壳聚糖修饰的PLGA纳米粒作为蛋白多肽类药物载体的研究

医用缓释体系

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２

）卷２０１１年第２期（４２

＊

壳聚糖修饰的ＰＬＧＡ纳米粒作为蛋白多肽类药物载体的研究

陈红丽１，吕洁丽２，晏　杰３，王银松４，郭伟云１，丰慧根１，陈　汉３，张其清３

（新乡医学院生命科学技术系，河南省遗传性疾病与分子靶向药物重点实验室培育基地，河南新乡４１．５３００３；新乡医学院药学院，河南新乡４中国医学科学院＆协和医学院生物医学工程研究所，天津３２．５３００３；３．００１９２；

）天津医科大学药学院，天津３４．０００７０

摘　要：以乳酸羟基乙酸共聚物　采用溶剂挥发法，（制备了载牛血清白蛋白（的ＰＰＬＧＡ）ＢＳＡ）ＬＧＡ纳米，粒（采用两种修饰方式（直接吸附法和共ＰＬＧＡ　ＮＰ）

，价交联法）以壳聚糖（修饰纳米粒表面，ｃｈｉｔｏｓａｎＣＳ）通过考察修饰方法对纳米粒的理化性质、释药性质以

及对Ｂ吸附法修饰的纳米粒（ＳＡ构型的影响，ＡＤＣＳ）包封率提高，达到（突释效应显著；ＮＰ）８７．８±３．１％，共价交联法修饰的纳米粒（包封率降低，释ＣＢＣＳＮＰ）　

药速率增加。３组纳米粒释放速率顺序为Ｖ（ＣＢＣＳ。ＰＶ（ＡＤＣＳＮＰ）ＰＬＧＡ　ＮＰ）ＬＧＡ　ＮＰ与ＮＰ）＞　＞Ｖ（

而ＣＡＤＣＳＮＰ包载的ＢＳＡ构象未见明显改变，ＢＣＳ　

ＮＰ包载的ＢＳＡ的圆二色谱中α－螺旋含量降低，－折β叠增加。因此，ＡＤＣＳＮＰ更适合作为蛋白多肽类药物　载体。

关键词：壳聚糖；修饰；圆二色ＬＧＡ纳米粒；ＢＳＡ；　Ｐ谱中图分类号：６３６．１　Ｏ

（）文章编号：１００１９７３１２０１１０２０２０２０４－－－

文献标识码：Ａ

］７１０－

。体、蛋白多肽及基因类药物的载体［

本文以ＰＬＧＡ为载体材料，以牛血清白蛋白

（为多肽蛋白质模型药物，采用溶剂挥发法制备ＢＳＡ）了Ｐ选择ＣＬＧＡ纳米粒，Ｓ分别采用直接吸附法修饰纳米粒（以及共价联接法修饰纳米（ＡＤＣＳＮＰ）ＣＢＣＳ　粒表面，对纳米粒的理化性质及ＢＳＡ的包封率、ＮＰ）

释药性质等进行了考察，对两种方法修饰的纳米粒中

为不同修饰方式制备的纳ＢＳＡ的构型变化比较研究，米粒作为蛋白多肽类药物载体的研究提供了参考依

据。

２　实　验

２．１　主要原料与仪器

末端未封端，ＰＬＧＡ（ＭＷ为１０，０００～３０，０００，５０

，山东省医疗器械研究所）壳聚糖（低分子量，脱∶５０，），乙酰度８牛血清白蛋白（５％，Ｓｉｍａ６３０００～６５０００，ｇ

，）北京鼎国生物有限公司）蛋ＢＣＡ（Ｂｉｃｉｎｃｈｏｎｉｎｉｃａｃｉｄ　），白检测试剂盒（其余试剂均为分析纯。Ｐｉｅｒｃｅ

；场发射扫描电镜（日本）ＪＥＯＬ，ＪＳＭ－６７００Ｆ，Ｘ射；线光电子能谱（美国）粒径及电位分析仪ＰＨＩ１６００，－

（，。美国）ＺｅｔａＰＡＬＳＢｒｏｏｋｈａｖｅｎＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓＣＯ．　　　２．２　纳米粒的制备

１１］

：采用改良溶剂挥发法制备纳米粒［将２０ｍｇ

中，转Ｈ值为７．５ｍＬ磷酸盐缓冲液（２）ＢＳＡ溶于０．ｐ入Ｐ超声形成初乳，将初乳ＬＧＡ的二氯甲烷溶液中，

转入２再次超声形成复乳，搅拌０ｍＬ１％ＰＶＡ溶液中，　／待有机溶剂挥发后１４ｈ，８，０００ｒｍｉｎ离心收集纳米粒，冷冻干燥即得ＰＬＧＡ　ＮＰ。２．２．１　吸附法修饰纳米粒

１１］

，根据前期的研究工作［在上述制备ＰＬＧＡ纳米

粒的过程中，０．５％ＰＶＡ水溶液中含１００ｍＣＳ醋酸ｇ　溶液，一起作为外水相。其余步骤和方法同前。２．２．２　共价交联法修饰纳米粒

称取１加入Ｐ００ｍＬＧＡ　ＮＰ，ＢＳ（Ｈｇ制备好的Ｐｐ）中分散均匀，加入ＥＤＣ活化纳米粒表面的羧基，５．０然后加入１室温搅拌反应２离心收集纳００ｍＣＳ，４ｈ，ｇ　米粒。

１　引　言

多肽和蛋白质药物与非蛋白质类药物在物理化学和生物化学性质方面有许多不同，如药物分子的大小、溶解性能、构型稳定性、生物活性等。通常适用于普通药物的控制释放体系不一定适合多肽和蛋白质药

１］

。采用生物可降解聚合物，物控制释放［特别是乳酸羟基乙酸共聚物（为骨架材料，包裹多肽、蛋白ＰＬＧＡ）

质药物、ＤＮＡ以及其它药物制成可注射微球或纳米粒制剂，使在体内达到缓释目的，是近年来各国学者大力研究的新领域。但是ＰＬＧＡ是人工合成的亲脂性多聚物材料，在应用中存在着一定局限性，与机体细胞缺少特异性的结合，微球及纳米粒的突释效应明显，对于水溶性药物或者蛋白多肽药物包封率低及药物释放不能平稳缓释的缺点也限制了其一些应用。有文献［２，］报道经过修饰后的Ｐ３ＬＧＡ纳米粒更适合包载蛋白

［］

多肽、是自然界ＤＮＡ及抗体类药物４－８。壳聚糖（ＣＳ）存在唯一带正电荷的天然多糖，具有良好的生物相容性、可生物降解性和组织黏附性，被用作化学药物、抗

＊

）；）基金项目：国家重大科学研究计划资助项目（新乡医学院省级重点学科开放课题资助项目（２００６ＣＢ９３３３００ＺＤ２００９４４

收到初稿日期：收到修改稿日期：通讯作者：陈红丽，张其清２０１００４２２２０１０１２１４－－－－

，作者简介：陈红丽　（女，河南安阳人，博士，讲师，师承张其清教授，从事生物医用材料和纳米药物载体的研究。１９７８－）

医用缓释体系

陈红丽等：壳聚糖修饰的ＰＬＧＡ纳米粒作为蛋白多肽类药物载体的研究

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粒径及Ｚ２．３　纳米粒表面形态、ｅｔａ电势

将充分干燥后的纳米粒真空喷金后场发射扫描电镜观察纳米粒形态结构。取适量纳米粒分散于去离子水中，用激光粒度分析仪测定纳米粒的粒径及粒径分布，并对其表面Ｚｅｔａ电势检测。２．４　纳米粒的化学组成

）检测未载药的纳米粒表Ｘ射线光电子能谱（ＸＰＳ面化学组成和键合状态，使用ＰＨＩ１６００ＥＳＣＡ系统　

（）以ＭＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒＫＸ射线源进行分析。－αｇ２．５　包封率

／精密称取１以２０ｍｍＬ０．１ｍｏｌＬＮａＯＨ　　ｇ纳米粒，

溶解，于３以０．７℃恒温振荡器中振荡孵育４８ｈ后，１／定容至１用微量Ｈ值为６．ｍｏｌＬ　ＨＣｌ调ｐ５，０ｍＬ，ＢＣＡ法于５７０ｎｍ处测定ＢＳＡ浓度。

包封率＝

纳米粒中的蛋白质含量

００％。×１投料量

量的３种纳米粒置于ｐ空气浴振荡器７．２ＰＢＳ中，Ｈ　

（／中（分别于２３７±１）℃、７５±１）ｒｍｉｎ振荡，４、４８ｈ时离心取上清液测定Ｂ各组分别与ＳＡ的ＣＤ谱。此外，

其等浓度的游离Ｂ用仪器附带软件计算ＳＡ溶液比较，对应ＢＳＡ二级结构单元的相对含量。

２．８　统计学分析

实验数据以均数±标准差表示，样本均数间比较采用ｔ检验，以Ｐ＜３种纳米粒的释放采用方差分析，０．０５为差异具有统计学意义。

３　结果与讨论

粒径及Ｚ３．１　纳米粒的形态、ｅｔａ电势

（），如图１扫描电镜下观察ＰａＬＧＡ　ＮＰ呈圆整球

形，纳米球囊壁致密，其平均粒径为（２２８．１±２０．４）ｎｍ（）。图１（）表１显示修饰后的纳米粒呈不规则球形，ｂ出现聚集现象，分散性变差，粒径增大，如ＡＤＣＳ和ＣＢＣＳＮＰ的粒径分别为（３１２．５±２３．５）ｎｍ和（３２２．４　

）粒径的差异是ｎｍ。ＰＬＧＡ　ＮＰ修饰前后形态、±２７．１由于Ｃ从而更容易Ｓ表面修饰增加了纳米粒的粘性，

１１］

。发生聚集的缘故［

ＰＬＧＡ　ＮＰ的Ｚｅｔａ电势为－（２３．３１±３．１５）ｍＶ，

说明Ｐ这种表面电ＬＧＡ末端羧基分布于纳米粒表面，荷分布方式有利于下一步ＣＳ的表面修饰。修饰后纳米粒的Ｚｅｔａ电势为正值

。

２．６　体外释放

精密称取２投入１释０ｍ０ｍＬ离心管中，ｇ纳米粒，

，放介质为ｐ空气浴７．２的磷酸盐缓冲盐溶液（ＰＢＳ）Ｈ　）（／振荡器中（固定时间间３７±１℃、７５±１）ｒｍｉｎ振荡，

隔离心取样并补加等量ＰＢＳ。上清液中的蛋白质浓度用微量Ｂ计算释放量以及累积释放ＣＡ分析法测定，量。

分析２．７　圆二色谱（ＣＤ）

光源系统氮气保护，ＪａｓｃｏＪ２８１０型圆二色谱仪，　

／，扫描速率２扫描波段为２０ｎｍｍｉｎ００～２５０ｎｍ。取适

图１　纳米粒的扫描电镜图片和粒径分布图

Ｆｉ１ＳＥＭｉｍａｅａｎｄｓｉｚｅｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｏｆｎａｎｏａｒｔｉｃｌｅｓ　　　　　　ｇｇｐ　

［１，１２］

。本氮元素，因而证实Ｃ３．２　纳米粒表面化学构成Ｓ位于ＰＬＧＡ　ＮＰ表面１

１１］

：研究组进一步的研究证实［ＸＰＳ可以检测到纳米粒表层５～７ｎｍ厚度的化学ＡＤＣＳＮＰ两者比例与　

构成及键合状态等方面的信息，而ＣＰＬＧＡ　ＮＰ表面未检ＣＳ脱乙酰度一致，ＢＣＳＮＰ表面氮元素两者分峰　测到氮元素信号，而Ａ面积降低，即脱乙酰氨基比例降低，是由于ＣＤＣＳＮＰ及ＣＢＣＳＮＰ均检测到Ｓ的氨基　　

。由于所用材料中只有Ｃ氮元素的信号（图２）与ＰＳ含有ＬＧＡ末端羧基发生共价连接反应的结果。

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）卷２０１１年第２期（４２

表１　纳米粒性质表征

Ｔａｂｌｅ１Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｏｆｔｈｅｎ

ａ

ｎｏａｒｔｉ

ｃｌｅｓ　　

ｐ

纳米粒ＰＬＧＡ　ＮＰ　

ＡＤＣＳＮＰ　　ＣＢＣＳＮＰ（Ｙｉｅｌｄ％）９２．３±２．１　

８５．１±２．７　７２．４±２．９ＥＥ（％）７９．１±２．９　

８７．８±３．１　７１．３±２．４粒径（ｎｍ）２２８．１±２０．４

３１２．５±２３．５　３２２．４±２７．１Ｚｅｔａ电势（ｍＶ）

多分散指数

－２３．３１±３．１５１４７±０．０６３　０．

２５．２３±３．７４０．１９７±０．０５７　２４．３２±４．９１０．２０３±０．０７５图２纳米粒的ＸＰＳ图谱

图４ＢＳＡ圆二色谱图

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陈红丽等：壳聚糖修饰的ＰＬＧＡ纳米粒作为蛋白多肽类药物载体的研究

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纳米粒的ＢＳＡ浓度并分别与相同浓度的游离ＢＳＡ的光谱数据比较，未见明显差异。然而，ＣＢＣＳＮＰ释放　的ＢＳＡ的ＣＤ谱出现明显不同，ＢＳＡ在远紫外区域的Ｃ但形状和肩峰的位置未发生明Ｄ信号强度下降，显移动，表明Ｂ但其仍处ＳＡ中的α－螺旋的含量降低，于主导地位。２４ｈ时α２．９％下降到－螺旋的含量从３２９．２％，３．６％升高到１７．３％；４８ｈ时－折叠的含量从１β

３．０％下降到２９．５％，α－螺旋的含量从３－折叠的含量β

从１由此可以判断减少的α３．８％升高到１６．３％，－螺旋几乎全转变成β－折叠。由此可能导致较多的材料和水溶剂的分子与α－螺旋向外暴露于溶剂的极性和带电残基产生氢键和静电相互作用。以上数据证明共价交联法修饰过程中引起了ＢＳＡ二级结构的改变。

４　结　论

采用直接吸附法和共价交联法制备了ＣＳ修饰的

并考察将其用作蛋白药物载体的可行性，ＰＬＧＡ　ＮＰ，

结果显示两种方法修饰的纳米粒具有不同的载药和释药性质。和ＰＬＧＡ　ＮＰ相比，ＡＤＣＳＮＰ对ＢＳＡ的包　封率提高，但具有较高的突释效应，ＢＳＡ二级结构未出现明显变化；而Ｃ突ＢＣＳＮＰ对ＢＳＡ的包封率降低，　释效应有所降低，但释放速率加快，并且包载ＢＳＡ的二级结构发生改变。综合上述因素考虑，认为ＡＤＣＳ且有利于所载蛋白药物结构的稳ＮＰ制备方法简单，定，更适合用作易失活的多肽蛋白类药物的载体。参考文献：

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（），１．ＨｅｎａｎＫｅＬａｂｏｒａｔｏｒｏｆＨｅｒｅｄｉｔａｒＤｉｓｅａｓｅａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＴａｒｅｔＤｒｕＴｈｅｒａＣｕｌｔｉｖａｔｉｎＢａｓｅ　　　　　　ｙｙｙｇｇｐｙ（ｇ　　　　　

，，；ＤｅａｒｔｍｅｎｔｏｆＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏＸｉｎｘｉａｎＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔＸｉｎｘｉａｎ４５３００３，Ｃｈｉｎａ　　　　　　ｐｇｙｇｙｇ　　

，，；２．ＣｏｌｌｅｅｏｆＰｈａｒｍａｃＸｉｎｘｉａｎＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔＸｉｎｘｉａｎ４５３００３，Ｃｈｉｎａ　　　ｇｙｇｙｇ　　

，，３．ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＢｉｏｍｅｄｉｃａｌＥｎｉｎｅｅｒｉｎＣｈｉｎｅｓｅＡｃａｄｅｍｏｆＭｅｄｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅ　　　　　　ｇｇｙ　

，；ＰｅｋｉｎＵｎｉｏｎＭｅｄｉｃａｌＣｏｌｌｅｅＴｉａｎｉｎ３００１９２，Ｃｈｉｎａ　　　ｇｇｊ　

，，）４．ＣｏｌｌｅｅｏｆＰｈａｒｍａｃＴｉａｎｉｎＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔＴｉａｎｉｎ３０００７０，Ｃｈｉｎａ　　　　　ｇｙｊｙｊ

：ＡｂｓｔｒａｃｔＴｈｅｕｒｏｓｅｏｆｔｈｉｓｒｅｓｅａｒｃｈｗａｓｔｏｄｅｖｅｌｏｏｌｌａｃｔｉｃｃｏｌｃｏｌｉｃａｃｉｄｎａｎｏａｒｔｉｃｌｅｓ（ＰＬＧＡ　ＮＰ）ｓｕｒ　　　　　　　－－ｇ　　－ｐｐｐｐｙｙｐ　

）ｆａｃｅｍｏｄｉｆｉｅｄｗｉｔｈｃｈｉｔｏｓａｎ（ＣＳ．ＰＬＧＡ　ＮＰｗｅｒｅｂａｓｏｌｖｅｎｔｅｖａｏｒａｔｉｏｎｔｅｃｈｎｉｕｅ．ＴｈｅＰＬＧＡ　ＮＰｒｅａｒｅｄ　　　　　　　　　　ｙｐｑｐｐ　

，ｓｕｒｆａｃｅｗａｓｍｏｄｉｆｉｅｄｗｉｔｈＣＳｂｔｗｏｓｔｒａｔｅｉｅｓ（ａｄｓｏｒｔｉｏｎａｎｄｃｏｖａｌｅｎｔｂｉｎｄｉｎＡＤＣＳＮＰ，ＣＢＣＳＮＰ）．Ｔｈｅ　　　　　　　　　　　ｙｇｐｇ　

，，ｏｆｚｅｔａｅｎｃａｓｕｌａｔｉｏｎｅｆｆｉｃｉｅｎｃｄｒｕｌｏａｄｉｎａｎｄｉｎｖｉｔｒｏｒｅｌｅａｓｅｏｆｎａｎｏａｒｔｉｃｌｅｓｗｅｒｅｉｎｖｅｓｔｉｃｈａｎｅｏｔｅｎｔｉａｌ　　　　　　　　　　　－ｐｙｇｇｐｇｐ　　

）ａｔｅｄｕｓｉｎｂｏｖｉｎｅｓｅｒｕｍａｌｂｕｍｉｎ（ＢＳＡ）ａｓａｍｏｄｅｌｄｒｕ．ＰＬＧＡ　ＮＰｏｆ（２２８．１±２０．４ｎｍｉｎｄｉａｍｅｔｅｒｃｈａｒａｃ　　　　　　　　　　－ｇｇｇ　

，ｔｅｒｉｚｅｄｂｔｈｅｌａｓｅｒｌｉｈｔｓｃａｔｔｅｒｉｎｔｅｃｈｎｉｕｅＳＥＭａｒｅｓｈｅｒｉｃａｌａｎｄｉｔｓｄｒｕｅｎｃａｓｕｌａｔｉｏｎｅｆｆｉｃｉｅｎｃｉｓ（８４．１±　　　　　　　　　　ｙｇｇｑｐｇｐｙ　　　　

）３．４％．ＺｅｔａｏｔｅｎｔｉａｌｏｆＰＬＧＡ　ＮＰｗａｓｍｅａｓｕｒｅｄｔｏｂｅｎｅａｔｉｖｅ－（２３．３１±３．１５）ｍＶ．Ｔｈｅｏｓｉｔｉｖｅｚｅｔａｏ　　　　　　　　　　　－ｐｇｐｐｔｅｎｔｉａｌｏｆｍｏｄｉｆｉｅｄｎａｎｏａｒｔｉｃｌｅｓｒｅｖｅａｌｓｔｈｅｏｆＣＳｏｎｔｈｅｓｕｒｆａｃｅｏｆｔｈｅｍｏｄｉｆｉｅｄｎａｎｏａｒｔｉｃｌｅｓ．Ｘｒａｒｅｓｅｎｃｅ　　　　　　　　　　　　　　　－ｐｐｙｐｈｏｔｏｅｌｅｃｔｒｏｎｓｅｃｔｒｏｓｃｏＸＰＳ）ｓｈｏｗｓｔｈｅＮ１ｓ（ａｔｏｍｉｃｏｒｂｉｔａｌ１ｓｏｆｎｉｔｒｏｅｎ）ｒｅｉｏｎｏｆｔｈｅｓｕｒｆａｃｅｏｆｔｈｅ　　　　　　　　　　　ｐｐｐｙ（ｇｇ

，ｍｏｄｉｆｉｅｄｎａｎｏａｒｔｉｃｌｅｓｃｏｒｒｅｓｏｎｄｉｎｔｏｔｈｅｒｉｍａｒａｍｉｄｅｏｆＣＳ．Ｉｎｖｉｔｒｏｄｒｕｒｅｌｅａｓｅｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄｔｈａｔｔｈｅ　　　　　　　　　　ｐｐｇｐｙｇ　　　

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１

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ｒｏｔｅｉｎｃｈｉｔｏｓａｎａｓｄｒｕｃａｒｒｉｅｒｓｗｉｔｈ　　　　ｐｇ　１２３４

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