响应面法优化疏螺旋体素发酵培养基

目录

小基因组B. amyloliquefaciens菌株的构建以及γ-聚谷氨酸的生物合成 .................................................. 1

酒石酸高效生物合成关键技术及其应用 ..................................................................................................... 3

厌氧高效利用低劣生物质合成琥珀酸细胞工厂构建 ................................................................................. 4

基于转录组学的大肠杆菌丁醇耐受性机制研究 ......................................................................................... 6

通过代谢工程改造芽胞杆菌实现发酵过程及产品脱臭 ............................................................................. 7

RAISE技术改组转录调控因子RpoD调控大肠杆菌低pH耐受性 .......................................................... 8

基于mariner转座子的产溶剂梭菌随机突变方法及其在优势表型筛选中的应用 ................................... 9

ATG22敲除对醋酸胁迫下酿酒酵母程序性细胞死亡作用 ...................................................................... 10

苏云金芽孢杆菌L-异亮氨酸羟化酶的酶学性质及其在酶法合成4-羟基异亮氨酸中的应用研究 ...... 11

Acetobacter sp.生物合成3-HP转化机制及催化技术研究 ........................................................................ 12

“生物钢”蜘蛛丝的高效生物制造 ........................................................................................................... 13

微生物合成黄酮类物质的系统代谢工程策略 ........................................................................................... 14

大肠杆菌高产L-丝氨酸的基因工程菌构建 .............................................................................................. 15 Systematic analysis of intracellular mechanisms of propanol production in the engineered Thermobifida

fusca B6 strain ............................................................................................................................................... 16

枯草芽孢杆菌发酵产surfactin与聚-γ-谷氨酸的工艺优化 ....................................................................... 17

基于代谢工程改造策略强化2,3-丁二醇合成途径 .................................................................................... 18

Yeast cell-based analysis of human lactate dehydrogenase isoforms ............................................................ 19

高产四氢嘧啶的大肠杆菌工程菌构建 ....................................................................................................... 20

重组钝齿棒杆菌SYPA-phbCAB-ppnK的构建及PHB胞内积累对L-精氨酸合成的影响 ................... 21

基于动态代谢组学分析与合成途径动力学模型的途径诊断方法的构建与应用 ................................... 22

真菌多糖水解规律及单糖组成研究 ........................................................................................................... 23

通过敲除胞外蛋白酶和细菌多糖提高Bacillus amyloliquefacien LL3果聚糖产量 ................................ 24

Pichia pastoris甘油抑制甲醇代谢分子机理研究 ...................................................................................... 25

高产泛酸的酿酒酵母菌株的构建 ............................................................................................................... 26

mreB过表达对门多萨假单胞菌NK-01菌体形态及产物的影响 ............................................................ 28

在高温下同步利用葡萄糖和木糖同时生产乙醇与木糖醇的工程酵母的构建与应用 ........................... 29

响应面法对威兰胶发酵体系pH优化 ........................................................................................................ 30

产蛋氨酸的大肠杆菌工程菌株的构建 ....................................................................................................... 31

一株产γ-聚谷氨酸的非谷氨酸依赖型高产菌株筛选 ............................................................................... 32

通过弱化细胞壁和增加细胞膜流动性的方法提高谷氨酸棒杆菌的电转化效率 ................................... 33

全局调控工程提高工业酿酒酵母糠醛耐受性的研究 ............................................................................... 34

嗜极微生物中热激蛋白改善Clostridium acetobutylicum ATCC824丁醇耐受性的研究 ........................ 35

基于发酵和双气旋收集的虫生真菌孢子产量系统优化 ........................................................................... 36 Efficient Biocatalytic Reduction of Ethyl Acetoacetate with Recombinant Escherichia coli cells in an ionic

liquid containing system ................................................................................................................................ 37

以甘油为底物发酵生产一种新型黄原胶 ................................................................................................... 38

构建DUR1,2基因高表达的工业黄酒酵母工程菌减少黄酒中氨基甲酸乙酯的形成 ............................ 39

重金属胁迫下生物转化脱脂蚕蛹生产酵母油脂条件的优化及基因改造策略 ....................................... 40

毕赤酵母中重组猪溶菌酶基因表达的密码子优化策略比较 ................................................................... 41

一株产灵菌红素粘质沙雷氏菌发酵条件的优化 ....................................................................................... 43

响应面法优化疏螺旋体素发酵培养基 ....................................................................................................... 44

漆酶lac1338原核表达发酵条件优化 ........................................................................................................ 45

脱硫微生物的筛选及脱硫效率的初步评价 ............................................................................................... 46

毕赤酵母核糖体蛋白功能及其对外源蛋白合成的调控 ........................................................................... 47

黑曲霉细胞表面展示体系的构建及其展示脂肪酶催化特性的表征 ....................................................... 48

毕赤酵母GPI型细胞壁蛋白的功能分析 ................................................................................................... 49

里氏木霉Cel6A基因在毕赤酵母里的异源表达 ....................................................................................... 50

基于差分进化算法的酿酒酵母分批补料培养在线自适应控制 ............................................................... 51

阿维链霉菌唾液酸苷酶的异源表达及酶学性质的研究 ........................................................................... 52

一步PCR技术快速高效组合进化酶和代谢途径...................................................................................... 53

羟脯氨酸高产菌株的构建以及发酵条件的优化 ....................................................................................... 54

不同溶氧对谷氨酸棒杆菌发酵过程关键物质及酶活的影响 ................................................................... 55

三阶段发酵策略提高Mycobacterium neoaurum JC-12雄甾二烯二酮产量的研究................................. 56

丙丁梭菌-酿酒酵母混合培养耦联外添乙酸强化丙酮合成 ...................................................................... 57

壳聚糖对纤维素酶的诱导作用 ................................................................................................................... 58

一株产顺式-4-羟基-L-脯氨酸基因工程菌的构建及发酵初步优化 ......................................................... 59

脂肪酶的异源表达及蛋白表达条件优化 ................................................................................................... 60

易错PCR技术诱变选育反式-4-羟脯氨酸生产菌株及响应面法优化发酵条件 ..................................... 61

利用重组B. subtilis 168进行高效生物转化法生产L-鸟氨酸 ................................................................. 62

铜绿假单胞菌利用甘油/脂肪酸生产鼠李糖脂 .......................................................................................... 63 Significantly improving the yield of recombinant proteins in Bacillus subtilis by a novel powerful

mutagenesis tool ............................................................................................................................................ 64

一种基于调控枯草芽孢杆菌内源毒素-抗毒素系统的食品级表达系统的构建与应用 .......................... 65

通过定点突变提高Staphylococcus aureus来源α-乙酰乳酸脱羧酶的酸性稳定性................................. 66

通过调控NADH和NADH/NADPH比率再分配枯草芽孢杆菌中乙偶姻和2,3-丁二醇的比例 .......... 67

基于2，3-二羟基苯甲酸为前体的顺，顺-粘康酸生物合成途径的构建 ................................................ 68

以右旋糖酐发酵废液为原料发酵生产丁二酸 ........................................................................................... 69

利用廉价农业废弃生物质原料发酵生产表面活性素 ............................................................................... 70

外源引入海藻糖合成能力提高丁酸梭菌的抗逆性 ................................................................................... 71 表面活性剂对纽莫康定B0发酵的影响 ..................................................................................................... 72 代谢改造解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）LL3提高谷氨酸浓度进而提高γ-PGA产量 73

解淀粉芽孢杆菌嘧啶操纵子弱化区基因改造对胞苷代谢的影响 ........................................................... 74

解淀粉芽孢杆菌pyrR基因敲除对胞苷生物合成的影响 ......................................................................... 75

Optimization of the fermentation conditions of 1,3-propanediol from Klebsiella sp. ZH-1 ......................... 76

发酵产生普鲁兰多糖的条件优化、菌种选育以及中间底物的初步研究 ............................................... 77

微生物木糖发酵产酒精代谢工程的研究进展 ........................................................................................... 78

高产泛酸的酿酒酵母菌株的构建 ............................................................................................................... 79

使用生物印迹和固定化技术提高磷脂酶A1的油脂脱胶能力 ................................................................ 80

产黄青霉形态突变株构建技术研究 ........................................................................................................... 81

Improvement of Vitamin K2 Production by Bacillus subtilis (natto) withγray irradiation ........................... 82

第一篇 大会报告

小基因组B. amyloliquefaciens菌株的构建以及γ-聚谷氨酸的生物

合成

宋存江 冯俊 谷燕燕 高伟霞 全玉芬 党雨蕾 王淑芳

南开大学分子微生物与技术教育部重点实验室 songcj@，022-23503866

摘要：目前，合成生物学的研究主要集中在以下方面 ① 生物元件标准化及生物模块的设计与构建及其适配性研究；② 最小基因组研究；③ 基因组的设计、合成与组装。

小基因组微生物构建主要步骤包括：① 掌握菌株全基因组数据背景；② 菌株基因组的生物信息学分析（必须基因、基因组岛和复制起始位点等）；③ 建立大片段无痕敲除基因序列的方法；④ 利用所构建的方法进行基因组精简；⑤ 检验所构建的小基因组菌株生长和合成产物状况。 本研究完成了Bacillus amyloliquefaciens LL3的全基因组测序，该菌株拥有一个 3995227 bp染色体组和一个6758bp的内源性质粒。生物信息学分析的结果显示出：原有基因4325个，必须基因273个；具有经过水平转移获得的大片段的基因组岛8个；该菌株复制起始位点位于3994731-3994423 ，另外dnaA 在1753-1973。本研究建立了利用温敏质粒结合反向筛选标记的大片段无痕删除基因序列的方法。利用该方法对基因组进行了精简，共计删除了约10%的基因组序列。小基因组菌株的特征表现为生长速度有所加快。另外，研究组对该菌株进行了改造，构建了γ-聚谷氨酸合成工程菌株。

通过代谢改造γ-PGA合成相关代谢网络包括：副产物合成，γ-PGA降解，谷氨酸前体合成，γ-PGA合成以及自诱导因子合成。构建了一株γ-PGA产量提高的解淀粉芽孢杆菌工程菌。首先在解淀粉芽孢杆菌NK-1出发菌株的基础上敲除了胞外多糖合成基因簇epsA-O，果聚糖合成基因簇sac，脂多糖合成相关基因lps，乙酸合成相关基因pta，得到NK-E7菌株产量较野生型有微小提高从3.8提高到

4.15 g/L。然后在NK-E7菌株基础上敲除γ-PGA降解酶基因pgdS以及细胞壁水解酶基因cwlO，得到NK-E10菌株产量从4.15提高到9.18 g/L。在NK-E10菌株的基础上敲除细胞自诱导因子合成基因luxS，聚谷氨酸产量从9.18提高到9.54 g/L。通过人工设计合成的sRNA对谷氨酸利用途径关键基因进行抑制表达。实验发现当谷氨酸脱氢酶基因rocG抑制时，菌株NK-anti-rocG的γ-PGA产量最高达到11.04 g/L。最后利用5-L发酵罐对NK-anti-rocG菌株进行补料分批发酵实验，以蔗糖为发碳源，菌株在发酵54 h时产量最高达到20.3 g/L。

2014 - 2015发表的论文：

[1] Weitao Geng,Chao Yang,Yanyan Gu,Ruihua,Liu,Wenbin Guo,Xiaomeng Wang,Cunjiang Song* and Shufang Wang* Cloning of ε-poly-L-lysine (ε-PL) synthetase gene from a newly isolated ε-PL-producing Streptomyces albulus NK660 and its heterologous expression in Streptomyces lividans Microbial Biotechnology,2014,7,155–164.

[2] Jun Feng, Weixia Gao, Yanyan Gu, Wei Zhang, Mingfeng Cao, Cunjiang Song*, Peng Zhang, Min Sun, Chao Yang, Shufang Wang*. Functions of poly-gamma -glutamic acid (γ-PGA) degradation genes in γ-PGA synthesis and cell morphology maintenance. Appl Microbiol Biotechnol, 2014,98:6397-6407.

[3] Yanyan Gu, Chao Yang, Xiaomeng Wang, Weitao Geng, Yang Sun, Jun Feng, Yuanyuan Wang, Yufen Quan, You Che, Chi Zhang, Ting Gong, Wei Zhang, Weixia Gao, Zhenqiang Zuo, Cunjiang Song*,

Shufang Wang. Genome Sequence of the ε- Poly -L-Lysine-Producing Strain Streptomyces albulus NK660, Isolated from Soil in Gutian, Fujian Province, China. Genome Announcements, 2014, 2(3), e00532-14.

[4] Jun Feng, Yanyan Gu,Yang Sun,Lifang Han,Chao Yang,Wei Zhang,Mingfeng Cao,Cunjiang Song*, Weixia Gao and Shufang Wang*.Metabolic engineering of Bacillus amyloliquefaciens LL3 for

poly-gamma-glutamic acid (γ-PGA) overproduction. Microbial Biotechnology, 2014, 7, 446–455.

[5] Wei Zhang, Cunjiang Song* et al. A markerless gene replacement method for B. Amyloliquefaciens LL3 and its use in genome reduction and improvement of poly-γ-glutamic acid production. Appl Microbiol Biotechnol, 2014, 98,8963–8973.

[6] Wei Zhang, Yulian He, Weixia Gao, Jun Feng, Mingfeng Cao, Chao Yang, Cunjiang Song* and Shufang Wang*. Deletion of genes involved in glutamate metabolism to improve poly-gamma-glutamic acid production in B. amyloliquefaciens LL3.Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology, 2015, 42,297–305.

[7] Yuanyuan Wang, Chi Zhang, Ting Gong, Zhenqiang Zuo, Fengjie Zhao, Xu Fan, Chao Yang*,

Cunjiang Song*.An upp-based markerless gene replacement method for genome reduction and metabolic pathway engineering in Pseudomonas mendocina NK-01 and Pseudomonas putida KT2440. Journal of Microbiological Methods, 2015, doi: 10.1016/j.mimet.2015.03.022

[8] Jun Feng#,YanyanGu#,Lifang Han, Kexin Bi, Yufeng Quan, Chao Yang, Wei Zhang, Mingfeng Cao, Shufang Wang,Weixia Gao,Yang Sun and Cunjiang Song?. Construction of a Bacillus amyloliquefaciens strain for high purity levan production. 2015, FEMS Letters, doi: 10.1093/femsle/fnv079

[9] Jun Feng, Yanyan, Yufen Quan, Wei Zhang, Mingfeng Cao, Weixia Gao, Cunjiang Song*, Chao Yang, Shufang Wang* Recruiting a new strategy to improve levan production in

Bacillus amyloliquefaciens. Scientific Reports | 5:13814 | DOi: 10.1038/srep13814.

[10] Jun Feng, Yanyan Gu, Yufen Quan, Mingfeng Cao, Weixia Gao, Wei Zhang, Shufang Wang* , Chao Yang, Cunjiang Song*. Improved poly-γ -glutamic acid production in Bacillus amyloliquefaciens by modular pathway engineering. Metabolic Engineering, ( 2015 ) ,

/10.1016/j.ymben.2015.09.011.

酒石酸高效生物合成关键技术及其应用

李永泉* 张建国 谢志鹏 潘海峰

浙江大学生物化学研究所；杭州宝晶生物股份有限公司，杭州310058

摘要：酒石酸是重要的食品添加剂，主要用作葡萄酒与饮料的酸味剂、食品乳化剂合成原料等。浙江大学和宝晶生物股份历时10年产学研合作，建立了L-酒石酸高效生物合成技术，实现了连续化生产（连续运行90天），原料成本仅9000多元/吨，完全颠覆了欧洲人从葡糖酒酿造过程产生的酒石提取L-酒石酸的传统工艺(原料成本约2.5万元/吨)和现行批式生物合成工艺(原料成本约1.5万元/吨)，节能减排，消除了高氯废水的污染。

L-酒石酸高效生物合成技术已于06年在宝晶生物股份投产，2014年销售额逾4亿，80%出口，近三年销售总收入逾10亿、利税近3亿、出口创汇逾1.5亿美元；每年并产生间接经济效益60多亿。当我国有机酸产业普遍遭遇国际反倾销诉讼时，公司依托发明的创新技术于06年和2012年两次赢得欧盟对华酒石酸的反倾销诉讼，成为获“零反倾销税率”待遇的国内唯一企业，是国际最大的酒石酸生产商，全球市场占有率为30%以上。

项目组历时10余年，产学研合作联合攻关，建立了创新技术体系。（1）建立了酒石酸合成酶的高效可溶表达技术。从自然界筛选到产酶菌株，破译表达量极低的天然酶编码基因，通过JCat优化密码子、筛选温敏启动子PLPR、构建含融合标签的表达载体，实现高效可溶表达，成功制备了L-酒石酸合成酶、D-酒石酸合成酶。（2）构建了酒石酸合成酶重构技术，利用基因突变技术理性重构合成酶，大幅提高酶活力和热稳定性。重构的L-酒石酸合成酶工程菌酶活力达20万U/g，是野生型的20倍，最适稳定温度从35℃提高到40℃。（3）构建了高催化性能含酶细胞载体，解决了固定化细胞通透性、表面结垢等关键问题，提高了固定化催化剂催化效率。使用含酶细胞载体，L-酒石酸合成酶酶促效率由0.5kg/kg提高到0.7kg产物/kg细胞/小时。（4）采用生物合成与分离耦合技术，降低了产物抑制效应，提高了合成速率。通过反应与分离耦合，实现了L-酒石酸连续化生产（连续运行90天），相比批式技术底物摩尔转化率从80%提高到95%、原料成本降低38.8%，减排32.2%，基本消除了高氯废水的污染问题。

项目授权国家发明专利13项，受理欧洲专利1项，发表论文25篇（19篇SCI），获浙江省科学技术奖一等奖和教育部科技进步奖一等奖，生产的L-酒石酸被评为国家重点新产品，08年教育部组织项目鉴定，结论为“国际先进水平”。本发明技术已推广到D-酒石酸、酮基葡萄糖酸、苹果酸、没食子酸丙酯等有机酸及衍生物的开发，为有机酸产业转型升级、提高国际竞争力提供了技术支撑。

厌氧高效利用低劣生物质合成琥珀酸细胞工厂构建

姜岷 吴明科 马江锋

南京工业大学生命与制药工程学院，南京211816

摘要：琥珀酸是重要的碳四平台化合物，利用生物法替代石化法合成琥珀酸是大势所趋，其中开发实现利用低劣生物质原料合成琥珀酸是研究热点之一。然而，与淀粉基葡萄糖不同，以木质纤维素水解液为代表的低劣生物质中含有葡萄糖、木糖、阿拉伯糖等糖组分及预处理过程中生成的水解抑制因子，这些复杂成分构成的生物转化体系对生产菌株的底物利用范围、物质代谢能力及抗逆性能提出了新的要求。1) 为实现五碳糖的高效利用，分析比较产琥珀酸放线杆菌和大肠杆菌代谢途径的差异，发现ATP 供给不足是导致重组大肠杆菌丧失木糖代谢能力的关键因素。通过引入外源ATP合成途径，强化胞内能量的供给使大肠杆菌代谢木糖合成琥珀酸的效率提高12.4倍。[1] 进一步地，敲除糖转运调控基因（ptsG）解除了葡萄糖效应，实现了葡萄糖与木糖的同步利用，大大缩短了发酵周期。[2] 2)针对重组菌株厌氧条件下生长及代谢停滞，通过改造NAD(H)合成途径，调节了NAD(H)的总量以及NADH/NAD+的比例，增强了厌氧菌株代谢的速率，产物琥珀酸的合成速率提高了30.7倍。[3] 在此基础上，进一步改造胞内ATP代谢途径，获得了驱动力代谢调节能力优异的重组大肠杆菌BA209，菌株生长及产物琥珀酸合成速率明显提高。[4] 3)驱动力不仅参与菌体胞内物质的代谢，众多研究表明NADH和ATP（尤其是ATP）参与到菌株对于极端环境的耐受保护机制中。考察重组菌BA209对于低pH、高盐和高糖浓度的耐受性能发现其在相应的环境胁迫下菌株生长和代谢性能都得到了提高。[5] 本研究从驱动力的角度改造提高厌氧条件下菌株琥珀酸的合成性能，实现了利用低劣生物质高效合成琥珀酸，为利用低劣生物质炼制其它大宗化学品的提供了借鉴。

参考文献

[1] Liu RM, Liang LY, Jiang M et al. Fermentation of xylose to succinate by enhancement of ATP supply in metabolically engineered Escherichia coli. Applied microbiology and biotechnology, 2012, 94: 959-968.

[2] Liu RM, Liang LY, Jiang M et al. Efficient succinic acid production from lignocellulosic biomass by simultaneous utilization of glucose and xylose in engineered Escherichia coli. Bioresource technology, 2013, 149: 84-91.

[3] Liang LY, Liu RM, Jiang M et al. Effects of overexpression of NAPRTase, NAMNAT, and NAD synthetase in the NAD(H) biosynthetic pathways on the NAD(H) pool, NADH/NAD+ ratio, and succinic acid production with different carbon sources by metabolically engineered Escherichia coli. Biochemical engineering journal. 2013, 81: 90-96.

[4] Jiang M, Chen X, Liang LY et al. Co-expression of phosphoenolpyruvate carboxykinase and nicotinic acid

phosphoribosyltransferase for succinate production in engineered Escherichia coli. Enzyme and microbial technology, 2014, 56: 8-14.

[5] Wu MK, Guan Z, Jiang M et al. Efficient succinic acid production by engineered Escherichia coli using ammonia as neutralizer. Journal of chemical technology and biotechnology, doi: 10.1002/jctb.4828.

第二篇 分会报告

基于转录组学的大肠杆菌丁醇耐受性机制研究

司海明 张法 韩瑞枝 许国超 倪晔*

江南大学生物工程学院，无锡214122

摘要：微生物在医药、能源、精细化工等工业生产过程中发挥着重要的作用，然而其应用过程中有机溶剂的存在会严重破坏微生物细胞的生理功能。因此，提高微生物细胞的有机溶剂耐受性及其耐受性机制研究，对微生物菌株在生物催化和生物燃料等产业应用中具有重要的意义。研究室通过全局转录机制工程结合高通量筛选[1,2]获得一株能够耐受2%（v/v）丁醇的突变株，并利用基因芯片进行转录组学分析。芯片结果显示：329个差异表达基因被鉴定（包括197个上调基因和 132个下调基因) (P＜0.05; FC≥2)。这些差异表达基因所编码的蛋白主要参与碳代谢，能量代谢，氧化压力应答，信号转导通路等生物过程。为了验证差异表达基因与溶剂耐受性的关系，选择了转录水平差异显著的上下调基因进一步研究 [3]。结果显示上调基因gcl、glcG、tdcD等的过表达能够明显提高大肠杆菌对丁醇的耐受性，下调基因yibT、yghW等的敲除使大肠杆菌对丁醇的耐受性也有所改善。gcl编码乙醛酸醛连接酶参与乙醛酸循环（TCA循环支路），检测显示代谢中间物丙酮酸水平显著提高，推测该基因的上调有利于提高细胞内能量水平，这正是细胞应对溶剂压力的调控方式之一。yibT、yghW编码的两个假定蛋白参与细胞脂肪酸代谢途径，研究表明在细胞应对溶剂压力时，这两个蛋白的上调可影响细胞膜脂肪酸的组成，导致细胞膜疏水性降低从而增强其对溶剂的排斥。本研究利用基因芯片技术对溶剂耐受菌株的基因转录水平进行了系统的分析，对微生物溶剂耐受性机制的阐明和相关菌株的构建提供了理论依据。

参考文献

[1] Alper H et al., Engineering yeast transcription machinery for improved ethanol tolerance and production. Science, 314, 1565-8, 2006.

[2] Ni Y, Song L, Qian X, Sun Z. 2013. Proteomic analysis of Pseudomonas putida reveals an organic solvent tolerance-related gene mmsB. PLoS One 8(2):e55858.

[3] Qian X, Song L, Ni Y. 2014. Enhanced organic solvent tolerance of Escherichia coli by 3-hydroxyacid dehydrogenase family genes. Appl Biochem Biotechnol 172(6):3106-15.

通过代谢工程改造芽胞杆菌实现发酵过程及产品脱臭

魏雪团 陈杨阳 黄花花 陈守文

华中农业大学食品科学与技术学院，武汉430070

摘要：常用的芽胞杆菌包括枯草芽胞杆菌、解淀粉芽胞杆菌、地衣芽胞杆菌等，可分泌多种生物制品，具有重要的应用价值，广泛应用于农业、食品、医药、化妆品等领域。芽胞杆菌发酵过程产生的臭味物质会造成严重的负面效应，一方面，臭味废水、废气、废渣造成环境污染和人体不适，影响发酵产业的发展；另一方面，臭味物质影响食品、保健品、医药产品以及饲料产品的口感和气味，影响消费对象对其接受程度。因此，发酵过程及产品脱臭具有重要的意义。芽胞杆菌所产生的支链短链脂肪酸和生物胺等物质是其主要异味物质，由芽胞杆菌特定代谢途径产生。因此，通过代谢工程手段阻断臭味物质产生基因，同时不影响关键代谢物的产量，具有重要的意义。本课题组通过基因敲除阻断了地衣芽胞杆菌和解淀粉芽胞杆菌的支链锻炼脂肪酸形成的系列基因，显著降低了臭味物质含量，基本消除了所发酵产品的臭味，并评价关键基因缺失对目标代谢物的影响，获得了既可消除发酵产品臭味又可维持原代谢物产量的工程菌株，具有重要的工业化应用价值。

RAISE技术改组转录调控因子RpoD调控大肠杆菌低pH耐受性

高茜 朱丽英 江凌* 黄和

南京工业大学生物与制药工程学院，南京210009

摘要：发酵产业是我国生物产业的重要组成部分，其中，以有机酸、氨基酸为代表的传统发酵工业是我国发酵产业一个成熟的分支。但是，在有机酸或原材料酸解的生物转化过程中，微生物由于自身对酸性代谢产物或低pH环境的抗逆性差，其代谢活性受到严重影响。为解决该问题，本实验采用RAISE（Random Insertional-deletional Strand Exchange Mutagenesis）重组技术，将各种长度的随机插入、缺失和替代引入全局调控因子RpoD目的基因,构建大量区域交换随机突变文库，通过对突变文库的多轮迭代筛选，获得大肠杆菌的耐酸性能显著提高的突变菌株Mutant VII。实验表明，在pH 3.17时，相比原始菌株0.15 h 1的生长速率，该突变菌株展现出明显的生长优势，生长速率为0.22 h 1。结合转录组分析和表型组学分析进一步解析全局转录调控因子RpoD对大肠杆菌工程菌株的调控网络的影响。分析表明，菌株中共有95 (2.1%)个基因上调，178 (4.0%)个基因下调，所调控基因除与耐酸能力相关之外，主要涉及海藻糖合成，核酸利用，碳代谢，氨基酸利用等方面。此外，主要调控蛋白(ArcA, EvgA, H-NS，RpoS)和基因/启动子转录调控因子(GadX, GadW, AppY, YdeO, KdgR)都受到RpoD的影响。实验结果证明了RpoD在大肠杆菌生长阶段所起到的全局转录调控作用，不仅为后期改善不同大肠杆菌工业生产菌株的耐酸性能提供有力的理论依据，还为有机酸、氨基酸发酵行业的节能减排奠定了坚实的理论基础和技术源头。

参考文献

[1] Mazumdar S., Blankschien M. D., Clomburg J. M., et al, Microb. Cell Fact., 2013, 12 (7), 10-1186.

[2] Abdel-Rahman M. A., Tashiro Y., Sonomoto K., Biotechnol. Adv., 2013, 31 (6), 877-902.

[3] Dragosits M., Mattanovich D., Microb. Cell Fact., 2013, 12, 64.

[4] Alper H., Moxley J., Nevoigt E., et al, Science, 2006, 314 (5805), 1565–1568.

[5] Jiang L., Lin M., Zhang Y., et al, PloS One, 2013, 8 (10), e77437.

基于mariner转座子的产溶剂梭菌随机突变方法及其在优势表型

筛选中的应用

张慧1 徐舒1 张颖2 杨晟1 姜卫红1 Nigel P. Minton2 顾阳*1

1中国科学院上海生命科学研究院植物生理生态研究所，上海200032；2 School of Life Sciences,

University of Nottingham, Nottingham NG7 2RD, UK

摘要：产溶剂梭菌（solventogenic clostridia）是一类重要的工业微生物。其底物谱广泛，可利用粮食淀粉、木质纤维素（秸秆、麦秆等）乃至含碳气体（如CO，CO2）等多种原料；且在发酵过程中可产生一系列有机酸和醇类化学品及生物燃料，如乙酸、丁酸、乙醇、丁醇、2，3-丁二醇等。因此，近年来产溶剂梭菌的基础应用研究受到广泛关注[1]。

得益于近年来产溶剂梭菌遗传操作技术的快速发展，研究者们已经能够在分子水平对该类微生物进行改造以克服其发酵性能上的缺陷，进而提高菌株的发酵能力和经济性， 但目前距离工业生产需求仍有一定差距。造成上述结果的主要原因是我们对于产溶剂梭菌这类严格厌氧微生物复杂的生理生化机制的认知仍然有限，无法对菌株进行高效的设计和改造。基于此，采用“反向代谢工程”技术是加快目前产溶剂梭菌研究进度的有效策略之一[2]。在反向代谢工程研究中，转座子随机突变是一种重要的技术手段。

我们以两种重要的产溶剂梭菌模式菌株—丙酮丁醇梭菌和拜氏梭菌作为研究对象，建立了高效的基于mariner转座子的诱导型随机突变方法，获得了高质量的单基因突变体库，转座效率90%以上，且转座突变具有很好的随机性。在此基础上，上述突变体库被用于优势表型筛选，分别获得了一株产量显著提高的丙酮丁醇梭菌和对玉米秸秆水解液抑制物耐受能力显著增强的拜氏梭菌。上述结果证明了基于mariner转座子的产溶剂梭菌随机突变技术平台在优势表型筛选中的作用。

参考文献

[1] Tracy B. P., Jones S. W., Fast A. G., et al, Curr. Opin. Biotechnol., 2012, 23 (3) , 364-381.

[2] Zhang Y., Grosse-Honebrink A., Minton N.P. PLoS One, 2015, 10, e0122411

ATG22敲除对醋酸胁迫下酿酒酵母程序性细胞死亡作用

董亚晨 胡竞进 陈启和

浙江大学食品科学与营养系； 浙江省食品微生物技术研究重点实验室， 杭州 310058

摘要：醋酸阻断了酿酒酵母细胞的胞内氨基酸营养吸收，启动了程序性细胞死亡。Atg22是一种液泡内膜蛋白，它对于液泡内氨基酸进出与自噬性降解是必须的。本文重点开展ATG22基因在酵母细胞应对醋酸胁迫死亡过程中的作用机制。我们检测了几种凋亡标记因子，研究发现Atg22的敲除和过表达分别延迟和提高醋酸胁迫下酵母细胞的程序性死亡。基于表观上分析，酵母Atg22蛋白的表达受到醋酸作用的抑制。而且，Atg22基因敲除的酵母细胞在醋酸处理后胞内氨基酸和NH3大量的积累，这可以帮助应对细胞氨基酸饥饿和胞内环境酸化。与此同时，在ATG22基因敲除后的细胞中系列胁迫保护基因也在转录水平上发生上调。本研究结果为解析Atg22p在醋酸导致的程序性细胞死亡中的作用提供了依据，也为改善工业酿酒酵母其醋酸耐受能力提供了新靶标。

参考文献

[1] Almeida, B., Ohlmeier, S., Almeida, A. J., Madeo, F., Leao, C., Rodrigues, F. and Ludovico, P. (2009). Yeast protein expression profile during acetic acid-induced apoptosis indicates causal involvement of the TOR pathway. Proteomics 9, 720-732.

[2] Bauer, B. E., Rossington, D., Mollapour, M., Mamnun, Y., Kuchler, K. and Piper, P. W. (2003). Weak organic acid stress inhibits aromatic amino acid uptake by yeast, causing a strong influence of amino acid auxotrophies on the phenotypes of membrane transporter mutants. European Journal of Biochemistry 270, 3189-3195.

[3] Carmona-Gutiérrez, D., Bauer, M. A., Ring, J., Knauer, H., Eisenberg, T., Büttner, S., Ruckenstuhl, C., Reisenbichler, A., Magnes, C., Rechberger, G. N., Birner-Gruenberger, R., Jungwirth, H., Fröhlich, K. U., Sinner, F., Kroemer, G. and Madeo, F. (2011). The propeptide of yeast cathepsin D inhibits programmed necrosis. Cell Death and Disease 2, e161.

苏云金芽孢杆菌L-异亮氨酸羟化酶的酶学性质及其在酶法合成4-

羟基异亮氨酸中的应用研究

张成林 麻杰 薛宁 王鑫鑫 刘远 陈宁*

天津科技大学生物工程学院代谢控制发酵技术国家地方联合工程实验室；工业微生物教育部重点实

验室，天津 300457

摘要：4-羟基异亮氨酸( 4-Hydroxyisoleucine, 4-HIL)具有葡萄糖浓度依赖的促进胰岛素分泌的活性以及增强肌细胞对血糖吸收、加速脂肪代谢、降血脂和保护肝功能的作用，因此具有广泛的应用前景和市场需求。目前采用胡芦巴种子提取法生产的4-HIL构型多样且提取率，而仅(2S, 3R, 4S)-4-羟基异亮氨酸具有生物学活性。本文克隆了来源于苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensis TCCC 11826的L-异亮氨酸羟化酶 (L-isoleucine-4-hydroxylase, IDO)编码基因ido，测序发现该基因含723个核苷酸，编码240个氨基酸，未见相同序列基因的报道。氨基酸序列分析发现该IDO含有His1-X-Asp/Glu-Xn-His2 基序，属于Fe2+和α-酮戊二酸依赖型羟化酶家族。成功构建了ido基因过表达菌株BL-IDO并采用Ni-NTA 亲和层析法分离纯化重组IDO后检测其酶学特性，结果表明该酶能够特异性地催化L-异亮氨酸生成 (2S, 3R, 4S)-4-HIL，其Km和Vm分别为0.18mmol/L和2.10 μmol/min/mg，最适反应温度和pH分别为35℃和7.0，于35℃条件下反应5h后仍具有85.1%的活性。BL-IDO经培养、IPTG诱导并冷冻处理后于适宜条件下能够特异性地催化异亮氨酸生成 (2S, 3R, 4S)-4-HIL，其转化率最高可达90.7 %。本文新发现了一段IDO编码基因序列(Accession No. KC884243)并首次较为系统地研究了其酶学特性，该酶反应条件温和且具有较高的活性及稳定性，在酶法合成4-HIL中具有一定的应用价值。本研究可为4-HIL及其它氨基酸衍生物的生物制造技术奠定理论基础。

Acetobacter sp.生物合成3-HP转化机制及催化技术研究

李俊 陆信曜 宗红 诸葛斌

江南大学生物工程学院，无锡214122

摘要：3-羟基丙酸(3-hydroxypropionic acid, 3-HP)是一种具有高经济价值的重要工业用化学中间体，具有广泛的应用前景[1-6]，但目前尚未实现工业化生产。本实验室前期研究已筛选获得了一株可高效催化1,3-丙二醇（1,3-PDO）合成3-HP的菌株—Acetobacter sp. [7]，本课题旨在探明1,3-PDO经全细胞催化合成3-HP的醇脱氢氧化过程和机理，并通过驯化培养获得具有高底物耐受性的菌株，利用细胞固定化催化合成3-HP，以期为生物合成3-HP提供一种新方法。

经过多轮次底物胁迫驯化获得了能够耐受高浓度1,3-PDO（50 g/L）的子代菌株，同时菌体的催化活性也得到了相应提高。以提高菌体的呼吸链水平为切入点，通过优化碳源组合和添加辅酶Q前体物质、生长因子以及辅酶金属离子，对培养基进行优化，使Acetobacter sp.生物量增加了55.9%。 通过固定化技术在3-HP生物合成中的应用，利用Acetobacter sp.催化反应80 h后，3-HP的产量最高达34.96 g/L，摩尔转化率为86.79%。且固定化细胞在重复利用5次之后转化率仍高于80%，在4 °C的条件下贮存100 h后其催化能力仍能保持在较高水平。功能菌体Acetobacter sp.的固定化研究工作克服了工业实际应用的中存在的操作难点，固定化细胞具有良好的生产应用稳定性，为生物转化合成3-HP的工业生产提供借鉴。这一研究结果为生物合成3-HP提供了新思路，具有重要的参考价值。

参考文献

[1] Jiang XL, Meng X, Xian M. Biosynthetic pathways for 3-hydroxypropionic acid production[J]. Appl Microbiol and Biotechnology. 2009, 82(6): 995-1003.

[2] Werpy T, Petersen G. Aden A, Bozell J, Holladay J, White J, Manheim A, Eliot D, Lasure L, Jones S. Top value added chemicals from biomass: results of screening for potential candidates from sugars and synthesis gas[M]. Energy Efficiency and Renewable Energy, Washington D.C., 2004.

[3] Brown SF. Bioplastic fantastic[J]. Fortune. 2003, 148:92-97.

Della Pina C, Falletta E, Rossi M. A green approach to chemical building blocks. The case of 3-hydroxypropanoic acid[J]. Green Chemistry. 2011, 13 (7):1624-1632.

[4] Falletta E, Della Pina C, Rossi M, He Q, Kiely CJ, Hutchings GJ. Enhanced performance of the catalytic conversion of allyl alcohol to 3-hydroxypropionic acid using bimetallic gold catalysts[J]. Faraday Discuss. 2011, 152:367-379.

[5] Kumar V, Ashok S, Park S. Recent advances in biological production of 3-hydroxypropionic acid[J]. Biotechnol Adventure. 2013, 31:945-961.

[6] 吴金鑫, 诸葛斌, 宗红, 陆信曜, 方慧英, 宋健. 高效催化合成3-羟基丙酸的菌株特性研究[J]. 应用与环境生物学报, 2014, 20(5):804-808.

“生物钢”蜘蛛丝的高效生物制造

钱志刚 钟建江 夏小霞

微生物代谢国家重点实验室；上海交通大学生命科学技术学院，上海200240

摘要： 蜘蛛丝是一类天然高分子蛋白质纤维，不仅具有合成纤维Kevlar相当的强度及其他物质难以媲美的弹性和断裂功，而且还具有质轻、耐高低温等特点，是一种优质、难得的天然生物材料，被称为“生物钢”。优异的机械性能使蜘蛛丝在高性能材料如降落伞绳索、军事防护服、航天飞机复合材料等方面具有重要的应用价值，蜘蛛丝良好的生物相容性和可降解性在医用材料、器械方面的应用也得到越来越广泛的关注（1-4）。

天然蜘蛛丝产量非常低，而且蜘蛛同类相食的个性使其无法高密度养殖。几十年来，研究人员测试了转基因动物、植物和微生物等多种宿主体系，但是由于蜘蛛丝是由高度重复基因序列表达的大分子量蛋白质（250-320 kDa）构成，很难大量生产。为了克服生物制造中的瓶颈问题，我们开展了基于机理探索的微生物代谢调控研究。首先，从实验中观察到的蛛丝蛋白生产造成微生物宿主生长阻滞的现象出发，采用比较蛋白组学分析的方法来研究微生物宿主代谢失衡的机制。其次，从代谢网络和发酵过程调控两个层面出发，探索缓解表达宿主代谢失衡的工程策略，提升外源蛛丝蛋白的生产水平，为后续的蜘蛛丝产业化研究奠定科学基础，还为其他生物基材料单体化学品的高效生物合成提供借鉴（5）。

参考文献

[1] Qian Z. G., Zhou M. L., Song W. W., Xia X. X. Biomacromolecules, 2015, DOI: 10.1021/acs.biomac.5b01231

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[3] Xia X. X., Wang M., Lin Y., Xu Q., Kaplan D. L. Biomacromolecules, 2014, 15(3), 908-914

[4] Wang Q., Xia X., Huang W., Lin Y., Xu Q., Kaplan D. L. Advanced Functional Materials, 2014, 24(27), 4303-4310.

[5] Yu J. L., Xia X. X., Zhong J. J., Qian Z. G. Biotechnology and Bioengineering, 2014, 111(12), 2580-2586

微生物合成黄酮类物质的系统代谢工程策略

周景文 吴俊俊 堵国成 陈坚

江南大学生物工程学院，无锡214122

摘要：黄酮类物质是一大类具有类似结构的植物天然产物，在食品、医药等领域具有重要应用，一直以来主要通过植物提取法生产。采用微生物合成来源于植物的天然产物，具有低成本、低污染、受季节影响小等优点，引起越来越多研究者的关注。为了解决植物提取法所存在的一系列问题，通过在微生物中构建由3-脱氧-D-阿拉伯庚酮酸-7-磷酸合成酶(DAHPS)、分支酸变位酶/预苯酸脱氢酶(CM/PDH)、酪氨酸氨基裂解酶(TAL)、4-香豆酸:辅酶A连接酶(4CL)、查尔酮合成酶(CHS)、查尔酮异构酶(CHI)、丙二酸辅酶A合成酶、多种P450氧化酶系等组成的黄酮类物质合成途径。通过模块优化策略得到的最优的代谢模块组合菌株可以在胞外以葡萄糖为碳源，积累(2S)-柚皮素和(2S)-生松素。研究发现，黄酮类物质合成的关键前体——丙二酰辅酶A，在生长过程中被大量用于细胞膜组分的合成，导致仅有少部分可以被用于黄酮类物质的合成。因此，构建了针对丙二酰辅酶A代谢途径关键基因的反义RNA调控策略。研究表明，基于mRNA互补序列和CRISPR/dCas9的反义RNA调控系统在大肠杆菌中的活性具有特定的规律。在此基础上，通过系统构建模块化合成策略，实现了(2S)-柚皮素、(2S)-生松素、圣草酚等多种黄酮类化合物的高效合成。相关研究结果为采用大肠杆菌更为有效的合成黄酮类化合物建立了一系列的系统代谢工程方法，并为后续改造微生物更为有效的合成种类更为多样的黄酮类提供了通用的方法学参考。

参考文献

[1] Wu J. J., Du G. C., Chen J., et al, Scientific Reports. 2015, 5: 13477.

[2] Zhou J. W., Wang K., Xu S., et al, Journal of Proteomics. 2015, 113: 15-28.

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[4] Zhu S. J., Wu J. J., Du G. C., et al, Applied and Environmental Microbiology. 2014, 10(80): 3072-3080.

[5] Zhou J. W., Du G. C., Chen J.. Current Opinion in Biotechnology. 2014. 25: 17-23.

[6] Wu J. J., Du G. C., Zhou J. W., et al, Metabolic Engineering. 2013. 16:48-55.

大肠杆菌高产L-丝氨酸的基因工程菌构建

赵志军1 崔云风1 刘岩2 史吉平1

1中国科学院上海高等研究院 生物炼制实验室，上海 201210；2大连工业大学生物工程学院，大连

116034

摘要：L-丝氨酸是生物体内一种重要的中间代谢产物，现已广泛应用于医药、食品、化妆品等领域。以E. coli W3110为出发菌株，首先以定点突变的方法解除了L-Ser对基因serA编码的磷酸甘油酸脱氢酶的反馈抑制作用，并将该突变基因与其它三个关键酶编码基因serB、serC和pgk进行串联表达；其次，通过随机突变方法，筛选获得了比酶活降低的丝氨酸羟甲基转移酶突变体GlyAm，并进一步考察了敲除丝氨酸脱水酶编码基因对菌株产L-Ser的影响；发酵结果表明，当同时敲除基因sdaA和sdaB时，菌体发酵约35 h后，L-Ser产量最高可达33 g/L，葡萄糖转化率约为18%。

本文来源：https://www.bwwdw.com/article/tsim.html