冰冻切片技术在植物显微结构和组织化学中的应用

切片技术!

第2 6卷第 3期 20 0 9年 6月d i 0 3 6/.sn 10 -6 2 2 0 . 3 0 2 o: . 9 9 jis. 0 89 3 . 0 9 0 . 7 1

生物学杂志J RNA I OG OU L OF B OL Y

Vo _ 6 No 3 I2 .

J n,0 9 u 2 0

冰冻切片技术在植物显微结构和组织化学中的应用谢佩松，中根，存虚徐韦(州大学生物科学与技术学院，苏扬州 2 5 0 )扬江 2 0 9摘要：介绍了冰冻切片法研究植物显微结构和组织化学的一般程序。结果表明，冰冻切片过程简单有效且图版

清晰， 1d内可获得高质量图片，决了利用普通石蜡切片观察植物样品需要进行脱水、在 解浸透、包埋操作且耗时长的问题，植物显微结构和组织化学研究中具有广阔的应用前景。在关键词：冻切片；物；冰植显微结构；化反应组

中图分类号： 3 6 Q一 3

文献标识码： B

文章编号：0 8— 6 2 20}3— o 2一 3 10 9 3 (0 9 0 0 7 O

冰冻切片是利用低温使组织迅速冻结达到一定的硬度进行切片的一种方法。与常规的石蜡切片相比， 冰冻切片因其不经过脱水和透明等步骤，具有快速、简

112仪器 ..

Li M10 e aC 10冰冻切片机， l ps c Oy u普 m

通光学显微镜及其附带的数码相机，h is S M X一 P ip E L l E3境扫描电子显微镜。 0环

便、易操作等特点，在动物和人体的研究中已被广泛应用，但在植物上的应用相对较少，仅在少数植物器官和组织切片中有报道。与动物细胞相比，物细胞植有细胞壁和大液泡，含水量远大于相同体积的动物细胞，冻后的植物样品比动物样品硬度大，以切片和冷难

1 13试剂 ..

Li C e aO T冰冻包埋剂，通胶水， A e普 FA

固定液，.%甲苯胺蓝水溶液，%番红水溶液，.% 01 1 05 固绿水溶液，%间苯三酚 (5乙醇配制) 5%盐酸， 2 9%, 05%乙醇，0乙醇。 0 7% 12试验方法与步骤 .

保持植物组织结构的完整性’。对于一个完整的植

I2 1材料的固定、埋和切片将新鲜材料切成 ..包

物植株，同部位的质地及含水量存在巨大差异，不如何改进冰冻切片技

术，之适用于不同质地的材料，冰使是冻切片技术在植物学研究应用中所面临的一个重要问题。本文利用冰冻切片技术，草本植物水稻和麦冬对

05c . m左右的小段，即投人 F A固定液中，气使立 A抽材料下沉，用前取出材料，双蒸水清洗；用或者直接将新鲜材料放入双蒸水中 1 mn使水渗透到组织内’ 0 i,。

在一0 2℃用 O T包埋剂或普通胶水或双蒸水将样品 C包埋并固定在样品托上，冷冻 3 mn 0 i。调节切片厚度， 进行切片，切片时根据样品的硬度调节切片速度。 122贴片、 ..染色和装片材料切片的贴片和染色按两种方法进行：片后染色和染色后贴片。贴片后染贴

的根、茎和叶进行了冰冻切片，观察它们的显微结构和木质素的显微化学定位，获得了高质量的图片，现将结果报道如下，以期为冰冻切片技术在植物学研究中的推广和应用提供参考作用。1材料和方法

色即直接用载玻片与切片平行靠近，使切片以一定的速度飞向载玻片且展开在玻片上，室温使切片自然干

1 1试验材料、 .仪器和试剂 11 1材料试验材料选取草本植物麦冬和水稻。 .. 麦冬[ p i oo j oi s L￡)K r a 1人工种植 O h pg n a nc ( o p u e— w] G于扬州大学文汇路校区高大乔木下，作为林荫下的地表绿化植物，取生长良好的植株进行试验分析；稻选水

燥并粘在载玻片上，然后再进行染色。染色后贴片即用冷冻的毛笔或镊子将切片转移到盛有冷却双蒸水的小器皿中，进行染色，然后将切片粘贴到载玻片上。切片观察前用水或 2%甘油制成临时装片， 0也可以用指

品种中花 1 (ao i aiyZ ogu I按常规栽培 1 Jp n avr t hnh a1 ) c e方法种植于扬州大学实验田，于灌浆期取水稻剑叶和穗下第二茎节进行试验分析。收稿日期：0 8— 8—1;回日期：09— 9—1 20 0 3修 20 0 2

甲油在临时装片四周进行封固，短期保存。切片的观察利用 Oy ps l u光学显微镜， m用其附带的数码相机进行拍照。切片的甲苯胺蓝染色方法是， 0 1甲苯用 .%胺蓝水溶液染色 2~ m n双蒸水清洗后， 3 i,制成临时装

作者简介：佩松 (9 2一)男，谢 1

8,硕士，现在工作单位：国科学中院上海神经科学研究所； 通讯作者：存虚，— i: x e yu eu c。韦 Ema cw i z. d. n l@

片观察；番红，固绿染色方法是， 1在%番红染液中染色2~ i, 3r n双蒸水清洗后，.%固绿水溶液染色 1mn a 05 i,

基金项目：国家自然科学基金资助项目(0 0 25 3 30 1 )7 2

双蒸水清洗后，制成临时装片观察；切片木质素的组化反应采用 Wi nr e e反应法， s先在 2的间苯三酚溶液中%

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孵育 2m n再用 5%浓盐酸封片， i, 0然后观察。 12 3冰冻切片的亚显微结构观察冰冻切片直接 ..粘贴到盖玻片上，干燥器中干燥，双面胶带将盖玻片用粘在扫描电镜样品台上，离子溅射仪镀金膜，扫描电镜下观察与拍照。2结果与讨论

透明后贴片再封片，均没有取得较好的观察效果，在存的问题主要是切片四周组织与中央组织不在一平面上，法聚焦获得较好的图片。无

使用冰冻切片法对水稻和麦冬根、和叶进行切茎片，其组织结构均很完整，图版也很清晰 ( 12。图，)2 1样品处理与切片效果 . 2 1 1样品固定与切片比较了新鲜材料和 F A固 . . A

定后材料的切片效果，结果表明，固定与不固定对切片没有影响。F A固定的材料，冰冻包埋前需要用双 A在蒸水清洗固定剂 3次，则很难切片。新鲜材料在冰否冻包埋前浸没在水中 1m n切片效果比直接将材料 0 i,进行冰冻包埋好。 2 12包埋剂与切片 ..冰冻切片常用的包埋剂有水、普通胶水和 O T比较分析了这三种包埋剂对冰冻切 C,图 1水稻冰冻切片F g 1 Rie cy s ci n n i c roe t ig o

A:,叶未染色， 3;叶，苯胺蓝染色，×10; D:,质× 0 B:甲 2 C、茎木素组化 ( en r反应， Wi e) s C×2, 0 D×8 OA:l a,u sa n n e f n t i i g,×3 0; B:la,sa n n t o u d n l e; e f t i i g

wi t l i i e b u h×1 0;C,D:se 2 t m,W is e S sa n n,C×2 e n r’ t i i g 0,D×8 0

片的影响，结果表明，水做包埋剂，难切出完整的用较切片； C O T包埋剂与普通胶水效果基本相同，都能切出完整的切片，果在冰冻前将材料浸没在 O T或胶水 如 C

中， O T或胶水充分渗透进组织中，片效果更好。让 C切 2 13切片厚度 ..切片不可过厚，否则细胞重叠不易观察；片也不可过薄，切否则切片不完整，根据试验，叶片厚度以 1 0~1 m效果较好，根和茎的厚度 2 I 5而 0m x为宜。

-翻图 2麦冬冰冻切片

2 14贴片和染色比较分析了贴片后染色和染色 ..后贴片的效果，果表明，结前者的优点是操作简单，切片粘贴在玻片上可以进行滴染，可以将玻片浸没在也染液中进行染色；点是如果切片粘得不牢，色过程 缺染中容易脱片，片在自然干燥过程中，片四周的组织切切Fg2 O hooo pncsc oet nn i p i g n a oi r sci ig p j u y o

A:,根甲苯胺蓝染色， 0 B:,红一绿染色， 0 C:,×7;茎番固×7;根 扫描电镜观察， 4×10A:r o,sa n n t o u d n l e,×7 o t ti i g wih t l i i e b u 0;B:se,sa n n t tm t i i g wi h s r n n—a tg e n,×7 f a a i e f s r e 0;C:r o,o s r e t EM,×1 0 o t b e v d wih S 4

容易卷起，导致无法观察。染色后贴片的优点是在染色后的切片制成临时装片时，片四周组织不会卷起，切

观察效果较好；缺点是操作复杂，染色过程中不小心会将材料丢失，染色后将材料转移到载玻片上也比较麻烦。根据实验结果，我们认为，叶片较薄，色后贴片染较难，采取贴片后染色为好，和根染色后贴片较容茎易，切片较厚，用染色后贴片较好。且采 2 15封片 ..冰冻切片制成临时装片，以用水制成可

2 2样品的染色和组化反应 .

冰冻切片可以不经染色直接制成水装片进行观察，操作简单，物细胞的基本组

织结构清晰，、和植根茎叶都能获得较好的观察效果，如水稻叶片横切，晰显清示叶片的基本解剖结构：皮、肉和叶脉 ( 1A)表叶图 .。

由于冰冻切片没有经过脱水过程，一般不需要特殊处理就可以直接对材料进行染色和组织化学分析。在我

水装片，也可以用 2%甘油制成临时装片， 0前者必须在短时间内进行观察，后者可以保存 1,果用指甲周如油在四周进行封固，以保存一段时间。无论是用水可进行封片还是用甘油，封片前务必保持材料湿润，否则会有许多小气泡在材料中。我们也尝试将冰冻切片制成永久制片，论是贴片后脱水、明、无透封片还是脱水、

们的试验中，别进行甲苯胺蓝单染，分番红与固绿对染， enr Wi e反应等，取得了较好的效果。如经甲苯 s均胺蓝染色，植物细胞的显微结构更加清晰显现 ( 1图一 B图 2A)如果染色时问掌握得好，果更好，物不，一；效植同的组织会被染成不同的颜色 ( 2A)图 .。番红一绿固7 3

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第 2第 3期 6卷 20 0 9年 6月

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复染常用于植物细胞研究中，冰冻切片经番红一固绿复染也可以获得反差分明的图片 ( 2B)图一。与石蜡切片

片、染色、贴片到封片等每一步骤都精益求精。总之，冰冻切片技术如果掌握得好，是进行草本植物细胞学研究简便有效的方法。参考文献：

相比，冰冻切片做组化反应效果更好。Wi nr应法 e e反 s

可以显示木质素在植物细胞中的分布和含量，冰冻对切片进行 Wi nr e e反应， s清晰显示了木质素在厚壁组织

[] 1木月惠，李寒冰，贺新强 .高度木质化材料的冰冻切片技术【] J.植物学通报， 0 1 8 1:1 2 0,1 ( ) 18—10 2.

和维管组织中存在，图片效果较好 ( 1C、 )图一 D。 23冰冻切片亚显微结构观察 .冰冻切片一般较厚，以普通光学显微镜下，所高倍无法获得清晰的图像。我们尝试用 S M观察冰冻切 E片，结果表明，效果非常好，其是对维管组织和厚壁尤细胞 ( 2 C) 图一。

[] 2万怡震，贺普超 .葡萄浆

果冰冻切片技术参数的研究[] J.西北植物学报， 0 1 2 ( )3 2~36 2 0, 1 2:8 8.

[] 3陈丹，赵

洁 .适合于植物花器官的冰冻切片技术[] J .武汉

植物学研究， 0 5, 3 3 25— 9 . 20 2 ( ):8 20

[] 4刘剑锋，云清，阎秀峰， .植物冰冻切片技术的改进[]程等 J.南京林业大学学报 (自然科学版 ) 2 0, 0 3:2, 0 6 3 ( ) 18~10 3.

冰冻切片制作过程中，常有许多因素影响其质量，并进一步影响实验结果的观察和分析。因此，制作一

[] 5刘剑锋，阁秀峰，云清，等.冰冻切片技术在高山红景天细胞程学研究中的应用[] J .东北林业大学学报，0 6 3 ( ) 10 20, 4 4:1 .[]新成，志刚，素丽， .冰冻切片法在植物微管骨架研究 6张李李等中的应用[] J .广西植物， 0 8 2 ( ) 14~16 2 0, 8 2:6 6.

套高质量的冰冻切片对于确保实验结果的科学性、可靠性是极其重要的，就需要从材料切片前处理、这切

Cr o-e to i g t c n q e f r t e o s r a i n o i r s r c ur y s cin n e h i u o h b e v to f m c o t u t e a d h so h m it y i l n n it c e s r n p a t.

XI is n E Pe— o g,XU o g g n,W EI Cu— u Zh n— e nx( o eeo i— inea dBo en l y Y nzo n esy Y n zo 2 0 9, hn ) C l g f os e c n i eh o g, a gh uU i r t, aghu2 5 0 C ia l B c t o v iAb t a t h e e a r c d r so r o s ci n n t o o h b e v to fmi r sr c u e a d h so h mit n p a t s r c:T e g n r l o e u e fc y— e t ig me h d f rt e o s r ai n o c o tu t r n it c e sr i ln p o y

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c s ssmp ea d e in,a d ce rpae o l e a q i e n i ewi i n a . C y -e t n n ov d t e p o l m fp rf n s ci n t a e d d d h d a in,i f tain a d e e me tb f r t n o ed y h r o s c i i g s l e r b e o a a f e t h tn e e e y r t o h i o o n l t n mb d n e o e i r o

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(上接 8 ) e e e t fsRNA— e i t d tb tg n i ncn i FN— 0页 Th f cso i m d a e - e e e sl i g OlI e pr du to o um a o c in fh n CD4 a nd CD8 T y p o y e s bs t l m h c t u esW ANG n .a Ho g t o.GE Xi o s n a . o g.LIBa— i g iq n( .D pr et f m u o g,B nb dcl o ee 1 e a m n o I m nl y eguMei l g; t o aC l 2 nu e a oa r f n ci n m u i t eguMei l o ee B nb 30 0 C ia .A h i yLbrt yo If t na dI m n ya B nb d a C lg, egu23 3, h ) K o e o t c l nAb ta t o iv siae t e e e t o i s r c:T n e t t f cs f s g h RNA s e i c t o - e n I N— p o u t n o u n C M a d C T lmp o ye p c f i f rtb t0 F r d ci fh ma I i y o n D8 y h ct

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