我一般是用两小时,就是早早的就把转移液放到盘子里,海绵,滤纸也都放到里面.把PVDF膜泡透是比较重要的一步.

2.转移液要经常换新的,一般认为转移液可以用3-5次,但是我都是用两次就换新的,感觉次数多了.就不好用了,容易导致转膜的时候转不上,或者使膜上的蛋白条带发生弯曲,偏移,分散.

3.转膜的时候容易产热,所以转移槽里面最好加冰槽.我是里面加兵槽,外面用冰围起来(把转移的装置放在塑料脸盆中).这样的转移效果比较好.我用的是MILIPORE 的PVDF膜 ,我用的转移时间是300毫安半小时.当然膜不同,转移装置不同,所用的转移时间也可能不同.

4.还有很重要的一点就是,当膜上染色没染出来时,暴光的时候也可能出现条带,只是条带可能比较弱,暴光时间要长一点.

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