5湖南省2010年度人感染高致病性禽流感监测实施方案

湖南省2010年度人感染高致病性禽流感监测实施方案

为做好人感染高致病性禽流感（下简称“人禽流感” ）疫情防控工作，我国于2004年起在全国建立了不明原因肺炎病例监测系统，在发生人禽流感病例和/或动物禽流感疫情后开展了主动应急监测。上述监测系统对我国人禽流感病例的发现、调查、实验室确认以及疫情控制等方面发挥了重要作用。目前的监测结果表明，禽类接触史和访问活禽市场可能是人感染高致病性禽流感病毒的重要高危因素。2007年以来我省陆续在长沙市、株洲市、郴州市、常德市、永州市的部分县（市、区）选点开展了职业暴露人群高致病性禽流感监测项目工作，对监测感染来源、确定感染高危因素、部署人禽流感疫情防控工作提供了重要的科学依据，并已成为一项常规监测项目工作。

2009年我省流感监测网络已扩大到全省14个市州，各市州疾病预防控制中心流感实验室检测能力显著提高。按照上级要求，为进一步做好我省人禽流感监测工作，根据形势变化及时调整工作部署，特制订本方案。

一、监测目的

1、加强不明原因肺炎病例的发现、追踪、排查和疫情处理等工作，完善人禽流感监测系统，提高全省监测水平，及时发现人禽流感疫情。

2、了解我省职业暴露人群高致病性禽流感病毒（H5N1）的感染状况。 3、了解我省高致病性禽流感病毒在环境中的分布情况。 二、监测点的设置

全省14个市州疾病预防控制中心均开展本项监测工作。职业暴露人群人禽流感监测点按照监测场所分为四类，即：城乡活禽市场类、规模家禽（含水禽）养殖场类、农村家禽散养户集中地区类、野生候鸟栖息地类。每个市州监测其中两类，两类监测点可设在同一个县（市、区）范围内。为保证监测场所的覆盖，省疾病预防控制中心统一规划监测点设置，见表1。

表1 各市州职业暴露人群高致病性禽流感监测点分类设置要求

市 州 长沙市 株洲市 湘潭市 衡阳市 邵阳市 岳阳市 常德市 张家界市 益阳市 郴州市 永州市 怀化市 娄底市 湘西自治州

监测点分类

城乡活禽市场、规模家禽（含水禽）养殖场 城乡活禽市场、规模家禽（含水禽）养殖场 城乡活禽市场、规模家禽（含水禽）养殖场 农村家禽散养户集中地区、野生候鸟栖息地 农村家禽散养户集中地区、野生候鸟栖息地 规模家禽（含水禽）养殖场、野生候鸟栖息地 农村家禽散养户集中地区、野生候鸟栖息地 城乡活禽市场、农村家禽散养户集中地区 城乡活禽市场、野生候鸟栖息地

城乡活禽市场、规模家禽（含水禽）养殖场 农村家禽散养户集中地区、野生候鸟栖息地 规模家禽（含水禽）养殖场、野生候鸟栖息地 农村家禽散养户集中地区、规模家禽（含水禽）养殖场 城乡活禽市场、农村家禽散养户集中地区

发生过动物和/或人禽流感疫情的市州，优先在疫情发生地或其周边县（市、区）设立监测点。选定后，应记录监测点的基本信息，包括：整体环境特点，从业人员总体情况，禽类养殖、贩卖和屠宰等情况（规模、数量等），近期禽类免疫情况, 近期禽类发病情况，日常环境清洁和安全措施等。

三、监测内容和方法

（一）不明原因肺炎病例监测

1、按照《全国不明原因肺炎病例监测、排查和管理方案》，现场参与或指导县（区、市）疾病预防控制中心对所辖区域内报告的不明原因肺炎病例的调查、采样，筛查可能的SARS病例和人禽流感病例及其它传染性呼吸道疾病。

2、落实对聚集性不明原因肺炎病例的密切接触者登记、追踪和医学观察等防控措施。

3、病例相关标本应根据要求和需要送至具备相关检测条件的实验室开展检

测。14个市州疾病预防控制中心均应开展检测。标本采集后分装为一式三份，一份市州疾病预防控制中心检测，二份送省疾病预防控制中心供复核和上送国家流感中心。

4、全年开展不明原因肺炎病例监测工作。各市州分别于2010年4月、7月、10月中旬提交阶段小结（季度总结），2011年1月底前提交年度监测工作总结。

（二）职业暴露人群血清流行病学监测 1、监测对象

在设置的监测点内按照监测类型选择下列适当人群，每类监测点至少各监测100人,每个市(州)全年共计监测至少200名适宜对象：

（1）城乡活禽市场类：活禽批发市场、城乡农贸市场或菜市场中直接与禽类接触的人员。

（2）规模家禽（含水禽）养殖场类：家禽规模养殖场（户）中直接与禽类接触的人员。

（3）农村家禽散养户集中地区类：家禽散养户的家庭成员。

（4）野生候鸟栖息地类：野生候鸟栖息地中与候鸟或其排泄物有接触的人员。

2、监测时间

各监测点在每年冬春季开展监测工作。2010年3月底前完成监测对象的流行病学调查、标本采集等现场工作。标本采集后1个月内完成检测工作。

3、监测内容与方法 （1）流行病学调查

收集调查对象的基本情况、禽类接触史等内容，填写“职业暴露人群血清流行病学监测调查问卷”（见附表1），在实验室检测完成后1周内将血清标本及登记表、调查问卷（包括纸质表格和EpiData格式数据库）送省疾病预防控制中心流行病防治科、微生物检验科。。

（2）标本采集、运送

各市（州）疾病预防控制中心每年按照规定的监测类型至少采集200名适宜对象的血清标本(每个市州每个规定的监测类型至少100份)标本。采集监测对象的空腹静脉血5ml，填写“职业暴露人群血清标本登记表”（见附表2）。分离血清，无菌条件下分装为3份，其中1份由市（州）疾病预防控制中心在标本采集

完成后1个月内完成抗体检测，另外2份随同登记表送省疾病预防控制中心，由省中心复核并上送国家流感中心。血清标本应置－20℃或以下冻存，避免反复冻融。标本运输时遵守国家生物安全的有关规定。

（3）实验室检测

各网络实验室应用单放射免疫扩散溶血实验（SRH）和/或马血球血凝抑制实验（HI）进行 H5N1 抗体检测（见附件2）。标本采集后要求1个月内完成检测工作，填写“职业暴露人群血清流行病学检测结果表”（见附表3），检测结束后1周内将检测结果和需上送的标本一起提交省疾病预防控制中心流行病防治科、微生物检验科，由省疾病预防控制中心汇总后统一上报国家流感中心。

国家流感中心应用微量中和实验（MN）对全部阳性标本和随机抽取的5%阴性标本进行复核，并向各网络实验室及时反馈复核结果。

（三）职业暴露人群病原学监测

各监测县要加强对职业暴露人群的健康教育和主动监测。对职业暴露人群中出现的流感样症状患者，应教育其向乡镇卫生院、疾病预防控制中心报告。所在地的县级疾病预防控制中心应及时采集其相关标本，并及时送市（州）疾病预防控制中心开展实验室检测工作。通过此项工作的开展，在我省逐步建立职业暴露人群病原学监测工作体系。标本信息、检测结果均应录入“中国流感监测信息系统”，“标本来源”归类为“其他”，“采集医院”则选择到病例所在的乡镇卫生院。在确保生物安全前提下，有条件的网络实验室应对季节性流感病毒核酸阳性或甲型H1N1流感病毒核酸阳性标本开展病毒分离工作，并按相应要求及时报告和上送毒株。

（四）环境标本高致病性禽流感病原学监测 1、监测对象

职业暴露人群血清流行病学监测点的水、禽类（含候鸟）粪便及笼具表面等环境标本。

2、监测时间

全年监测，每年的1、4、7、10月各采集标本1次。2010年1月标本到2011年1月补采。避免在监测点消毒后2日内开展标本采集。

3、监测方法 （1）标本采集

各市州疾病预防控制中心每个季度采集标本1次，每个监测县每次共采集各

类标本至少10份（应分布在不同场所）,每个市州每季度完成至少20份，同时填写“环境标本采样登记表”（附表4）。标本采集种类及方法见附录1。

（2）标本运输、处理

标本采集后应在4℃条件下48小时内运送至市（州）疾病预防控制中心实验室。实验室收到标本后应立即进行标本处理（见附录1），并将标本分为3份，1份由市（州）疾病预防控制中心进行核酸检测，另外2份标本每个季度随同“环境标本采样登记表”（附表4）和“环境标本病原学检测结果表”（附表5）送省疾病预防控制中心，由省中心复核并上送国家疾病预防控制中心。。留样标本要求在－70℃或以下冻存。标本运输时遵守国家生物安全的有关规定。

（3）实验室检测

各市（州）疾病预防控制中心实验室收到标本后1周内对标本进行A型流感病毒核酸检测，A型流感病毒核酸阳性标本进一步进行H5N1亚型检测，填写“环境标本病原学检测结果表”。对于所有A型流感病毒核酸阳性的标本，各监测网络实验室在完成检测后24小时内将检测结果报告省疾控中心，并及时将标本送省疾病预防控制中心进行复核。国家流感中心将对全部阳性标本进行复核，并在标本收到后48小时及时向省疾控中心及网络实验室进行反馈。

四、数据收集及结果报送

省疾病预防控制中心负责编写、下发统一的EpiData数据库（附表1～附表5）。市州疾病预防控制中心负责组织各监测点相关数据录入工作，严格按照双录入的要求统一录入，数据经核对校验无误后以电子邮件方式按时报省疾病预防控制中心流行病防治科（邮箱：hncdclbk@163.com）。相关纸质表格也应一并报送省疾病预防控制中心。

五、职责分工及组织实施 （一）省疾病预防控制中心

1、制定本省的实施方案，负责监测工作的实施，包括监测点的选择、监测人员的技术培训和指导，以及数据收集整理和统计分析。

2、对各市州、各监测点工作情况定期或不定期进行督导、考核及评估。每个监测年度结束后，向中国疾病预防控制中心提交全省的监测工作报告。

3、及时向各市州反馈国家流感中心对相关标本的复核检测结果。 （二）各市州疾病预防控制中心

1、负责监测工作的实施，包括监测场所的选择、人员的技术培训和指导、标本的采集以及数据收集、整理、录入、上报和分析。

2、对采集标本进行实验室检测，并及时提交检测结果。按监测方案的要求及时上送各类标本进行复核。

3、5月底前将监测点基本信息、职业暴露人群血清流行病学监测结果及工作总结报省疾病预防控制中心流行病防治科、微生物检验科，省疾病预防控制中心汇总后报国家流感中心。

4、2011年1月底前向省疾病预防控制中心提交2010年度监测项目工作总结。

（三）监测点所在县（市、区）疾病预防控制中心

在市州疾病预防控制中心的指导下，积极配合、参与监测项目有关工作。所承担具体工作任务由各市州疾病预防控制中心确定。

六、考核和评估

卫生部、中国疾病预防控制中心将对各省、各监测网络实验室监测工作进行年度考核、评估。

在省卫生厅的组织领导下，由省疾病预防控制中心制定方案并具体实施对各市州的考核、评估。各地工作开展情况和考核评估结果在《湖南疾病监测质量月报》上公布。

七、附表和附录

附表1、职业暴露人群血清流行病学监测调查问卷 附表2、职业暴露人群血清标本登记表 附表3、职业暴露人群血清学检测结果表 附表4、环境标本采样登记表 附表5、环境标本病原学检测结果表 附录1、标本的采集、处理、保存与运输 附录2、实验室操作方法简介

附录3、湖南省流感监测网络实验室编号规则

附表1、职业暴露人群血清流行病学监测调查问卷

省市县编码□□□□□□ 血清标本编号 B□□□□□□□□□ 一、一般情况

1、姓名： （电话： ） 2、性别： ①男性 ②女性 3、年龄： 周岁

4、现住址：

5、职业： ①幼托儿童 ②散居儿童 ③学生（大中小学） ④教师 ⑤保育

10民工 ○11农民 ○12牧员及保姆 ⑥餐饮食品业 ⑦商业服务 ⑧医务人员 ⑨工人 ○

13渔14干部职员 ○15离退人员 ○16家务及待业 ○17其他 ○18不详 民 ○（船） 民 ○

二、暴露情况（可多选）

6、职业暴露人群种类：①散养户 ②规模化养殖场从业人员 ③活禽批发市场人员 ④农贸市场或菜市场活禽交易人员 ⑤家禽屠宰加工厂人员 ⑥野生候鸟栖息地接触鸟类人员 ⑦其他 7、暴露方式：

①喂养 ②清扫禽舍 ③加工（宰杀、拔毛、洗切、腌制、烹饪） ④食用 ⑤捕杀 ⑥运输 ⑦捕捉 ⑧销售 ⑨其他 8、如为养殖人员，禽类养殖方式：

①鸡 羽 1）散养 2）圈养

②鸭 羽 1）散养 2）圈养 ③鹅 羽 1）散养 2）圈养 ④鸽子 羽 1）散养 2）圈养

⑤其他 羽 1）散养 2）圈养 9、近一个月来，接触禽种类：

①鸡 ②鸭 ③鹅 ④鸽子 ⑤野禽 ⑥其他

10、所接触的禽类是否接种过禽流感疫苗？ ①是 ②否 ③不详 11、近一个月以来，是否接触过病死禽？ ①是 ②否 ③不详 （1）病死禽种类： ①鸡 羽 ②鸭 羽 ③鹅 羽

④鸽子 羽 ⑤其他 羽 （2）接触方式为： （可多选）

①喂养 ②清扫禽舍 ③加工（宰杀、拔毛、洗切、腌制、烹饪） ④食用 ⑤捕杀 ⑥运输 ⑦捕捉 ⑧其他 （3）接触病死禽时是否有防护措施？ ①是 ②否 ③不详 如果有，采取的措施有： （可多选）

①戴口罩（N95口罩、过滤口罩、棉纱口罩、一次性外科口罩） ②戴面罩 ③穿防护服（规范、不规范） ④防护眼镜 ⑤手套 ⑥帽子 ⑦白大衣 ⑧其它

（4）接触病死禽的持续时间： 天（ 月 日到 月 日）

累计暴露： 小时

12、近1个月是否出现过发热？ ①是 ②否 ③不详

（1）发热起始时间 月 日，共持续 天，最高体温 ℃ （2）发热时是否伴有其它不适症状？ ①是 ②否 ③不详 出现症状起始时间 月 日，共持续 天，主要症状有：

①头痛 ②咽痛 ③鼻塞 ④肌肉酸痛 ⑤腹痛 ⑥腹泻 ⑦其它 13、近1年是否接种过流感疫苗？ ①是 ②否 ③不详

调查人员单位： 调查人员： 调查日期： 审核人员： 审核日期：

附表2、职业暴露人群血清标本登记表

采集地点 ： 县（市、区） 乡（镇） 标本编号 姓名 年龄 性别 现住址 采样日期 标本量 备注

注：1.采集地点：填写标本采集地的禽类场所名称

2.标本编号原则：（1）血清标本代号 ：B

（2）年份：10，表示2010年 （3）网络实验室流水号，见附录3 （4）实验室标本编号 从001开始

例如：长沙市疾病预防控制中心标本 B1055001

岳阳市疾病预防控制中心标本 B104306001

采集人： 采集单位 ： 送检日期：

附表3、职业暴露人群血清流行病学检测结果表

检测单位 ：

1.检测方法：马血球HI（ ）、SRH（ ）

2.使用抗原： 参考血清名称： 3实验结果

检测结果 标本编号 HI滴度 SRH直径 标本状态 备注 注： 标本状态：溶血，乳糜血，黄疸，血清少

检测者： 检测日期： 复核者：

附表4、环境标本采样登记表

采集地点 ： 县（市、区） 乡（镇） 村（居委会）

标本编号 采集日期 采集地点 标本种类 备注

注： 标本编号原则：（1）环境标本代号： C

（2）年份：10，表示2010年 （3）网络实验室流水号，见附录3 （4）实验室标本编号：从001开始

例如：长沙市疾病预防控制中心标本 C1055001

岳阳市疾病预防控制中心标本 C104306001

采集人： 采样单位 ： 送检日期：

附表5、环境标本病原学检测结果表

检测单位 ：

采用的检测方法：One-step PCR： Real time PCR： 1. One-step 试剂盒 2. Real-time 试剂盒： 3. 引物来源： 4. 检测结果 标本编号 采样日期 检测结果 A型 B型 H5 N1 其他 阴性 备注

操作者： 检测日期： 复核者：

附录1、标本的采集、处理、保存与运输

一、标本采集与处理 1. 血清标本

取真空负压采血管，做好标记，采集监测对象空腹静脉血5mL。然后置于室温数小时待血完全凝固。1500rpm～2000rpm离心10min，收集血清分装于3支带外螺旋盖的冻存管中，做好标记。

2. 环境标本

环境标本采样液可使用Hank's或Eagle's等培养液加入以下抗菌素和0.5%BSA：氨苄青霉素(2x106 IU/L)、链霉素(200mg/L)、多粘菌素B(2x106 IU/L)、庆大霉素(250mg/L)、制霉菌素(0.5x106 IU/L)、盐酸氧氟沙星(60mg/L)、磺胺甲基异恶唑(0.2g/L)。

标本采集后应在4℃条件下48小时内运送至流感监测网络实验室。实验室收到标本后应立即进行标本处理。每份原始标本分装成三份，1份用于本实验室的核酸检测，1份送省疾控中心复核，1份备送国家流感中心复核。要保证送国家流感中心的标本足量：水标本不少于3ml，拭子标本不少于2ml。

各网络实验室收到标本后1周内完成对标本的核酸检测，首先进行A型流感病毒核酸检测，对于A型阳性标本需进一步进行H5N1亚型检测。

（1）水标本

在禽类活动或笼具旁的水沟或水池的不同部位共收集水标本15-20ml置于50ml外螺旋盖的管内。水样标本到实验室后应在采样管中加入上述抗生素和0.5%BSA，再进行分装。呼吸道和环境标本要在无菌条件下反复吹打收集的溶液，以便打碎粘液和固体，置4℃待其自然沉淀5～10min，取上液分装。分装好留1份进行核酸检测。

（2）笼具表面标本

用沾有采样液的带有聚丙烯纤维头的拭子擦拭笼具表面3-5个不同部位，然后将擦拭过的拭子放入含5ml采样液的采样管中，尾部弃去。分装前务必充分震荡。

二、标本保存和运输 1．标本保存

血清标本可置4℃存放3天，存放超过3天需置-20℃或以下保存。 环境原始标本可置4℃存放2天，存放超过3天需置-70℃或以下保存。环境阳性标本至少保存1年，阴性标本至少保存6个月。

2. 标本运输

各网络实验室在完成检测后1周内将原始样本送省疾病预防控制中心微生物检验科复核。运输中，标本应放入专用运输箱内（或疫苗冷藏包），放入冰排，然后以柔软物质填充，内衬具吸水和缓冲能力的材料。同时寄送标本登记表。运输要求符合国家生物安全有关规定。病原学标本按B类感染性物质进行运输，航空采用UN3373包装。

三、湖南省疾病预防控制中心标本接收单位和联系方式

联系电话：0731－84305932

传真：0731－84305931 结果提交邮箱：hncdclbk@163.com

附录2、实验室操作方法简介

一、马红细胞血凝抑制试验检测禽流感抗体 （一）生物安全要求

禽流感H5N1亚型检测抗原的灭活需要在BSL-3 级实验室进行。其余操作均在BSL-2级实验室进行。

（二）材料

1．抗原：灭活的H5N1流感病毒。

2．血清：（1）阳性对照血清；阴性对照血清（2）待检血清 3．其他主要试剂：

（1）马红细胞（1:1的比例保存于阿氏液中，建议采血后72小时内使用）（2）磷酸盐缓冲液（PH 7.2 PBS）：0.01M；（3）牛血清白蛋白（BSA）；（4）霍乱滤液（RDE）

4．其他：

（1）“V” 型96孔微量板 （2）37℃及56℃水浴锅 （3）台式离心机 （4）多道可调加样器 （5）离心管 （三）质量控制 1、对照血清

每块96孔板上均需要设立阳性对照和阴性对照，同批次的阳性对照结果 滴度应保持2倍以内。 2、红细胞对照

实验可根据红细胞对照来判断反应时间，尽可能在每块96孔板上设计一 孔红细胞对照（PBS+1%红细胞悬液）。 3、病毒回滴

一个红细胞凝集单位指能引起等量标准化的红细胞凝集时病毒的量。进行红细胞凝集抑制试验时一般用4个红细胞凝集单位（指25μL体积中含有4个红细

胞凝集单位）的病毒量。

（四）实验步骤 1、血清处理

（1）用单道加样器吸出1体积血清置于无菌Eppendorf管内，换滴头加入4体积RDE，吹打混匀。

（2）置37℃水浴16～18h。

（3）从37℃水浴取出后置56℃水浴30min灭活。

（4）马红细胞吸附：瞬时离心，待冷却后加入清洗后的浓红细胞达20%（每100μLRDE处理过的血清加入20μL清洗后的浓红细胞）。混匀后室温吸附1 h。

（5）2000rpm离心5min。

（6）小心吸取上清液至干净离心管中备用。如不需立即检测可放4℃保存。 2．马红细胞的采集及1%马红细胞悬液的配备

（1）在注射器里放入一定体积的阿氏液，从颈静脉处采集马血后放入容器中，轻柔混匀，如阿氏液不足则需补足（阿氏液和红细胞的比例为1:1）。

（2）采集的马红细胞应放入冰箱4℃保存，越新鲜越好，建议在采集后72小时内使用。

（3）在配置1%马红细胞悬液前需清洗红细胞液。首先加入5mL红细胞（沉积在容器底部的红细胞）至50mL离心管。加入45mL PBS-0.5% BSA使总体积达到50mL，轻柔混匀。

（4）2000rpm(600×g) 离心5 min。

（5）吸掉上清液后，连续重复步骤（3）-（4）两次。

（6）为了精准马血球的浓度，取浓缩后的马血球1ml于1.5ml离心管中，3600g（8000rpm）离心10min，吸取压缩后血球的上清并统计出吸取上清的体积，计算实际的血球百分比（一般达到未压缩前体积的60-75%）。将完全压缩后的马血球弃去。

（7）计算最终的血球量使浓度达到完全压缩后的1%，取所需洗好马血球的体积加入PBS-0.5% BSA中，每次用前轻轻混匀后使用。

3．制备用于红细胞凝集抑制试验的4个红细胞凝集单位的抗原

（1）将微量板横向放置：垂直方向称列，如孔A1～H1称为第一列；平行

方向称行，如A1～A12称为A行。标记好标准诊断抗原及加样顺序。

1）吸取50μL PBS加入微量板的第二列至最后一列，于第一列加入100μL标准诊断病毒。

2）从第一列取50μL病毒液，依次从第二列至第八列做2倍系列稀释。最后一列每孔弃去50μL稀释后的病毒液。

3）每孔加入50μL 1%的红细胞悬液，轻弹微量板，使红细胞与病毒充分混合。

4）室温孵育45～60min，观察红细胞凝集现象并记录结果。

5）结果判定：红细胞凝集滴度的判定以出现完全凝集的最高稀释度为终点，其稀释度的倒数即为病毒的红细胞凝集滴度。红细胞完全凝集以“+”记录；无凝集或部分凝集“-”记录。

（2）制备4个红细胞凝集抗原时：首先计算出红细胞凝集抑制试验所需的病毒抗原的总量。如每份血清作8孔稀释，每孔用抗原25μL抗原，那么测定一份血清需0.2mL抗原。根据参比血清的份数计算出实验所需病毒抗原量，然后配制抗原。

（3）计算出病毒稀释度。用病毒红细胞凝集滴度（HA滴度）除以8，得到的商即为4个红细胞凝集单位的稀释度。如，某病毒的HA滴度为64，除以8等于8。按1:8（1mL病毒液加7mL PBS）稀释该病毒即可得到4个凝集单位/25μL的抗原病毒量。

（4）为了保证红细胞凝集抑制试验中抗原用量一致并且准确无误，新配制的4个凝集单位抗原须复核滴定：取50μL稀释好的抗原，用等量PBS做倍比稀

释（同病毒滴定）后加入50μL红细胞悬液，至室温孵育45～60min后观察凝集结果。如只有前4孔出现凝集，表明每50μL病毒含有8个凝集单位（即25μL中含有4个红细胞凝集），该病毒稀释准确，可以用于红细胞凝集抑制试验。如第5孔也出现凝集，说明每50μL病毒含有16个凝集单位，该抗原必须等量稀释。如只有前3孔凝集，表明每50μL病毒仅含有4个凝集单位，病毒量需要加倍。此外，4个凝集单位抗原必须每次用前新配制。

4．红细胞凝集抑制试验（HI）检测血清抗体

将微量板横向放置：垂直方向称列，如孔A1～H1称为第一列；平行方向称行，如A1～A12称为A行。标记好待检病毒的实验室编号及加样顺序。

（1）每孔加入25μL PBS。

（2）A1加入25μL标准诊断血清作为阳性对照；A2加入25μL H5N1阴性血清作为阴性对照。

（3）自A3孔开始分别加入25μL待检血清；

（4）用多道加样器吸取25μL血清（A1-A12），由A行至H行做2倍系列稀释血清，至H行后弃去25μL。系列稀释时需注意每一次稀释都应混合均匀。

（5）加入25μL含4个凝集单位的抗原。 （6）混匀后室温孵育30min。

（7）每孔加入50μL 1%马红细胞悬液，轻弹微量板，使红细胞与病毒充分混合。

（8）室温孵育45-60min，观察红细胞凝集抑制试验结果。 （9）结果判定

当特定的抗体与相应的红细胞凝集抗原结合后，可以抑制病毒引起的红细胞凝集现象。红细胞凝集抑制效价是指抑制红细胞凝集出现时血清的最高稀释度的倒数。如1:80稀释的血清孔不出现凝剂（红细胞凝集完全抑制），1:160稀释的血清孔出现凝集（无红细胞凝集抑制），该血清对测定病毒的红细胞凝集抑制效价为80。人血清对H5N1抗原的抑制效价≥1:160可判定为阳性（参考WHO推荐标准），但还需要用另一种血清学方法验证。

二、流感/禽流感单放射免疫扩散溶血技术抗体检测 （一）生物安全要求

抗原的制备和血清灭活根据所从事病毒的种类在相应的生物安全级别实验室进行，SRH检测在生物安全二级（BSL-2）实验室进行操作。

（二）材料 1．Alsever’s 液 2．pH 7.2 PBS缓冲液

3．10%叠氮钠（sodium azide， NaN3）溶液 4．5×10-4mol/L KIO4（过碘酸钾）溶液

11.5 mg KIO4加入pH7.2 PBS 溶液至100mL，完全溶解后置4℃保存。 5．1%琼脂糖 6．1%鸡红细胞悬液

7．浓鸡红细胞（洗涤后去掉上清的鸡红细胞） 8．补体的制备

至少6只健康成年豚鼠，采血前一天下午禁食，第二天上午从心脏采血，每只可采5～10mL，每只采完后速至冰上，多只豚鼠血清混匀后使用，当天分离血清，分装，置-70℃冰箱中保存。由于补体耐热性差，因此，操作时尽量在4℃条件下进行。

9．抗原

一般采用接种鸡胚尿囊腔后收获的流感/禽流感病毒液，甲醛灭活的病毒需在-70℃中保存，并且注意避免反复冻融。

10．参比血清

抗H5N1病毒兔血清及普通流感病毒参比兔血清。

11．测定血清

血清检测前56℃ 30min灭活去除血清中不耐热的非特异性抑制素和补体；血清从56℃水浴箱中取出，置室温冷却，每管加终浓度为20%的浓鸡红细胞，混匀，置室温1h或4℃过夜，1500rpm离心10min，弃沉淀物，留上清。红细胞吸附的目的是去除人血清中可能含有对鸡红细胞的嗜异性抗体（Forssman’s antibody）。

12．免疫扩散板

13．打孔器，孔径为2mm和3mm的打孔器。 14．小烧杯，带盖的可装扩散板的塑料盒。

15．测量放大镜（带有每个刻度0.1mm的刻度尺）或一般透明并带刻度的尺子。根据测量的溶血圈直径，可按下列公式计算出溶血圈面积（S）：

S1=πR12 S2=πR22 S=S1-S2

如用3mm孔径，测量的溶血圈直径为8mm，代入上述公式就可算出溶血圈面积：S1=πR12 = π×42=3.1416×16=50.27（mm2）

S2=πR22=π×1.52=3.1416×2.25= 7.07（mm2） S=S1-S2=50.27-7.07=43.20 （mm2） （三）实验步骤

1．病毒抗原红细胞凝集滴度的测定及1000个红细胞凝集单位计算 （1）病毒抗原红细胞凝集滴度的测定

采用鸡血球，按常规流感病毒96孔微孔板进行病毒滴度测定。 （2）1000个红细胞凝集单位计算

根据红细胞凝集滴度算出1000个红细胞凝集单位所需测定病毒的量。如病毒滴定时红细胞凝集滴度为64，则按下列公式计算：

0.05:64=x:1000, x =（0.05×1000）/64=50/64=0.78（mL）

也就是说，每0.1mL浓的鸡红细胞中需要加入0.78mL测定的病毒溶液。按这个比例算出实验所需的病毒量。

2．溶解1%琼脂糖并恒温于60℃水浴箱中。

使用PH7.2 的PBS同时加入1‰NaN3以防止细菌生长。煮沸或者用微波炉使1%琼脂糖完全溶解，速置60℃水浴箱中，分装于小烧杯中，2.9mL/杯，置60℃水浴箱中。根据工作量计算出所需烧杯的数量。

3．红细胞处理

按每块扩散板需50μl 浓的鸡红细胞，计算出工作中所需的浓红细胞容量，将所需的浓鸡红细胞放入带尖底的15mL离心管中，加入等容量的5×10-4 mol/L KIO4，混匀，置室温15min。 KIO4处理的目的是使病毒吸附到红细胞表面后不会游离下来。

4．加病毒抗原

按每0.1mL 浓鸡红细胞需1000个红细胞凝集单位病毒抗原的比例，加入KIO4处理过的红细胞，混之，置室温10min，1500rpm离心3min，弃上清，用至少5倍量于沉淀物的pH7.2 PBS冲洗，1500rpm离心10min，弃上清，加入与红细胞等量的pH7.2 的PBS。

5．把所需的扩散板平排好，并标明标记。 6．溶血板制备

用吸管将步骤中红细胞轻轻吹匀，而后吸出100μL放入恒温在60℃水浴箱中含2.9mL琼脂糖的烧杯，置水浴中摇匀，而后迅速倒入扩散板中，并迅速用烧杯铺平之。待第一块板铺完后，按同法铺第二块板，直至全铺完。溶血板凝固后应为红细胞均匀分布的透明凝胶板，若出现芝麻样颗粒、浓淡不均的血丝等，均应重新进行铺板。

7．打孔

待琼脂糖完全凝固（一般置室温15~20min）后打孔，诊断用打3mm直径孔，血清流行病学调查打2mm直径孔。打完后用针头将孔中琼脂挑出，然后盖上板盖。

8．加样

孔径3mm的一般10μL/孔，孔径2mm的为4~5μL/孔，每批实验必须要有阳性和阴性血清对照；配对血清应在同一板上进行，以便减少板间的误差。

9．扩散

当每块板加完样本，马上盖上板盖。待全部板加完样本并盖上板盖，平放在

带有湿度的盒子中，置4℃冰箱扩散16～18h。

10．加补体

补体从-70℃冰箱取出，用自来水龙头冲之，让其速溶。溶后速置冰上，用冷的pH 7.2 PBS进行1:3或1:4稀释，即1mL补体稀释成3mL或4mL。将扩散板从冰箱取出，平放实验桌上，每板平铺稀释好的补体1mL，平放带有湿度的盒中，无需板盖，平放35~37℃ 孵箱4h。正常红细胞对照板，除病毒用pH7.2 PBS替代外，其余操作步骤完全与实验板相同。

11．结果观察和判断

4 h以后，从孵箱中取出，倒掉补体，进行结果观察。

（1）阳性对照血清应出现清晰，而不是模糊或不透明的溶血圈，并溶血圈面积比预实验的不能相差1.5倍或以上；阴性对照血清不应出现任何溶血圈。

（2）正常红细胞对照板不应出现任何溶血圈。

（3）恢复期血清溶血圈面积应为急性期的≥2倍表示有意义的差异；两者相差＜1.5倍为实验误差；两者相差1.5倍或以上但不到2倍，需重复测定，如仍相差1.5倍或以上但不到2倍，可判为有意义差异。如重复测定相差为＜1.5倍，表示为实验误差。

不配对血清测定时，2mm孔径的，溶血圈直径需≥4mm（溶血圈面积≥9.42mm2）；3mm孔径的，溶血圈直径需≥5mm（溶血圈面积≥12.57mm2）可认为是阳性血清。

12．注意事项

（1）抗原量一定要掌握准确，量过大一方面使测定敏感性下降，另一方面由于过量的病毒颗粒吸附在红细胞表面，红细胞不易吹散开，铺板时易出现芝麻样颗粒，过少的红细胞溶解不清晰或不溶解。

（2）血清尽量避免反复冻融，因反复冻融会产生抗补体影响溶血圈的清晰度。

（3）双份配对的血清应在同一块板上进行测定，以便避免板间的误差。 （4）阳性对照血清，有时由于滴度过高，出现很大的溶血圈，把邻近的孔覆盖，因此，最好靠近它的孔不加样本或将阳性血清进行适当稀释，如1∶5稀释，而后使用之。

（5）对患者进行血清学诊断时，建议用3mm孔径的孔，因用2mm孔径有时会出现重叠溶血圈影响结果准确的判断。进行血清流行病学调查时建议用2mm孔径。

（6）测量溶血圈直径时，应测量最清晰的，因标准的溶血圈常为靠近孔边缘出现清晰透亮的溶血圈，它的外围出现不十分清晰的溶血圈，此溶血圈外围又有个清晰的溶血圈，这是要测量的直径。测量时，尺子要挨在扩散板上。

（7）正常红细胞对照板所出现的溶血圈面积与实验板几乎一样大小，表明嗜异性抗体未完全去除干净，应再用鸡红细胞进行再吸附来去除之；如对照板所出现的溶血圈面积比实验板小2倍或以上，一般不影响对实验结果的判断。

（8）琼脂糖最好用高纯度，低熔点，在有效期内，新鲜配制的，配好后保存期不超过一个月，因保存期过长，铺板时易造成琼脂板出现裂缝。

（9）一定要加1‰NaN3以防止细菌生长，因细菌会造成非特异性溶血。 （10）温度一定要控制好，因补体不耐热，操作补体时间尽量要缩短，并在4℃下操作；补体一定为≥6只豚鼠的混合血清。

（11）禽类血清不结合豚鼠补体，不应用鸡的抗血清作为阳性对照血清。 （12）如缺乏时间对实验结果进行观察和测量，可将实验板置4℃冰箱，至少一星期进行测量不影响实验结果；溶血板制备完后，平放带湿度的盒中，置4℃冰箱，最长只能存两星期。

三、A型流感病毒RT-PCR检测

（一）生物安全要求

分装标本、裂解病毒需在BSL-2级实验室生物安全柜内操作。核酸检测区域要分出试剂配制、核酸提取、扩增、检测的不同分区。

（二）主要材料

1．提RNA Kit：QIAGEN RNeasy Mini Kit （catalog #74104） 2．β－巯基乙醇（SIGMA β-Mercaptoethanol Lot 062K0115） 3．70％乙醇

4．RT-PCR Kit：QIAGEN One step RT-PCR Kit（catalog #210212） 5．Promega RNasin Ribonuclease Inhibitor （catalog #N2111）

6．检测引物：Forword and Reverse Primers（均为10μM），序列如下：

类型 甲型通用

（三）实验步骤 1．RNA提取

FluA-M-F30 FluA-M-R264 序列 5’- TTC TAA CCG AGG TCG AAA CG -3’ 5’- ACA AAG CGT CTA CGC TGC AG -3’ （1）根据标本数量分装RLT液：从Kit中取出RLT液，用1.5mL离心管分装，每管500μL（在体系配制区操作）。

（2）加标本100ul到裂解液中。

（3）每管分别加入5μL β-巯基乙醇，混匀后依次加入600μL 70%的乙醇，充分混匀。

（4）从Kit中取出带滤柱的2mL收集管，打开包装将其做好标记。取步骤2中的混合液600μL加入滤柱中，12000rpm，离心15s，弃收集管中的离心液。

（5）滤柱仍放回收集管上，将步骤2剩余的混合液全部吸入滤柱中，12000rpm，离心15s，弃离心液。

（6）于滤柱中加入700μL Wash Buffer RW1液，12000rpm，离心15s。 （7）从QIAGEN RNeasy Mini Kit中取一支干净的2mL收集管，将离心后的滤柱移到新的收集管上，于滤柱中加入500μL Wash Buffer RPE液，12000rpm，离心15s。

（8）弃收集管中的离心液，再于滤柱中加入500μL Wash Buffer RPE液，13000~14000rpm，离心2min。

（9）将滤柱移到一个干净的1.5mL eppendorf管上，向滤柱中加入30~50μL的Rnase-free Water，室温静置1~3min。

（10）12000rpm，离心1min，收集离心液即为提取的病毒RNA，立即做实验或-20℃以下保存。

注意：Buffer RPE使用之前加无水乙醇。 2．反应体系配制

（1）实验设计：检测标本RNA时，阴性对照用无菌水，阳性对照用已知

病毒RNA。

（2）PCR反应体系配制（在体系配制区配反应液）

组 分 5×RT-PCR Buffer 10mM dNTP Mixture RT-PCR Enzyme Mix RNase Inhibitor 上游引物 下游引物 RNase Free Water Total

体 积（μL） 5×n 1×n 1×n 0.1×n 0.5×n 0.5×n 11.9×n 20×n

2）将上述反应液混匀，分装到0.2mL PCR小管中，每管20μL，分别做好标记。

3）加RNA模板（在核酸提取区）

将上述分装好的PCR小管分别加入模板。首先加入阴性对照管（5μL无菌水），然后分别加标本RNA（每管5μL），最后加入阳性对照RNA（每管5μL）。

（3）RT-PCR

将上述加好模板的反应管混匀，短暂离心后放入PCR仪进行RT-PCR 扩增，反应程序如下：

1）60℃作用1min， 2）42℃作用10min， 3）50℃作用30min 4）95℃作用15min， 5）94℃变性30s， 6）50℃退火30s， 7）72℃延伸1min，回到第5步，34个循环， 8）72℃作用10min， 9）4℃ 保存

（4）RT-PCR产物检测：

1）将制备好的1.5％琼脂糖凝胶入电泳槽（带梳子孔的一端在阴极），倒入电泳液（1×TBE）浸过胶面即可。

2）PCR产物各取10μL，加入2μL上样缓冲液（6×Loading Buffer），混匀后加入电泳胶孔内先加Marker（DL－2000）5μL，然后依次加标本PCR产物，再加阴性对照，最后加阳性对照产物）。

3）观察结果并用凝胶成像系统拍照记录。 （四）结果判断

在系统成立，即阴阳性参考均正常的条件下，判断结果，阳性各条带为：甲型（210bp）出现特异性条带，判为阳性结果。未出现条带，或不在上述位置出现非特异性条带，均判为阴性结果。

四、A型流感病毒实时荧光定量PCR检测

实时荧光定量（Real-time）RT-PCR技术，是指在RT-PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个RT-PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量或定性分析的方法。如下是几个在结果判断中涉及到的几个概念：

图1：Real-Time RT-PCR反应标准曲线

1．阈值（threshold）：PCR反应前15个循环荧光信号作为荧光本底信号，荧光阈值的缺省设置是6～15个循环荧光信号标准偏差的10倍。

2．基线（baseline）：指PCR反应指数扩增前平均本底荧光信号值，通常取6～15个循环的平均荧光信号值。

3．Ct值：C代表Cycle，t代表threshold。Ct值是指反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数。

4．Ct值与起始模板的关系：每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可做出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表Ct值。因此，

只要获得未知样品的Ct值，可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。

（一）生物安全要求

分装标本、裂解病毒需在BSL-2级实验室生物安全柜操作。核酸检测区域要分出试剂配制、核酸提取、扩增、检测的不同分区。

（二）主要材料

1．核酸提取Kit：QIAGEN公司 RNeasy Mini Kit， Cat No.74104。 2．Real-time RT-RTPCR Kit：QIAGEN公司 QuantiTectTM Probe RT-PCR Kit， Cat No. 204443。

3．引物及探针：包括甲型通用引物及探针序列如下。

类型 FluA-Forward 甲型 FluA-Reverse FluA-probe （三）实验步骤

1．病毒核酸提取：同RT-PCR。 2．Real-time RT-PCR反应： （1）实验设计 1）检测标本

2）质控参数：阴性对照（核酸提取时，同标本同时提取无菌水） 阳性对照（已知病毒核酸） （2）反应体系的配制：

1）准备工作：进入BSL-2 PCR反应体系配制区，将QuantiTectTM Probe RT-PCR Kit、引物及探针拿出置室温直至溶解。

2）按照下列试剂及每个反应所需体积计算总反应数后，按照总反应数+1的量进行配制。

组 分

QuantiTect Probe RT-PCR Master Mix 上游引物（40μM） 下游引物（40μM）

体 积 （μL）

12.5 0.5 0.5

序列 5’-GAC CRA TCC TGT CAC CTC TGA C-3’ 5’-GGG CAT TYT GGA CAA AKC GTC TAC G-3’ 5’-TGC AGT CCT CGC TCA CTG GGC ACG-3’ Probe （10 μM） QuantiTect RT Mix RNase Free H2O Total

0.5 0.25 5.75 20

（3）反应液分管：以20μL/管将反应液依次分装至0.2mLPCR管中，并做好标记。

（4）将上述加有反应液的PCR管拿至核酸提取区，以5μL/管依次加入阴性对照、待检标本和阳性对照反应模板RNA。

（5）将加好上述反应体系的PCR管拿至核酸扩增区工作间，先后打开荧光定量PCR仪和联机电脑，将PCR管放于荧光定量PCR仪上进行扩增反应，在联机电脑中输入以下反应程序并运行程序：

1）60℃作用5min， 2）50℃作用30min， 3）95℃作用15min， 4）95℃变性15s， 5）55℃退火30s， 6）72℃延伸30s， 回到第4步，45个循环 7）72℃作用5min

（6）结果观察：在质控标准有效的情况下进行结果判断。 1）Ct值无数值的样本为阴性样本。 2）Ct值≤30.0的样本为阳性。

3）Ct值大于30.0的样本建议重做。重做结果无数值者为阴性，否则为阳性。如检测结果在可疑范围内可参考其他检测结果。检测体系有已知检测极限的阳性对照和标准品作为灵敏度指示，Ct值在检测极限内可以判断为阳性。

（7）质控标准

1）阴性对照的检测结果为阴性。 2）阳性对照的Ct值应为阳性。 3）否则，此次实验视为无效。

附录3、湖南省流感监测网络实验室编号规则

实验室编号 53 54 国家统一编号 55 56 57 4303 4304 4305 4306 4308 本省临时编号 4309 4311 4312 4313 4331 益阳市疾病预防控制中心 永州市疾病预防控制中心 怀化市疾病预防控制中心 娄底市疾病预防控制中心 湘西自治州疾病预防控制中心 网络实验室所在单位 湖南省疾病预防控制中心 郴州市疾病预防控制中心 长沙市疾病预防控制中心 株洲市疾病预防控制中心 常德市疾病预防控制中心 湘潭市疾病预防控制中心 衡阳市疾病预防控制中心 邵阳市疾病预防控制中心 岳阳市疾病预防控制中心 张家界市疾病预防控制中心

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