toll样受体 - 图文

大菱鲆干扰素调节因子-3（IRF-3）的全长cDNA克隆及序列分析

大菱鲆干扰素调节因子-3（IRF-3）的全长cDNA克隆

和序列分析

目 录

第一章 前言

1.鱼类干扰素的研究进展………………………………………………1

2.1鱼类干扰素的发现及其作用………………………………………………1 2.2鱼类干扰素分子的结构 ……………………………………………………2 2.3鱼类干扰素系统的作用机制………………………………………………3

2.鱼类干扰素调节因子家族的研究进展……………………………………5

3.1鱼类IRF的分类及分子结构…………………………………………6 3.2鱼类IRF的作用……………………………………………………6 3.3鱼类IRF-3的分子结构………………………………………………8 3.4 鱼类IRF-3在免疫反应中的作用机制………………………………9

3.本项研究的目的与意义……………………………………………………10 第二章 大菱鲆的IRF-3的全长cDNA克隆及序列分析 1.实验材料……………………………………………………………………12

1.1实验动物、菌种及质粒………………………………………………12 1.2仪器设备………………………………………………………………12 1.3溶液试剂………………………………………………………………13

2.实验方法………………………………………………………………………14

2.1大菱鲆头肾组织获取………………………………………………………14 2.2总RNA的提取及质量检测……………………………………………14 2.3 cDNA第一链的合成……………………………………………………14 2.4核心片段的克隆及测序……………………………………………………14

2.4.1核心片段的PCR反应………………………………………15 2.4.2 PCR产物的回收………………………………………………15

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2.4.3 PCR产物与载体连接…………………………………………15 2.4.4感受态细胞的制备与连接产物的转化………………………15 2.4.5阳性克隆的鉴定………………………………………………16 2.4.6 核心片段的序列分析…………………………………………16 2.5 3’RACE和5’RACE片段的克隆及测序…………………………………16

2.5.1 3’RACE和5’RACE克隆特异性引物设计………………16 2.5.2 3’RACE片段的克隆及测序………………………………17 2.5.3 5’RACE片段的克隆及测序……………… ………………17 2.6序列分析与进化树的构建………………………………………………17

3.结果分析……………………………………………………………………18

3.1 RNA样品的制备与质量检测………………………………………18 3.2核心片段克隆及测序结果……………………………………………18 3.3 3’RACE片段的克隆及测序结果…………………………………20 3.4 5’RACE片段的克隆及测序结果…………………………………22 3.5 全长序列的拼接………………………………………………………24 3.6 IRF-3的cDNA的序列分析………………………………………24

3.6.1 IRF-3的cDNA的序列和推断的氨基酸序列……………24 3.6.2 IRF-3的氨基酸序列的同源性比较…………………………26 3.6.3 IRF-3系统进化分析………………………………………………28

4.讨论…………………………………………………………………………29

总结…………………………………………………………………………………30 参考文献……………………………………………………………………………31 致谢…………………………………………………………………………………33

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第一章 前言

1．文献综述

大菱鲆(Scophthalmus maximus)，在中国又称“多宝鱼”。原产欧洲北海、波罗的海和地中海沿岸，属硬骨鱼纲、鲽形目、鲽亚目、鲆科、菱鲆属。大菱鲆生长迅速、肉味鲜美，是名贵的食用鱼。九十年代中期引进中国山东、福建等水温较低的地区养殖，在我国北方沿海养殖得到了迅速发展，产生了巨大的经济效益。随着大菱鲆养殖规模的迅速扩大，由病毒性疾病所引起的经济损失也日益突出。

虽然现在可以通过提高养殖水质或药物防治病害，但是这些只是治标不治本的方法。现代生物技术研究由形态水平逐渐深入到细胞、生化，基因水平，因此可以从基因水平在根源上降低病毒害造成的损失，提高和改善鱼类的免疫功能。在20世纪后20年，哺乳类IFN系统的分子研究取得了重大进展，随之对低等脊椎动物的IFN系统基因及其分子机制也展开了研究。作为变温动物的鱼类，其非特异性免疫应答受温度的影响较大，而干扰素作为先天性免疫系统的一种关键因子，在鱼类抵抗病毒感染中发挥了非常重要的作用[1]。

因此对IFN系统的研究及其作用机制的深入了解，利用生物技术培养抗病能力强、生殖周期短、产量高的新品种，对于鱼类病毒性疾病的防治研究具有重要的理论和实际意义，对养殖业的发展、经济的快速发展有重要意义。并且，对相关科学领域的研究也提供了重要的理论依据。

2．鱼类干扰素系统的研究进展

2.1鱼类干扰素的发现及作用

干扰素（Interferons，IFN）是机体细胞在病毒感染，或者受核酸、细菌内毒素、促细胞分裂素等的作用下由受体细胞分泌的一种具有高度生物活性的糖蛋白

[2]

，具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节等生物学功能。早在1957年由Isaacs和

Lindenman发现了干扰素[3]，他们观察到受病毒感染的细胞培养基中能产生一种蛋白，这种蛋白与细胞结台后，就能在细胞间产生复杂连串的结果，致使细胞具有抵抗其它病毒感染的能力[4]。另外，干扰素系统除了抗病毒作用外，它还参与其他重要的生理过程，如调节细胞的生长、分化、凋亡以及机体免疫反应等。

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干扰素具有广谱抗病毒活性，不仅可以抑制多种RNA病毒，又可抑制多种DNA病毒。但不同病毒对IFN的敏感性也不同，其中对有囊膜的病毒最敏感。干扰素几乎作用于病毒复制的每一阶段，通过减少病毒繁殖量以及减轻细胞损伤的方式发挥作用。I类干扰素抗病毒作用主要通过旁分泌作用，病毒感染的细胞分泌的干扰素能保护邻近的细胞不受感染，从而起到抗病毒作用。而II类干扰素则主要起到抑制病毒增殖的作用，其抗病毒活性比I类干扰素要差，由于IFN-γ

是一种淋巴因子，是由病毒抗原刺激淋巴细胞产生，在机体发挥免疫作

用后才产生，其发挥的抗病毒作用较I类干扰素更迟。

干扰素近几年陆续在虹鳟(Salmo gairdneri)、鲤(Cyprinus carpio)、草鱼(Ctenopharyngodon idellus)、鲫鱼(Carassius auratus)、大马哈鱼(Oncorhynchus keta)、牙鲆(Paralichthys olivaceus)、舌齿鲈(Dicentrachus labrax)、斑马鱼(Brachydanio rerio)、大西洋鲑(Salmo salar)等鱼体或培养细胞系检测到干扰素活性物质[5-8]。

2.2鱼类干扰素分子的结构

在哺乳类中，主要有三类干扰素，它们分别是：INFα，INFβ，INFγ。其中，INFα和INFβ被称为Ⅰ类干扰素；INFγ被称为Ⅱ类干扰素。两者有不同的细胞起源，结构不同、结合受体不同，介导的生物活性也不同。但后来研究者又发现了新一族的干扰素，称为λ干扰素，和I型干扰素具有类似活性，功能上与I类IFN接近，但是它的结构、受体和来源不同。

自1965年首次发现鱼类细胞能够分泌类似哺乳类干扰素的抗病毒活性物质后[9]，又陆续发现多种鱼类都能够产生干扰素。目前，在鱼类中发现2类干扰素：I型IFN，耐酸、耐热，类似于哺乳动物IFN-α /β，可以由病毒和双链RNA（dsRNA）诱导产生；II 型IFN，即IFN- γ，不耐酸、不耐热，可被有丝分裂原等诱导，由白细胞、T细胞或巨噬细胞产生[10]。

鱼类IFN的pI为5.4~7.1；分子量介于16~94kDa；对胰蛋白酶敏感；具有抗RNase、DNase；具糖蛋白性质[11]。研究发现，鱼类I型IFN在基因结构上与高等脊椎动物的I类干扰素基因不同，存在5个外显子和4个内含子。鱼类I型干扰素的前体蛋白具有143~153个氨基酸，N端21~23个残基为信号肽序列，其信号肽序列在不同鱼种间部分同源，但与高等脊椎动物干扰素信号肽序列存在较大差异[12]。

鱼类IFNγ基因包含4个外显子和3个内含子，编码一个148~157个氨基酸的前

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体蛋白．含有23~24个氨基酸的信号肽[13]。鱼类IFNγ的信号肽序列与高等脊椎动物的一致性较低，且不同鱼种间IFNγ序列的一致性也很低。

2.3鱼类干扰素系统的作用机制

干扰素并不能直接杀灭病毒，在哺乳动物中干扰素信号的传递主要是依赖于JAK（Janus kinase）-STAT（signal transducers and activators of transcription）途径。目前，已发现JAK激酶包括Jak1、Jak2、Jak3和Tyk2；已发现的STAT蛋白包括：STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5a、STAT5b以及STAT6。

宿主细胞对病毒核酸和dsRNA的识别是通过Toll样受体（Toll-like receptor，TLR）进行的，细胞应答TLR3、TLR4、TLR7或TLR9的活化信号而产生干扰素。其中TLR3识别病毒的dsRNA和PolyI：C(人工合成的dsRNA)；TLR7和TLR8识别单链RNA（ssRNA）；TLR9则识别病毒的非甲基化CpG的DNA基序。活化的TLRs激活IRFs，后者激活I型干扰素的转录[14]。在鱼类中已鉴定的TLRs分子有：日本河豚TLR2、日本牙鲆TLR2-1和TLR2-2、斑马鱼TLR3、沟鲶TLR3和虹鳟TLR3。虹鳟TLR3与人TLR3具有很高的同源性，经病毒和PolyI：C诱导后表达于虹鳟肾和脾组织中[24]。2008年，Skj?veland等克隆了大西洋鲑的TLR9基因，证明了IFN-γ是TRL9的重要诱导剂。这些研究的结果将为进一步阐明鱼类免疫系统奠定了基础。

目前对高等脊椎动物的干扰素的免疫调节作用已经有了比较完整的认识，而对鱼类的干扰素研究却处于初始阶段。研究已发现JAK-STAT信号途径也存在于鱼类的干扰素免疫反应中。JAK激酶能够激活STAT蛋白，STAT蛋白最初存在于细胞质中，磷酸化后被转运至细胞核发挥转录调节因子作用。Leu等首先克隆出河豚Jak1基因，随后Jak2、Jak3和Tyk2基因从河豚基因组中鉴定出来。斑马鱼STAT1和STAT3基因是最早被鉴定的鱼类STAT基因，其中斑马鱼STAT1具有拯救人STAT1基因缺陷细胞株的IFN信号传导的功能。从病毒感染的鲫鱼囊胚细胞系（CAB）中，鉴定出CaSTAT1和CaJAK1基因，CaSTAT1基因的表达受草鱼出血病毒（GCHV）、PolyI：C和IFN的诱导[16]。随后发现STAT2与DNA的结合能调节多种干扰素刺激基因（IFN-stimulated gene，ISG）的表达，在这个过程中鉴定出两种新的ISGs：Jun-D（JUND）和claudin-4（CLDN4），它们在I型IFN抗病毒反应中起关键作用[17]。

干扰素通过与其受体结合而发生生物学作用。在哺乳动物中，I型干扰素受

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体是IFNAR，由IFNAR 1和IFNAR 2两个亚基组成，I型干扰素的抗病毒作用主要通过2步信号传导途径来完成（图1-1）。首先，病毒感染的细胞识别dsRNA，通过TLR3激活转录因子IRF-3和NF-κB后转移到核中，结合到IFN-β启动子上。磷酸化的IRF-3首先与CBP/p300结合成复合体，后者能够激活IFN-β基因的转录。其后，IFN-β被分泌到胞外，并结合到干扰素刺激的细胞的IFN-α/β受体上。该配体-受体复合物激活Tyk2和Jak1激酶，使转录因子STAT1和STAT2磷酸化。活化的STATs脱离细胞膜受体进入细胞核中，二聚化并且结合IRF-9，激活ISG基因启动子上的干扰素刺激反应元件（Interferon stimulated response element，ISRE）。最后，ISG基因的转录被诱导，导致干扰素刺激的细胞合成抗病毒蛋白[14]。最近发现I型IFN还能激活另外两种信号传导途径：磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）途径和促分裂原激活蛋白激酶（MAPK）途径[15]。

IFN-γ通过结合与IFN-α/β受体不同的受体而发挥作用，并介入一个不同但有重叠的JAK-STAT通路的信号传导（图1-2）。参与IFN-γ信号传递的受体主要有：IFNGR、Jak1、Jak2及STAT1。有活性的IFN-γ形成同源二聚体，结合到两个IFNGR1，IFNGR2二聚体上，形成对称性传递复合体。受体亚基在细胞内的结构与胞内非活性Jaks紧密相连，使Jak1和Jak2再在自主磷酸化和转移磷酸化作用下依次活化并与受体结合。所形成的复合体对IFNGR1近C-末端含酪氨酸的一段基序磷酸化，使其成为STAT1的锚定位点。位于STAT1 C-末端的两个酪氨酸残基被激酶磷酸化后从受体上脱离，这个激酶与受体相连，形成一个同源二聚体转移到核内，结合到IFN-γ诱导基因的特异序列上（gamma激活序列，GAS），激活基因的表达。

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病毒IFNIFNAR1Tyk2IFN-α/β受体IFNAR2Jak1Stat1dsRNApIRF-3CBP/p300IRF-3Stat2pStat2pStat1NF-κBIRF-9抗病毒蛋白ppStat1mRNAIFNmRNAStat2PKRNF-κBIRF-9IFN-β基因ISREISGs病毒感染的细胞干扰素刺激的细胞

图1-1 上图展示了在病毒感染过程中，人类细胞第一次产生的I型干扰素（以IFN-β为例）在抗病毒过程中起作用的2步信号传导途径

图1-2 IFN-γ信号通路示意图

3．鱼类干扰素调节因子的研究进展

IRF家族最初因能够结合在I型IFN的病毒诱导类增强子原件上，诱导IFN的表达而被发现并被命名。随着研究的深入，发现IRF除了在IFN的转录调控、病原体的免疫反应中起重要作用外，它还在细胞因子的信号转导、细胞的增殖调控以及造血干细胞的发育分化中起重要作用。“IRF不仅仅是IFN的调节因子了![18]”

目前，在脊椎动物中已经发现10种IRF和几种病毒来源的IRF（v-IRF），

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而在鱼类中仅有5种干扰素调节因子的成员的基因被克隆出，包括IRF-1、IRF-2、IRF-3、IRF-6、IRF-7。

3.1鱼类干扰素调节因子的分类及分子结构

IRF是一类结构上保守的转录因子家族，IRF的N端的前115个氨基酸残基包含DNA结合域（DNA binding domain，DBD），含有保守的4-6个色氨酸重复，具有特征性的螺旋-转角-螺旋结构，通过DNA结合域，IRF可以结合相似的DNA序列（干扰素刺激反应元件，ISRE或IRF-E），ISRE首先是在编码I型干扰素基因的启动子上被鉴定出来，也在其它免疫基因及瘤形成基因的启动子上被发现。除具有DNA结合域，IRF还有IRF相关结构域（IRF association domain，IAD），丝氨酸富含域（Serine-rich domain，SRD）等多种功能性结构域等。

1998年，第一个鱼类IRF基因在褐牙鲆中被克隆出来，但很难仅从序列同源性和基因表达模式断定被克隆出来的褐牙鲆IRF是IRF-1还是IRF-2。研究发现，IRF-1和IRF-2结构相似，功能相反，因为IRF-2的N末端DNA结合区与IRF-1的N末端高度同源，而C末端部分则不同，他们竞争性的结合相同的顺式作用元件。Ordas等分别从大菱鲆肾组织和金头鲷脾组织中分离到2种IRF-1序列：IRF-1a和IRF-1b，大菱鲆IRF-1a序列和IRF-1b序列存在4个核苷酸的差别，因为在鱼类的其他基因上也存在类似的情况，它们是来自两个不同的基因位点，而不是同一基因的不同拼接变异体[23]。在乌醴中，三种干扰素家族的成员IRF-1，IRF-2，IRF-7基因以及它们的启动子序列被克隆出，研究发现，乌鳢的IRF-1基因含10个外显子；IRF-2包含9个外显子，IRF-7全长包含10个外显子，不同于人类的IRF-7a基因的是在5’UTR区具有一个内含子。在这三种干扰素调节因子的结构中发现，乌鳢的IRF-1和IRF-2基因包含了结合NF-κB和Sp1的区域，IFN-γ的激活域（GAS）也在乌鳢的IRF-1和IRF-7启动子序列中被找到[17]。

3.2鱼类干扰素调节因子的作用

哺乳动物中，干扰素调节因子成员的功能各不相同，作为多功能转录因子，分别在干扰素的转录调控、病原体的免疫反应、细胞因子的信号转导、细胞增殖调控、造血干细胞和淋巴细胞的发育分化等方面起到非常重要的作用。

IRF最首要的功能是诱导IFN的产生，IRF-1、IRF-3、IRF-5、IRF-7和IRF-9等诸多IRF，是病毒诱导产生IFN-I必需的转录因子。研究发现IRF-1表达水平

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的增加能够诱导STAT1、STAT2和IRF-9的表达，并能增强IFN-β诱导细胞进入抗病毒状态。IRF-1和STAT1基因及其编码蛋白之间相互作用的分子机理，表明了细胞内存在放大的信号的通路，这种通路能够控制细胞对干扰素信号的反应。IRF-3和IRF-7在病毒感染的早期和病毒感染的晚期的干扰素信号传导的过程中起了关键的作用，而IRF-7除了通过诱导干扰素参与细胞抗病毒防御外，还是一种干扰素刺激蛋白（ISG），本身也能直接与病毒基因启动子或病毒蛋白相互作用，对病毒基因的表达和病毒的复制进行调节[21]。IRF-5介导病毒信号转导，诱导IFN-α和IFN-β基因的表达，并可以取代IRF-7诱导IFN-α基因的表达作用。

IRF-1可以通过转录激活一系列的靶基因而发挥其抑癌作用，而IRF-2可以抑制这些基因的表达，因此IRF-1和IRF-2的表达失衡导致肿瘤的形成。IRF-8又称为干扰素保守序列结合蛋白（interferon concensus sequence binding protein, ICSBP），主要表达于造血系统细胞中，通过促进髓系分化和调节对白血病细胞的免疫反应而与人类的髓性白血病发病密切相关。干扰素调节因子在淋巴细胞分化过程中也发挥了重要的作用，IRF-1调控I类辅助型免疫反应，IRF-4与IRF-1的功能相反，能诱导TH细胞向TH2细胞分化，调控II类辅助型免疫反应而IRF-4在B细胞分化过程中也起到重要的作用。

在鱼类中，关于IRF的研究非常有限，功能研究主要集中于IFN的转录调控，抗病毒反应的方面的研究，对IRF家族成员多样性和功能的研究尚待进一步开展。Cai等克隆了褐牙鲆IRF-1基因（JFIRF-1）并构建了重组质粒，获得的上清液能够降低感染弹状病毒（HIRRV）和疱疹病毒（VHSV）滴度。研究证明，上清液中含有JFIRF-1诱导细胞进入抗毒状态并产生细胞因子类似物，因此JFIRF-1可用于DNA疫苗研制的辅佐剂的，在褐牙鲆的培育中发挥重要的抵抗病原体的作用。另外，还有学者对虹鳟IRF-1和Mx1基因启动子活性进行了研究。以虹鳟IRF-1a启动子构建的鱼类特异性DNA质粒载体，能够使IHNV病毒的G基因得到表达，研究发现这种IRF-1a启动子能够在老鼠NIH-3T3细胞中激活，也可以用于DNA疫苗的研究。Collet等将虹鳟IRF-2基因上游启动子克隆到报告基因载体pGL3-basic中，通过转染细胞、荧光素酶活性测定试验，证明IRF-2基因上游启动子具有较强的启动子活性。体外研究表明，未受诱导物刺激的乌鳢头肾细胞表达IRF-1、IRF-2和IRF-7，经PolyI：C刺激后，它们的表达

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量都显著提高[17]。大西洋鲑TO细胞经鲑鱼贫血病毒（ISAV）感染后，STAT1快速合成，而IRF-7的转录上调时间较晚，提示ISAV病毒能够通过抑制IRF-7的转录而抑制IFN系统的抗病毒作用。PolyI：C能够诱导IRF-2在虹鳟和鳜鱼中表达。2008年，Holland从PolyI：C刺激的虹鳟单核细胞系（RTS-11）中克隆出了鱼类的第一个IRF-3基因，发现了IRF-3在抗病毒过程中发挥了重要作用。

3.3鱼类IRF-3的分子结构

哺乳动物的IRF-3基因编码427个aa组成的、分子量为55kDa的蛋白质，由3个部分组成：DNA结合域（DNA binding domain，DBD），转录活性域

（Transactivation domain，TAD），反应结构域（Response domain，RD）（图1-3）。IRF-3的N端的115个氨基酸是DBD，内含特异的由由的10-18个氨基端间隔的5个重复的色氨酸残基，通过DBD IRF-3能结合到靶基因启动子上游保守IFN刺激应答元件（ISRE），在大多数IFN诱导的基因上的序列为AGTTTCNNCNY（其中N代表任意碱基）。干扰素的基因本身启动子上游存在ISRE，提示IRF-3能直接调控干扰素的表达。IRF-3蛋白的116到394位氨基酸是IRF-3的TAD，包括一段入核序列（Nuclear localization sequence，NLS，75-88aa）、一段出核序列（Nuclear export sequence，NES，139-150aa）、一段脯氨酸富含区（Proline rich segment，Pro，

[19]151-197aa）和一段IRF相关结构域（IRF association domain，IAD，199-394aa）。

通过NES和NLS，IRF-3实现了在细胞核和细胞质内的转移而有效实施调节功能。IRF-3能够通过TAD部分发挥其转录调节活性功能，TAD两侧有两个能相互作用的自身抑制结构域（Autoinhibitory domains，AID）分别位于IRF-3 C端380-427aa处和98-240aa处，覆盖了DBD和脯氨酸富含区。在未受病毒感染时，这两个AID能相互作用，使IRF-3形成一个封闭的构象，遮蔽IAD、DBD和核定位信号（NLS），防止未感染病毒时细胞浆内的IRF-3磷酸化转移至细胞核与DNA结合，当被病毒感染后，IRF-3通过IAD形成二聚体，入核发挥转录活性。若去掉这两个AID，即使无病毒刺激，也可使IRF-3与DNA结合，从而表现出低水平的转录活化功能。IRF-3的C末端区394-427个氨基酸是具有调节功能的RD，含多个磷酸化的位点，受多种激酶的调控，对其生物学活性的发挥起了重要的作用[19]。

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