姜黄素抑制BLyS表达的分子机制及其在抗类风湿性关节炎中的作用

第三军医大学

博士学位论文

姜黄素抑制BLyS表达的分子机制及其在抗类风湿性关节炎中的

作用

姓名：黄刚

申请学位级别：博士

专业：生物化学与分子生物学

指导教师：何凤田

2011-05

第三军医大学博士学位论文

姜黄素抑制BLyS表达的分子机制及其在抗类风湿性

关节炎中的作用

摘要

类风湿性关节炎(Rheumatoid Arthritis，RA)是一常见的自身免疫性疾病，具有较高致残率，严重影响患者的生活质量。RA的发病机制不仅涉及T淋巴细胞活化，而且与B淋巴细胞过度活化与功能亢进有密切联系，近年研究表明B淋巴细胞在RA 的防治中有重要作用。TNF家族的B淋巴细胞刺激因子(B lymphocyte stimulator, BLyS) 是主要表达于B淋巴细胞的重要致炎细胞因子，其过表达与RA的发生和发展密切相关，抑制BLyS表达或生物学活性的发挥，无疑有利于RA的防治。姜黄素(Curcumin)是姜黄色素中最重要的活性成分，研究表明，姜黄素具有抗炎、抗氧化、免疫调节等广泛的药理作用，在抗RA等自身免疫性疾病方面具有明显的应用前景，但其发挥抗炎作用的分子机制尚未明了，特别是其抗RA的机制是否与调节BLyS有关目前尚未见报道。为此，我们针对该问题进行了系列研究，探讨了姜黄素对BLyS的调节作用及其在抗RA中的作用，结果表明，姜黄素可抑制基础水平和IFN-γ诱导的BLyS表达，而且在小鼠胶原诱导的关节炎(Collagen induced arthritis，CIA)模型中有抗炎作用并抑制体内的BLyS表达，“通过抑制BLyS表达而发挥抗炎作用”可能是姜黄素抗RA 的一个新机制。

第一部分姜黄素可抑制基础水平BLyS的表达

目的：以人B淋巴细胞为模型，探讨姜黄素对基础水平BLyS表达的抑制作用，阐明该抑制作用的可能分子机制。

方法及结果：

1. 在人B淋巴细胞Namalwa和Daudi中，经RT-PCR及Real-time PCR证实姜黄素可抑制基础水平BLyS mRNA的表达；经Western blot证实姜黄素可抑制基础水平BLyS蛋白的表达。

2. 构建了包含不同长度BLyS基因启动子区荧光素酶(Luciferase，Luc)报告基因重组质粒，经Luc报告基因检测实验证实，姜黄素可抑制基础水平BLyS基因启动子区

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的活性，且该抑制作用与-1082～-571区域密切相关。

3. 经电泳迁移阻滞实验(Electrophoresis mobility shift，EMSA)实验证实，NF-κB 能特异性结合于BLyS基因启动子区?874～?858序列，姜黄素呈时间依赖性和剂量依赖性抑制NF-κB与该区域的结合。

4. 经染色质免疫沉淀(Chromatin immunoprecipitation assay ，ChIP)实验证实，姜黄素可在B淋巴细胞内抑制NF-κB的p65亚基与BLyS基因启动子区?874～?858结合。

5. 经激光共聚焦、Western blot证实，姜黄素可抑制p65核转位及IκBα的磷酸化。

结论：在人B淋巴细胞Namalwa和Daudi中，姜黄素可抑制基础水平BLyS的表达，该抑制作用的可能机制是其抑制了NF-κB信号通路。

第二部分姜黄素对IFN-γ诱导BLyS表达的抑制作用

目的：在人B淋巴细胞细胞中，探讨姜黄素对IFN-γ诱导BLyS表达的抑制作用，阐明该抑制作用的可能分子机制。

方法及结果：

1.在B淋巴细胞Namalwa和Daudi中，经RT-PCR、Real-time PCR及Western blot 证实了姜黄素可抑制IFN-γ诱导的BLyS表达。

2. Luc报告基因检测实验证实，姜黄素可抑制IFN-γ诱导的BLyS基因启动子区活性。

3. 经RT-PCR、Real-time PCR及Western blot证实，JAK2抑制剂(AG 490)可阻断IFN-γ对BLyS表达的诱导作用。

4. 经Western blot证实，姜黄素可抑制IFN-γ诱导的STAT1磷酸化。

结论：在人B淋巴细胞中，姜黄素可抑制IFN-γ诱导BLyS的表达，该抑制作用是由于抑制了JAK2-STAT1信号通路。

第三部分姜黄素在小鼠CIA模型中抑制BLyS的表达

及抗炎作用

目的：建立用于RA研究的小鼠CIA模型，并探讨姜黄素在该动物模型上的抗炎作用以及抗炎过程中对BLyS表达的抑制作用，以揭示“通过抑制BLyS表达而发挥抗炎作用”是姜黄素抗RA的一个新机制。

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方法及结果：

1. 将牛Ⅱ型胶原经尾根部皮下注射于8周龄雄性DBA/1小鼠，制备小鼠Ⅱ型胶原诱导的关节炎(CIA)模型。

2. 以关节炎指数对小鼠模型的炎症情况进行评分，证实了(1)姜黄素预处理后对CIA的炎症有一定预防作用；(2)在已建立的CIA模型上，姜黄素处理对炎症有治疗作用。

3. 经ELISA检测小鼠血清中炎性细胞因子BLyS、IFN-γ、IL-6水平，证实了姜黄素抗炎过程中可抑制上述炎性细胞因子的水平。

4. 经RT-PCR及Western blot证实了姜黄素在抗炎过程中可下调小鼠脾脏组织中BLyS的表达。

结论：在小鼠CIA模型中，姜黄素对关节炎的进程有预防及缓解作用，“通过抑制BLyS表达而发挥抗炎作用”可能是姜黄素抗RA的一个新机制。

关键词：姜黄素；类风湿性关节炎；B淋巴细胞刺激因子(BLyS)；

NF-κB；IFN-γ；STAT1；小鼠CIA模型

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Molecular mechanism of Curcumin inhibits B lymphocyte stimulator expression and the significance of the inhibition in anti-rheumatoid arthritis

Abstract

Rheumatoid arthritis (RA) is a systemic autoimmune disease characterized by chronic inflammation targeting the synovial membrane, cartilage, and bone. Both B cells and T cells form aggregates in the synovium of inflamed joints and mediate the pathogenesis of RA. B cells play a critical role in the pathogenesis of RA. Recently, a number of biologic agents that target B cells have been tested as therapies for these conditions. Overexpression of B lymphocyte stimulator (BLyS) is closely involved in the pathogenesis and progression of RA. Curcumin is a diferuloylmethane present in Curcuma longa, an anti-inflammatory and anti-oxygen agent used in traditional medicine, has been shown to suppress cellular transformation, proliferation, and invasion. Because of its ability to modulate immune cells, curcumin has been shown to benefit on several autoimmune diseases. However, it is not clear whether curcumin could affect the expression of BLyS.

Part I Curcumin inhibits the expression of BLyS on basal level

Objective: to evaluate the molecular mechanism of curcumin inhibits the basal level of BLyS expression in Namalwa and Daudi cells.

Methods and Results:

1. RT-PCR, Real-time PCR and Western blot analyses demonstrated that curcumin inhibits BLyS expression in a dose- and time-dependent manner in Namalwa and Daudi cells.

2. We amplified BLyS promoter region from genomic DNA of Namalwa cells and constructed luciferase reporter expression plasmids (pBLyS/1082, pBLyS/571). Report assay showed that curcumin reduces the BLyS promoter activity and the DNA fragment (-1082～-571) in the BLyS promoter region might contain the binding site of transcriptional factor(s) in response to curcumin.

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53. EMSA confirmed that the transcriptional factor NF-κB specifically bind to the binding site which found in the BLyS promoter region (?874 to ?858). Furthermore, curcumin reduces the DNA-binding activity of NF-κB to the BLyS promoter region in a dose- and time-dependent manner in the nuclear extracts of Namalwa and Daudi cells.

4. ChIP assay indicated that curcumin reduces the p65 binding to the BLyS promoter region in Namalwa and Daudi cells.

5. Immunocytochemistry and Western blot demonstrated that curcumin blocked the nuclear translocation of p65 in Namalwa and Daudi cells. Furthermore, curcumin inhibits the phosphorylation of I κB α

Conclusion: Curcumin suppressed BLyS expression at both transcriptional and translational levels by reducing the NF-κB activity through inhibition of DNA binding of NF-κB, nuclear translocation of p65 and phosphorylation of I κB α.. Our findings suggest that suppression of NF-κB by curcumin is one of the mechanisms of curcumin to inhibit the BLyS expression.

Part ⅡCurcumin inhibits IFN-γ-induced BLyS expression

Objective: to evaluate the molecular mechanism of curcumin inhibits IFN-γ-induced BLyS expression in Namalwa and Daudi cells.

Methods and Results:

1. RT-PCR, Real-time PCR and Western blot analyses demonstrated that curcumin inhibits IFN-γ-induced BLyS expression in a dose-dependent manner in Namalwa and Daudi cells.

2. Report assay showed that curcumin reduces IFN-γ-induced BLyS luciferase reporter expression plasmids activity (pBLyS/1082).

3. RT-PCR, Real-time PCR and Western blot analyses demonstrated that AG 490 blocks IFN-γ-induced BLyS expression at both transcriptional and translational levels in Namalwa and Daudi cells.

4. Western blot analyses confirmed that curcumin inhibits the phosphorylation of STAT1 in a dose-dependent manner in Namalwa and Daudi cells.

Conclusion: Curcumin suppressed BLyS expression at both transcriptional and translational levels by inhibiting the JAK2-STAT1 signal pathway.

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6Part Curcumin attenuates inflammatory response Ⅲ and suppresses BLyS expression in collagen-induced arthritis

Objective: to evaluate the preventive effects of curcumin treatment on the inflammatory response and suppresses BLyS expression in a murine collagen-induced arthritis (CIA) model.

Methods and Results:

1. RT-PCR and Western blot analyses demonstrated that curcumin inhibits mBLyS expression in a dose-dependent manner in spleen lymphocyte.

2. Arthritis was induced in male DBA/1 mice at 7–8 weeks of age. On day 1, bovine type II collagen (CII) was diluted with Freund’s complete adjuvant (CFA). Mice were injected intradermally at the base of the tail with 100 μg of the bovine CII/CFA emulsion. On day 21, 100 μg bovine CII/IFA was injected intraperitoneally (IP).

3. Mice were monitored for clinical signs of arthritis on a daily basis. Curcumin treatment suppressed the evolution of CIA in a time-dependent manner, demonstrated by suppressed arthritis onset and reduced arthritis severity.

4. The pro-inflammatory cytokine such as BLyS, IFN-γ, and IL-6 levels in serum from CIA mice were determined by specific ELISA. Compared with vehicle-treated mice, curcumin-treated mice had lower serum BLyS, IFN-γ, and IL-6 levels.

5. RT-PCR and Western blot analyses demonstrated that the expression of mBLyS was down-regulated in the spleen of CIA mice treatment with curcumin.

Conclusion: Curcumin suppresses the onset of CIA and attenuates its severity in CIA mice. Curcumin reduced the inflammatory response by inhibiting the expression of BLyS mediators. The data could suggest that curcumin treatment is an effective prophylactic approach to suppress the evolution of arthritis in RA.

Key words: Curcumin; Rheumatoid arthritis; B lymphocyte stimulator;

NF-κB ；IFN-γ；STAT1；Collagen-induced arthritis

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英文缩略表

英文缩写 英文全称 中文名称 AA Acrylamide 丙烯酰胺 Ab

Antibody

抗体 Amp Ampicillin 氨苄青霉素 AP-1 Activator protein 激活蛋白 APS Ammonium persulfate 过硫酸铵

ATCC American Type Culture Collection 美国模式培养物保藏所 bp Base pair

碱基对 BSA Bovine serum albumin 牛血清白蛋白 β-gal Beta-galactosidase β-半乳糖苷酶 BCMA B cell maturation antigen B 细胞成熟抗原 BLyS

B-lymphocyte stimulator

B 淋巴细胞刺激因子

BAFF-R BAFF receptor BAFF 受体

BAFF

B cell activating factor belonging to the TNF family TNF 家族 B 细胞活化因子 mBLyS Mouse B-lymphocyte stimulator 小鼠B 淋巴细胞刺激因子 cDNA Complementary DNA

互补DNA CFA Freund’s complete adjuvant

弗氏完全佐剂 ChIP Chromatin immunoprecipitation assay 染色质免疫沉淀 CIA

Collagen induced arthritis

胶原诱导关节炎 Cur Curcumin 姜黄素 DEPC Diethyl Pyrocarbonate 焦碳酸二乙酯 ddH2O

Double distillated water

双蒸馏水 DMSO Dimethyl Sulfoxide 二甲基亚砜 DNA Deoxyribnucleic acid 脱氧核糖核酸 dNTP Deoxyribonucleoside triphosphate 脱氧核糖核苷三磷酸

DTT Dithiothreitol 二硫苏糖醇 EB Ethidium bromide

溴化乙锭

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E.coli Escherichia coli

大肠杆菌 EDTA Ethylene diamine tetraacetic acid 乙二胺四乙酸 ELISA enzyme linked immunosorbent assay 酶联免疫吸附测定 EMSA Electrophoresis mobility shift 电泳迁移阻滞实验 FBS

Fetal bovine serum

胎牛血清 h Hour

小时

HRP Horseradish peroxidase 辣根过氧化物酶 IFN-γ Interferon-γ

干扰素γ IL Interleukin 白细胞介素 IFA incomplete freund's adjuvant 不完全弗氏佐剂 LB Luria-Bertani LB 培养基 IMF

Immunofluorescence

免疫荧光 Luc Luciferase 荧光素酶 kDa Kilo Dalton 千道尔顿 MCS

Multiple clone site

多克隆位点

min Minute 分钟

M-MLV RT Moloney Murine Leukemia Virus

Reverse Transcriptase 莫洛尼(氏)鼠白血病病毒反转录酶 M r

Relative Molecular Mass

相对分子质量

mRNA messenger RNA

信使核糖核酸

MTT

3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphe nyltetrazolium bromide 3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐 NF-κB Nuclear factor-κB 核因子κB OD Optical density

光密度

PAGE Polyacrylamide gel electrophoresis

聚丙烯酰胺凝胶电泳 PBMC Peripheral Blood Mononuclear Cell 人外周血单个核细胞 PBS Phosphate buffered saline 磷酸盐缓冲液 PCR Polymerse chain reaction 聚合酶链式反应 PMSF

Phenylmethyl sulfonyl fluoride

苯甲基磺酰氟 RA Rheumatoid arthritis

类风湿性关节炎

RT-PCR

Reverse transciptase-Polymerase chain reaction

反转录聚合酶链式反应

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3Real-time

PCR

Real-time Polymerase chain reaction 实时定量PCR RPMI-1640

Roosevelt park memorial institute medium 1640 RPMI-1640 培养基 RNase Ribonuclease 核糖核酸酶

sec Second

秒 SD Standard

deviation 标准差 SDS-PAGE

Sodium dodecyl subphate polyacrylamide gel electrophoresis 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺 凝胶电泳 SLE

Systemic lupus erythematosus 系统性红斑狼疮 SS Sj?gren

Syndrome 干燥综合征 STAT

Signal transducers and activators of transcription 信号传导及转录激活因子 TACI Transmembrane

activator and calcium-modulator and cyclophilin ligand interactor 跨膜激活与CAML TAE Tris-acetate-EDTA(buffer)

Tris/乙酸/EDTA 缓冲液 TBE Tris-borate-EDTA(buffer)

Tris/硼酸/EDTA 缓冲液 TEMED N,N,N’,N’-tetramethyl

ethylene diamine N,N,N’,N’-四甲基乙二胺 TNF

Tumor necrosis factor 肿瘤坏死因子 Tris

Trihydroxymethylaminomethane 三羟甲基氨基甲烷 Tween-20 Polyoxyethylene-20-Sorbitan

Monolautate 吐温-20

第三军医大学研究生学位论文独创性声明

秉承学校严谨的校风和科研作风，本人申明所呈交的论文是我本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得我校或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料，与我同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。

申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。

论文作者签名： 日期： 第三军医大学研究生学位论文版权使用授权书

本人完全了解第三军医大学有关保护知识产权的规定，即：研究生在攻读学位期间论文工作的知识产权单位属第三军医大学。本人保证毕业离校后，发表论文或使用论文工作成果时署名单位为第三军医大学。学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。学校可以公布学位论文的全部或部分内容（保密内容除外），可以采用影印、缩印或其他手段保存论文。

论文作者签名：

指导教师签名：

日 期：

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姜黄素抑制BLyS表达的分子机制及其在抗类风湿性

关节炎中的作用

前言

类风湿性关节炎(Rheumatoid Arthritis，RA)是一种严重威胁人类健康的慢性炎症性疾病，该疾病会导致组织中的淋巴细胞或浆细胞浸润及血管翳的形成，造成关节强直、畸形、功能丧失而致残[1-3]，甚至还可能侵犯肺脏、免疫系统、神经系统等[3,4]。目前，RA的治疗措施主要是使用非甾体抗炎药(non-steroid anti-inflammatory drugs，NSAIDs)及免疫抑制剂，同时结合对症处理的外科治疗，但总体来讲，尚无特效疗法[5,6]。在RA的发病机制中，不仅涉及T淋巴细胞功能亢进及过度活化，而且B淋巴细胞的过度激活及功能亢进也有重要作用[7-9]。近年研究发现，RA患者的血清中BLyS 升高、关节滑膜中有大量浆细胞浸润及B淋巴细胞滤泡的形成，以B 淋巴细胞为靶标防治RA 等自身免疫性疾病的研究取得了一定的进展，B淋巴细胞在RA 发病机制中的作用越来越受到人们的重视[9-12]。而B淋巴细胞刺激因子(B lymphocyte stimulator，BLyS)的发现及其在RA等自身免疫性疾病中的作用为深入探讨RA的发生发展机制及寻找有效的防治措施提供了新的思路。

BLyS又称为TALL-1(TNF-and ApoL-related leukocyte expressed ligand 1)、BAFF(B cell activating factor belonging to the TNF family)、THANK(TNF homologue that activates apoptosis，NF-κB and JNK)、zTNF4等，是1999年发现的肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor，TNF)配体超家族的一个新成员[13,14]。BLyS主要由B淋巴细胞、单核细胞、树突状细胞等表达和分泌，在B淋巴细胞的分化、发育、抗体产生以及T淋巴细胞的活化及免疫应答中有重要作用[14-18]。若BLyS过度表达，将使自身反应性B细胞的产生增加及免疫应答失衡，导致RA等自身免疫性疾病的发生[19-22]。BLyS通过其不同受体介导后而发挥生物学效应，目前发现能与BLyS结合的受体有BAFF-R(BAFF receptor)、BCMA (B cell maturation antigen)及TACI (transmembrane activator and cyclophilin ligand interactor) [23-27]。

研究表明，BLyS过表达与RA的发生、发展有密切联系[9,10,28-30]：在RA患者血清中，BLyS水平升高且与炎症强度、自身抗体水平及RA因子滴度呈正相关[31,32]；在RA病人关节滑膜液中的BLyS水平也升高，并与关节局部的损伤程度呈正相关[33]；

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在RA小鼠模型中，重组BLyS抑制脾脏中B淋巴细胞的凋亡，BLyS在外周淋巴器官及血清中过表达并与自身抗体水平的升高具有一致性；此外，BLyS作为一个重要的炎性细胞因子，在RA患者中能与IL-6相互刺激及诱导，促使炎症反应持续而加剧RA的进程[30]。因此，若能抑制BLyS的表达或生物学效应，对RA的防治将具有重要意义。目前针对BLyS过表达所采用的措施主要是：以抗-BLyS抗体封闭BLyS的功能位点而抑制B淋巴细胞活化及抗体的产生；以BLyS的可溶性受体(与抗体的Fc段融合)抑制人B淋巴细胞NF-κB的激活、免疫球蛋白的产生及阻断T细胞的活化；以慢病毒表达的shRNA沉默关节内BLyS而抑制RA模型鼠中滑膜炎症及关节损伤，这些措施均是抑制BLyS生物学活性的发挥，而且还存在费用昂贵、不能口服、体内清除快等缺点[28,34,35]。因此，如果能阐明BLyS的表达调控机制，从转录水平抑制其表达，并基于其表达调控机制寻找新的防治措施，则可避免使用生物制剂带来的弊端，从而更有利于RA 的防治。近年来，姜黄素由于对诸多自身免疫性疾病相关基因的表达具有抑制作用而倍受关注，从而为研究BLyS的表达调控提供了新的研究方向。

姜黄素(Curcumin)是姜黄色素中的一种主要单体成分及最重要的活性成分，分子量为368.38，化学名为：1,7-双(4-羟基-3-甲氧基苯基)-1,6-庚二烯-3,5-二酮，其化学结构与二芳基庚酸类相似。诸多研究表明，姜黄素具有抗炎、抗氧化、免疫调节等广泛的药理作用[36-39]，在RA患者成纤维样滑膜细胞中，姜黄素能抑制前列腺素E2(PGE2)、环氧化酶2(COX-2)等的表达及AP-1、NF-κB等转录因子活性而发挥抗炎作用，且能下调抗凋亡分子Bcl-2及上调促凋亡分子Bax的表达而诱导细胞凋亡[40-44]；在兔关节炎的滑膜细胞中，姜黄素能抑制中性粒细胞活化、滑膜细胞增殖和血管发生[39]；在小鼠链球菌诱导关节炎(Streptococcal cell wall induced arthritis, SCW)模型中，姜黄素能有效的缓解模型小鼠的炎症进程[45]。但是，姜黄素在抗RA过程中是否与调节BLyS表达有关，目前尚未见报道。

既然RA等自身免疫性疾病与B淋巴细胞过度活化及功能亢进密切相关，而BLyS 在B淋巴细胞的异常活化中有重要作用，因而设法抑制BLyS的表达则可阻止淋巴细胞的活化，从而有可能为RA等自身免疫性疾病的防治提供新的候选措施。为此，我们探讨了姜黄素在基础水平及IFN-γ诱导情况下对BLyS表达的影响及其分子机制，并在小鼠CIA模型中探讨姜黄素对BLyS表达的影响及在抗RA中的作用。为阐明此问题，本课题开展了下列研究：(1)在B淋巴细胞中，以RT-PCR、Real-time PCR及Western blotting检测姜黄素对基础水平和IFN-γ诱导情况下的BLyS表达的影响；(2)详细解析姜黄素抑制基础水平BLyS表达的分子机制；(3)阐明姜黄素抑制IFN-γ诱导

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BLyS表达的分子机制；(4)在小鼠CIA模型上，检测姜黄素对BLyS表达的抑制作用及抗RA作用。结果表明，姜黄素可通过抑制NF-κB信号通路而下调基础水平BLyS 表达；可通过抑制JAK2-STAT1信号通路抑制IFN-γ诱导的BLyS表达；在小鼠CIA 模型中姜黄素可抑制体内的BLyS表达并有抗炎作用。通过本研究，旨在阐明姜黄素抑制BLyS表达的分子机制及生物学意义，为BLyS相关的自身免疫性疾病的防治提供新的候选措施。

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第一部分姜黄素可抑制基础水平BLyS的表达

在人B淋巴细胞中，以RT-PCR、Real-time PCR及Western blotting检测姜黄素对基础水平BLyS表达的影响；并借助报告基因检测(Luc)、EMSA、ChIP、激光共聚焦等技术，阐明姜黄素抑制基础水平BLyS表达的分子机制。

材料

一、质粒、菌种、细胞

1. 质粒pGL3/basic、pCMX-β-gal由本室保存

2. 大肠杆菌DH5α由本室保存

3. 人B淋巴细胞系Namalwa、Daudi购买于ATCC

二、主要试剂

1．RPMI-1640培养基(美国GIBCO公司)

2．胎牛血清(美国GIBCO公司，巴拉圭产)

3．TRYPTONE (英国OXOID公司)

4．YEAST EXTRACT(英国OXOID公司)

5．琼脂粉(上海生工公司)

6．Agrose(琼脂糖)(美国Invitrogen公司)

7．NaCl (上海生工公司)

8．HCl (成都科龙化工试剂厂)

9．无水乙醇(重庆川东化工公司)

10．NaOH (上海生工公司)

11．二甲基亚砜(DMSO) (美国SIGMA公司)

12．冰乙酸(成都科龙化工试剂厂)

13．甲醇(成都科龙化工试剂厂)

14．丙三醇(重庆西南化学试剂公司)

15．无水CaCl2 (立陶宛MBI公司)

16．Glycine (美国AMRESCO公司)

17．PCR引物由上海英俊公司合成

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1418． DNA 探针由上海生工公司合成

19． Cycle-Pure Kit (美国OMEGA 公司)

20． 胶回收Gel Extract Kit (美国OMEGA 公司)

21． 质粒小抽Plasmid Miniprep Kit (美国OMEGA 公司)

22． T 4 DNA Ligase (大连宝生物TaKaRa 公司)

23． Ex Taq (大连宝生物TaKaRa 公司)

24． SYBR Premix Ex Taq ? II (大连宝生物Takara 公司)

25． TaKaRa MutanBEST Kit (大连宝生物TaKaRa 公司)

26． DNA Marker DL-2000 (大连宝生物TaKaRa 公司)

27． 250bp DNA Marker (大连宝生物TaKaRa 公司)

28． 限制性核酸内切酶Kpn Ⅰ、Xho (Ⅰ大连宝生物TaKaRa 公司)

29． PMSF 粉末 (美国BBI 公司)

30． Triton X-100 (上海生工公司)

31． 低分子量蛋白标准Marker (立陶宛Fermentas 公司)

32． Tris-base (美国AMRESCO 公司)

33． SDS (美国SIGMA 公司)

34． 姜黄素(curcumin)(美国SIGMA 公司)

35． 尼龙膜 (瑞士Roche 公司)

36． PVDF 膜(美国MILLIPORE 公司)

37． MTT(美国SIGMA 公司)

38． Trizol(美国Invitrogen 公司)

39． M-MLV 逆转录kit(美国Invitrogen 公司)

40． 细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒(碧云天公司)

41． Western 及IP 细胞裂解液(碧云天公司)

42． BCA 蛋白浓度测定试剂盒(碧云天公司)

43． 抗荧光淬灭封片液(碧云天公司)

44． DAPI 染色液(碧云天公司)

45． 萤光素酶检测系统(普洛麦格生物技术有限公司)

46． β-Galactosidase 检测系统(普洛麦格生物技术有限公司)

47． ChIP Assay Kit (美国MILLIPORE 公司)

48． Lipofectamine? 2000(美国Invitrogen 公司)

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49．LightShift? Chemiluminescent EMSA Kit (美国PIERCE公司) 50．ECL 化学发光试剂盒(美国PIERCE公司)

51．Bay 11-7082 (美国SIGMA公司)

52．HRP标记的山羊抗小鼠IgG (北京中杉金桥公司) 53．HRP标记的山羊抗兔IgG (北京中杉金桥公司)

54．FITC标记的山羊抗小鼠IgG (北京中杉金桥公司) 55．FITC标记的山羊抗兔IgG (北京中杉金桥公司)

56．兔抗人BLyS抗体(英国abcam公司)

57．抗NF-κB p65抗体(美国Santa cruz公司)

58．抗β-actin抗体(美国Santa cruz公司)

59．抗Lamin B1抗体(美国Santa cruz公司)

60．抗IκBα抗体(美国Santa cruz公司)

61．抗磷酸化IκBα抗体(美国Santa cruz公司)

三、主要仪器

1．台式高速低温离心机(德国Heareus，Biofuge 15R型)

2．普通PCR仪(美国Bio-Rad公司 170-9703型)

3．Real-time PCR (美国Bio-Rad公司，IQ5型)

4．水平电泳装置(美国Bio-Rad公司)

5．凝胶成像系统(美国Bio-Rad公司，Universal Hood Ⅱ型) 6．凝胶成像Quantity One分析软件(美国Bio-Rad公司)

7．恒温摇床(上海福玛实验设备有限公司，KYC 100B型) 8．超净工作台(苏州安泰空气技术公司，SW-CJ-IF型)

9．超声碎菌仪(美国SONIC公司，Vc-505型)

10．低速水平离心机(上海安亭科学仪器厂，TGL-16G)

11．垂直电泳装置(美国Bio-Rad公司，Protein Ⅱ型)

12．紫外分光光度计(美国Beckman公司，DU-640型) 13．SUNRISE酶标仪(奥地利Tecan公司)

14．电子天平(德国Sartotius公司)

15．便携式紫外灯(江苏海门市其林贝尔公司，GL-9406型) 16．小型离心机(美国Sigma公司 1-1S型)

17．脱色摇床(江苏海门市其林贝尔公司，TS-1型)

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18．定时恒温磁力搅拌器(上海沪西分析仪器厂，90-2型)

19．恒温磁力搅拌器(上海沪西分析仪器厂，90-1 型)

20．旋转培养器(江苏太仓科教器材厂，WH-962型)

21．恒温金属浴(美国Thermo公司，CHB-202)

22．低温层析柜(美国Nuaire公司，LS-33-SDF型)

23．酶标仪-化学发光(美国Promega公司)

24．恒温培养箱-隔水式(上海福玛公司)

25．脱色水平摇床(江苏海门其林贝尔公司，TS-1 型)

26．漩涡混合器(上海沪西分析仪器厂，WH-2型)

27．细胞培养箱(Thermo公司)

28．纯水系统(Millipore公司)

四、常用试剂的配制

1. 液体LB培养基(100ml)：

胰蛋白胨1g

酵母提取物 0.5g

NaCl 1g

溶于90ml双蒸馏水，以NaOH调pH至7.2，定容至 100 ml，高压蒸汽灭菌20 min。

2. 固体LB培养基：在液体LB培养基中加入1.5%琼脂粉，然后高压蒸汽灭菌。

3. TBE电泳缓冲液(5×贮存液)：

Tris-base 54g

硼酸 27.5g

0.5M EDTA(pH8.0) 20ml

以双蒸水溶解后，定容至1000ml。

4. TAE电泳缓冲液(50×贮存液)：

Tris-base 121 g

冰乙酸28.6 ml

0.5 mM EDTA(pH 8.0) 50 ml，以双蒸馏水溶解后，定容至500ml。

5. SDS-PAGE 电泳缓冲液(5×贮存液)：

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17甘氨酸 9.4g

Tris-base 1.51g

10%SDS 5ml

以双蒸水溶解后，定容至100ml 。

6. 蛋白电泳上样缓冲液(6×贮存液)：

SDS 1g

Tris-HCl 1.5mM

甘油 3ml

溴酚蓝 1.2mg

DTT 0.93g

以双蒸水溶解至10 ml ，分装后－70℃保存

7. 蛋白转移缓冲液(1×工作液)：

甘氨酸 2.9g

Tris-HCl 5.8g

SDS 0.37g

以双蒸水溶解至10 ml ，使用前加入200ml 甲醇

8. 1.5 M Tris(pH8.8)：

以双蒸水溶解18.05gTris-base ，用HCl 调pH=8.8后定容至100ml ，灭菌后存室温。

9. 1.0 M Tris(pH6.8)：

以双蒸水溶解12.1g Tris-base ，以浓 HCl 调pH 至7.2，定容至 100ml 。

10. 溴化乙锭贮存液(10mg/ ml)：

在20ml 离子水中溶解0.2g 溴化乙锭，混匀后4 ℃避光保存。

11. 30%丙烯酰胺(291)∶：

29g 丙烯酰胺，1g N, N ′-亚甲基双丙烯酰胺，加热溶解后定容至100ml 并过滤除菌，置棕色瓶中存4℃备用。

12. 氨苄青霉素：

以无菌去离子溶解，配成50mg/ml 的储存液，过滤除菌，分装后-20℃保存。

13. DEPC 水：

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在100ml去离子水中加入DEPC100 μl，振荡混匀，置24h后高压灭菌存4℃备用。

14. 1%琼脂糖凝胶：

1g琼脂糖加入100ml 1×TBE中并加热融化，制胶时加入EB。

15. 10%SDS：

10g电泳级 SDS加热溶解后，以浓 HCl 调pH至7.2，定容至 100ml。

16.10%过硫酸铵：

0.1g过硫酸铵溶于1ml双蒸水，存4℃备用。

方法

一、检测姜黄素对B淋巴细胞系中BLyS表达的影响

(一) 以MTT检测姜黄素对人B淋巴细胞增值的影响

1. 人B淋巴细胞系Namalwa和Daudi的培养(自ATCC购买的细胞本室已保存)

(1) 预热水浴锅至37～39℃，自液氮中取出冻存细胞迅速置入其中并晃动，使冻存的细胞快速融化。

(2) 将细胞悬液室温800×rpm离心5min，弃冻存液。

(3) 以预热的RPMI-1640培养基(含100 U/ml青链霉素及10%胎牛血清)重悬细胞，吸入培养瓶中，置37℃培养箱中培养，5%CO2，条件下培养。

2. MTT检测

(1) 如上述培养Namalwa和Daudi细胞。

(2) 细胞处于对数生长期后，将细胞密度调整为1×10 4个/ml，制备为细胞悬液。

(3) 将细胞悬液接种于96孔板中，每孔150μl，继续培养6～8h至细胞恢复状态。

(4) 向96孔板中加入姜黄素，使其终浓度依次为1μM、10μM、20μM、30μM、50μM，每种浓度做三复孔。以DMSO为对照。

(5) 37℃，5% CO2的条件继续培养24h。

(6) 每孔加入MTT溶液(5 mg/ml )20μl，继续培养4 h，可见紫色结晶。

(7) 将96孔板以1,000×rpm/min，10 min离心，弃上清。

(8) 每孔加入DMSO150μl，低速振荡使紫色结晶溶解。

(9) 以酶联检测仪测A492，记录结果。

(二) 在人B淋巴细胞系中，以RT-PCR及Real-time PCR检测姜黄素对BLyS

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19mRNA 表达的影响

1. 细胞总RNA 的提取及逆转录

(1) 同上述条件培养Namalwa 和Daudi 细胞。

(2) 细胞处于对数生长期后，将细胞密度调整为1×106个/ml ，制备细胞悬液。

(3) 将细胞悬液接种于6孔板中，每孔2ml ，继续培养6～12h 至细胞恢复状态。

(4) 向6孔板中加入姜黄素，使其终浓度依次为1μM 、10μM 、20μM ，以DMSO 为对照。然后继续培养24h 。

(5) 1,000×rpm/min ，5 min 离心收集细胞，并以PBS 洗涤细胞一次。

(6) 以Trizol 法提取细胞的总RNA(按Invitrogen 公司Trizol 说明书的步骤进行)： ①向每个样品中加入Trizol 1 ml ，使细胞完全重悬并裂解，室温放置5min(也可置-70℃保存)。

②按1ml Trizol 加入0.2ml 氯仿的比例加入适量氯仿，剧烈振荡15sec 混匀，置室温5～10min 。

4③℃，12,000×g ，离心15min ，小心取上层水相于另一Ep 管中。

④加入等体积异丙醇，轻轻颠倒几次以混匀，置室温5～10min 。

4⑤℃、12,000×g 离心10min ，弃上清。

⑥加入DEPC 水配制的75%乙醇，4℃、8,000×g 离心5min 以洗涤沉淀。并重复洗涤一次。

⑦弃尽乙醇，室温干燥使乙醇完全挥发，然后加入20μl DEPC 水充分溶解RNA 。 ⑧以紫外分光光度计测量并计算RNA 浓度(OD 260)，并以OD 260/OD 280比值片段RNA 纯度。

(7) 以M-MLV 对总RNA 进行逆转录以合成cDNA(Invitrogen 公司产品)

①根据测定的总RNA 浓度，计算逆转录2.5μg RNA 时每样品所需体积。 ②按照下表对每个样品进行逆转录：

Total RNA

2.5μg Oligo(dT)18 (50 ng/μl)

1μl 10 mmol dNTPs

1μl ddH 2O up to12.7μl

65℃，5 min ，迅速置冰浴2 min ，然后加入：

5×Buffer

4μl

本文来源：https://www.bwwdw.com/article/tw0q.html