高效毛细管电泳在食品分析中的应用

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第3期 分析测试仪器通讯 159

高效毛细管电泳在食品分析中的应用

齐 莉

周 蓉 王雅芬 易 弘

北京市新技术应用研究所 北京 100035

摘要 介绍了高效毛细管电泳(HighPerformanceCapillaryElectrophoresis,简称HPCE)在食品分析方面的应用;建立了以HPCE为基础,对食品中的氨基酸、水溶性维生素、核苷酸、还原性单糖及山梨酸等成分进行定性、定量分析的新方法。方法基于食品中的氨基酸、水溶性维生素、核苷酸、还原性单糖及山梨酸等小分子物质不会被毛细管壁吸附,在高压下样品组分短时间内即可以达到基线分离。实验结果表明:HPCE在食品分析方面有着广阔的应用前景。

关键词 高效毛细管电泳 氨基酸 维生素 核苷酸 单糖 食品分析

1 概述

自80年代初Jogenson[1]用高效毛细管电泳分离多肽达到40万理论塔板数之后[2],HPCE便进入了迅猛发展的阶段。

按其分离机理高效毛细管电泳可划分为: 毛细管区带电泳[6~8](CapillaryZoneElectrophoresis,简称CZE); 毛细管凝胶电泳(CapillaryGelElectrophoresis,简称CGE); 毛细管电动色谱[10~15](M-icellar

Electrokinetic

Capillary

Chromato-graphy,简称MECC); 毛细管等电聚胶电泳(CapillaryIsoelectricFocusing,简称

CIEF)。

由于HPCE具有远快于高效液相色谱(HPLC)和一般电泳的分析速度(5~30min)、分离度高(理论板数最高可达3 107/m)、检测灵敏度高(一般为10

-15

[9]

[3~5]

多肽[16,19]、酶[20]、抗原、抗体、核酸、RNA的分离和DNA测序方面有着巨大潜力。

HPCE在食品分析方面的应用[22,23]也呈现出愈来愈宽广的景象。

国外的食品分析专家早在90年代初就用HPCE技术从豚鼠和鱼的组织中分离出了肉类主要呈鲜物质 核苷酸。两年前国内的食品专家在国产HPCE仪上从猪肉样品中成功地分离出了三种核苷酸。核苷酸是DNA的降解产物,依据动物性食品中核苷酸含量的多少,就可以判断其新鲜程度。因此,分析核苷酸已成为生物化学、医疗、卫生防疫和卫生检疫的重要内容,同时,核苷酸的分离也是国内各食品公司开发及研究风味食品过程中必不可少的一项关键技术。

氨基酸是人们每天可以从食物中摄取的必要的营养物质,人类所食用的各种谷物等食物及家禽、牲畜食用的饲料中都含有氨基酸。在医疗及保健方面,氨基酸营养液[24]的应用也有近50年的历史了。氨基酸营养液不仅可以为生长发育不良和消化不良的婴幼儿补充营养,而且可以改善外科手术后的病人的营养状态,并能促进病人的体力

[21]

~10

-18

mol/L)、进样量少(1~10nL)、再现性佳、能直接进样及易于自动化操作等优点,作为一种极其重要的分离分析方法,HPCE已引起生命科学各领域的极大重视,并广泛应用在生化分析、临床医学、环保、化学等领域。近年来,HPCE的发展展示了其在药物

[17,18]

、

,,

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恢复和加快病人伤口的愈合速度。目前,氨基酸的分析在食品行业及保健品行业中已占有很重要的地位。

维生素是维持人体健康所必须的一类低分子有机化合物,这类物质由于体内不能合成,所以必须由食物供给。众所周知:人体若长期缺乏维生素B12则会导致恶性贫血症的发生;若缺乏维生素C,则易患坏血病。因为用传统的HPLC[25,26]进行维生素的分离,效果不佳,因此,HPCE技术在维生素的分析应用方面正逐步成为食品行业的一种普及方法。

葡萄糖是维持大脑正常功能所必须的养料。大多数的食品、糖浆类药物和天然水果饮料中都含有大量的包括葡萄糖在内的单糖及山梨酸等物质,当人们从食物中摄入的糖量过多或不足时,就极易患糖尿病或出现低血糖。HPCE在单糖及山梨酸的分析方面显示出其独特的优越性[27]。

3.1 实验结果

图1至图5分别是最佳条件下氨基酸、单糖、核苷酸、维生素及山梨酸的HPCE分离图谱。在与图1同样的实验条件下,从鸡饲料和红小豆的酸解液中用MECC方法成功地分离出了16种氨基酸;亦从国内的一种药液中用CZE方法分离出了数种还原性单糖;图2是猪肉样品中的3种核苷酸的HPCE(CZE)谱图;从市面上出售的天然水果饮料中,用CZE方法可分离出山梨酸及糖精等成分;图5是5种维生素的HPCE(CZE)图谱。

图1 还原性单糖的HPCE图谱

2 实验部分

2.1 仪器及主要试剂

1229型高效毛细管电泳仪(北京市新技术应用研究所研制);氨基酸(上海康达氨基酸厂产品);衍生剂(FlukaChemicalCo.产品);核苷酸(日本NihokyChemicalCo.产品); _萘胺、甲醇、乙酸、单糖样品、三氯甲烷、硼砂、维生素、山梨酸、糖精、碳酸钠、磷酸氢二钠、乙二胺、丙酮(国产分析纯产品)。2.2 实验方法

单糖的衍生方法与文献[27]相同;氨基酸的衍生方法与文献[28]相同。2.3 电泳条件

石英玻璃毛细管:总长70cm(有效长度54cm)/ 50 m(或75 m);紫外检测器波长:214nm或254nm;高压:20~25kV。3 1 衍生剂;2 鼠李糖;3 木糖;4 核糖;5 葡萄糖;6 阿拉伯糖;7 半乳糖;8 内标。缓冲液:0.050mol/L硼砂(pH10.5)。电压:18kV。

毛细管: 50 m/总长60cm。

进样:高差进样10s。紫外检测器波长:254nm。

图2 猪肉样品中核苷酸的HPCE分离图谱

1 次黄嘌呤;2 AMP;3 IMP;4 ADP。缓冲液:0.020mol/LNa3PO4(pH8.3)。电压:19kV。紫外检测器波长:254nm。

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图3 氨基酸的HPCE图谱

1,2 衍生剂;3 羟脯氨酸;4 苏氨酸及丝氨酸;5 丙氨酸;6 甘氨酸;7 缬氨酸;8 脯氨酸;9 蛋氨酸;10 谷氨酸;11 天冬氨酸;12 亮氨酸;13 异亮氨酸;14 苯丙氨酸;15 色氨酸;16 胱氨酸;17 精氨酸;

18 二赖氨酸;19 二酪氨酸。0.015mol/LNa2HPO4_0.050mol/LSDS(pH7.0)。高差进样:10s。

毛细管:总长54cm/ 50 m。紫外检测器波长:254nm。高压:20kV

。

图4 甜味剂的HPCE图谱

1 溶剂峰;2 山梨酸;3 苯甲酸钠;4 糖精。

0.010mol/LK2HPO4_/硼砂(pH8.6)。

高差进样:10s。高压:20kV。毛细管:总长59cm/ 75 m。紫外检测器波长:254nm。

图5 维生素的HPCE图谱

1 VA;2 VB5;3 VC;4 VB2;5 VB12。0.050mol/L硼砂_SDS/0.020mol/LNaCl(pH8.0)。毛细管:总长54cm/ 75 m。高差进样:10s。

高压:24kV。紫外检测器波长:254nm。

3.2 衍生

由于大部分氨基酸及还原性单糖无紫外吸收基团,所以对这类样品必须进行柱前衍生,并选择合适的衍生剂及简便易行的衍生

,线检测样品的目的。在254nm或214nm波长下对单糖样品采用 _萘胺衍生剂,其单糖衍生物的检测浓度可达10-6

mol/L[28]。

_萘胺衍生方法不仅适用于醛糖,也适用于酮糖(包括N_乙酰氨基糖及糖醛酸)。对于(

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进行衍生,254nm波长下其精氨酸衍生物的最低检测限达8.5 10-11

耳热,即电泳电流会随缓冲液中离子浓度的增加而增大,由此会产生较大的基线噪声和基线漂移,并会进而导致分离度下降,甚至会产生气泡,使实验中断。3.3.3 定量分析

在实际样品的分析实验中,氨基酸及单糖的精密度好,RSD均小于5.0%,相关系数分别为0.9994及0.9930。此结果表明:在本实验条件下,HPCE技术可以应用于实际样品的定性、定量分析及产品生产的质量监控过程中。4 结论

每年举办一次的匹兹堡国际会议已开过了47届。其中,色谱界占有举足轻重的地位,它不仅为人们提供有关色谱方面的新技术、新设备,也为人们展示新思路、新方法和新的研究热点。高效毛细管电泳技术被列为1988年匹兹堡国际会议的热点,并且1989年在美国的波士顿还召开了首届国际HPCE专题会议。1996年3月份在美国芝加哥举办的第47届匹兹堡国际会议上有关HPCE的论文就有20多篇。1997年3月份在美国亚特兰大举办的第48届匹兹堡国际会议将HPCE的重点仍放在食品分析、饮食安全检测、环保、生物化学和医学等方面。

毛细管电泳最新发展趋势是用毛细管无胶筛分电泳[29]对PCR扩增产物进行检测及进行DNA序列分析。毛细管无胶筛分电泳是介于CZE和CGE之间的一种分离体系,其分离机理是:当纤维素衍生物这类高分子聚合物溶于水后,在浓度较低时,聚合物链是孤立的;在浓度较高时,则发生交缠[30],而它们所形成的类似于凝胶的多孔结构就能对DNA片断进行筛分。

国内已于90年代举办了两届HPCE专题会议,今年秋天将在北京举办第三届全国,g[27]。常见20种

氨基酸均可用此衍生方法进行衍生。本文采用的这两种衍生方法不仅操作快速简便,而且衍生物与过量的衍生剂极易分离。3.3 影响分离的关键要素

HPCE过程中的各种实验条件,如:毛细管内径的大小、毛细管的长短、环境温度的高低、样品的进样量、电压、缓冲液浓度的大小及缓冲液pH的高低等要素均会对分离结果产生影响。但当控制毛细管内径的大小、毛细管的长短、环境温度的高低、样品的进样量及电压最佳值之后,缓冲液浓度的大小及缓冲液pH的高低便成为影响样品分离的关键因素。

3.3.1 pH的影响

pH在HPCE中是一个非常重要的参数,它会通过影响被分离物质的荷电性质来影响这些物质的有效迁移速度。由于多数情况下,电极的正负两端均会发生由H+和OH参与的氧化还原反应,依据法拉第定律:电解产生的物质量或消耗的物质量与电极两端转移的电荷量之比成当量关系,即在电极两端加压的时间越长,电极两端溶液之间的pH差值越大,但同时电极反应所引起的pH变化的大小又与缓冲液的缓冲容量有关。实验结果表明:如果选用适当的、缓冲容量大的缓冲液,则能保证在相当长的时间内溶液中的pH值基本不变。

在不同pH的缓冲液中对中性物质二甲基亚砜的迁移时间进行了观察,实验结果显示:缓冲液的pH越高,二甲基亚砜的迁移时间越短,即毛细管内的电渗流值越大。实验结果还显示:不同的样品,其组分在pH不同的缓冲液中的出峰顺序是不同的。

3.3.2 缓冲液的浓度

增加缓冲液中的离子浓度能比较有效地-

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成为与HPLC互补及并列的研究手段。

从实验结果来看,HPCE不仅是一种分析手段,也可成为产品生产过程中的质量检测方法。特别是在食品行业,用国产的1229型HPCE仪能对谷物、饲料中的氨基酸进行分析,也能分析药物素

[32]

[31]

(3):94.

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Paul.StrategiesfortheMonitoringofDrugsinBodyFluidsbyMicellarElectrokineticCapillary.

、饮料中的维生

、单糖和甜味剂,尤其是利用HPCE技

术可以分离出各种肉类中的核苷酸,又为我国的食品加工及开发工作提供了更为先进的手段。我们相信:随着HPCE理论与应用的深入研究,HPCE技术必将成为食品分析的一项普及方法,并将为多肽、蛋白质、酶、DNA等物质的分离开拓出更广阔的前景。5 参考文献

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HighPerformanceCapillaryElectrophoresisand

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QiLi,ZhouRong,WangYafen,YiHong

(BeijingInstituteofNewTechnologyApplication,Beijing,100035)

Anoverviewonprinciple,theoryandapplicationofhighperformancecapillaryelectrophore-sis(HPCE)infoodanalysisispresentedinthispaper.Newmethodsfortheseparationandquan-titationofaminoacids,vitamins,nucleotide,reducingmonosaccharideandsorburonicacidinfoodsareestablished.Thesecomponentsarenotabsorbedbythecapillaryinnerwallandcanbecompletelyseparatedinashorttime.Anon_columnUVdetectorwasused.Theexperimentre-sultsshowthatHPCEhasapromisingapplicationprospectsinfoodanalysis.

Keywords: highperformancecapillaryelectrophoresis,aminoacids,vitamins,nucleotide,reducingmonosaccharide,sorburonicacid,foodanalysis

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