弓形虫病免疫学诊断研究进展
更新时间:2023-07-21 04:39:01 阅读量: 实用文档 文档下载
万方数据
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综述
弓形虫病免疫学诊断研究进展
尤英霞申丽洁+
【摘要】
弓形虫病是严重危害人类健康的人兽共患病,临床表现缺乏特异性,且弓形虫病原学检
出率低。免疫学检测具有敏感、特异、快速、简便等特点,已成为辅助诊断弓形虫病的常用方法。该文综述了弓形虫病免疫学诊断方法的研究进展。
【关键词】
弓形虫病;检测物质;免疫学诊断
Researchprogresson
immunodiagnosisoftoxoplasmosis
YOU
M昭一戈施,SHEN血-jie“1Departmentof
Medicine,Dali
2
Parasitology,College
ofBasicUniversity,Dali671000,China
DepartmentofParasitology,
Kunming
MedicalUniversity,Kunming650500,China
+Correspondingauthor:SHENn-jie,Email:l可&shen@163.con
Supportedbythe
National
NaturalScienceFoundation
ofChina(30960330)
【Abstract】Toxoplasmasis,as
a
parasiticzoonosiswithoutspecificclinicalmanifestations,isseriously
harmful
to
humanhealth.Therefore,establishing
a
sensitive,specific,fastandsimplediagnosismethodis
especiallyimportant.Immunoassayhasbeencommonlyusedinlaboratory.Thisarticleoverviewedtheresearch
advance
on
immunodiagnostictechnologyoftoxoplasmasis.
【Keywords】Toxoplasmasis;material
oftest;Immunodiagnosis
弓形虫是一种世界性分布的专性寄生于人和用最为广泛的抗原,可分为整体抗原和可溶性抗动物有核细胞内的寄生原虫,引起人兽共患弓形虫原。整体抗原可以是寄生虫生活史中的任何一个病(toxoplasmosis),尤其是在孕妇及免疫缺陷的患阶段,也可以是整虫、虫体的石蜡切片或冰冻切片;者轻度感染即可引起严重后果011。寄生虫病的诊可溶性抗原包括粗抗原和部分纯化抗原,有不少方
断金标准是检出寄生虫病原体,但由于弓形虫寄生
法是应用寄生虫不同发育阶段的组织匀浆和提取
于宿主细胞内,病原学检测取材较为困难。弓形虫
物作为免疫检测的可溶性抗原。应用最为广泛的
病缺乏特征性临床表现,临床诊断也较为困难。因有速殖子表膜抗原和排泄一分泌抗原。
此,免疫学的辅助诊断在弓形虫病的诊断中显得尤
为重要。
1.1.2表膜抗原
虫体表膜是虫体与宿主接触的界面,也是宿主
1
弓形虫病免疫学诊断的检测物质
识别寄生虫抗原并产生免疫应答的主要作用部位。
弓形虫是一种生活史复杂的寄生虫,其生活史弓形虫的表膜抗原主要有主要表面抗原1(suYface
的滋养体、包囊、假包囊发育阶段的抗原及其刺激antigen
1,SAGl)、主要表面抗原2(SAG2)和主要表
机体所产生的抗体都可作为弓形虫病免疫学的检
面抗原3(SAG3)。SAGl又称P30,是速殖子特异性
测物质。抗原。Pietkiewioz等。2o以重组的SAGl建立了
ELISA方法,检测疑似急性弓形虫病患者血清IgG1.1抗原抗体,灵敏度为98.6%,与致密颗粒抗原(dense
1.1.1虫体抗原
granule
antigen,GRA)1和GRA7同时使用,灵敏度
虫体抗原也称体抗原,是寄生虫免疫检验中应
可达100%。又称P22,在弓形虫入侵宿主细胞及其繁殖中起重要的作用。SAGl和SAG2是主要特异DOI:10.3760/cma.j.issn.16734122.2012.01.008
性抗原,都是速殖子表面抗原。SAG3又称P43,是基金项目:国家自然科学基金(30960330)
作者单位:1671000大理,云南省大理学院基础医学院寄生虫学教研弓形虫所有入侵阶段的一个膜蛋白,是参与弓形虫室;2650500昆明,昆明医学院寄生虫学教研室
入侵宿主细胞的一个主要分子,主要介导弓形虫对+通信作者:申丽洁,Email:lijieshen@163.cDm
宿主细胞的识别和黏附,Lee等。31实验发现SAG3
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能诱导宿主产生Thl免疫应答反应,增强机体免疫
作用。
1.1.3排泄 分泌抗原
排泄一分泌抗原又称代谢抗原,主要来自活虫体的排泄分泌产物、酶类及脱落的表皮、死亡虫体的
崩解产物等。弓形虫的排泄.分泌抗原主要有棒状
体蛋白(rhoptryprotein,ROP)、微线体蛋白
(micronemeprotein,MIC)和致密颗粒蛋白(dense
granule
protein,GRA)。ROP参与纳虫泡形成,目前
研究最多的是ROPl和ROP2。ROPl主要用于检测
急性弓形虫感染者IgM和IgG抗体低亲和力的患者,对弓形虫感染早期的诊断有较高的灵敏性和特
异性。Holec—Gasior等Ho用弓形虫ROPl作为抗原检测了37份急性弓形虫感染者的血清和90份慢性
感染者的血清,阳性率分别为94.6%和15.5%,认
为ROPl重组蛋白可以用于弓形虫急性感染者的免
疫诊断。ROP2,又称P54,它在弓形虫的速殖子、缓殖子以及子孢子期均有表达,ROP2能诱导机体产
生系统性Thl和Th2型免疫应答及以IgG抗体为主的体液免疫应答。MIC是弓形虫侵入宿主细胞后顶
端复合体微线体中的蛋白,其中MIC2蛋白是弓形虫感染的主要毒力因素。MIC3在弓形虫的速殖子、缓殖子和子孢子期都能表达,MIC3能明显识别低亲和力IgG抗体,可以区分孕期弓形虫急性期和2个
月内的感染∞』。速殖子致密颗粒蛋白有12种,其中GRAl能稳定纳虫泡膜,对检测感染血清的IgG有
较好的免疫反应性。GRA2在弓形虫侵入后起着诱导纳虫泡表面网络结构形成的作用,重组GRA2可
用于弓形虫急性感染患者的免疫诊断。4o。GRA3在
弓形虫侵入宿主细胞后也发挥着较为重要的作用,能为虫体获取营养,急性感染时其特异性和敏感性均较高。GRA4能刺激机体产生特异性抗弓形虫抗
体。有些GILA还可作为诊断急慢性弓形虫病感染和鉴别虫株毒力的抗原∞一。
1.1.4循环抗原(circulatingantigen,CAg)
7
CAg是弓形虫急性感染期虫体分泌代谢产物形
成的抗原成分。在弓形虫感染早期或急性期用亲和素.生物素-酶联免疫吸附试验、双抗体夹心酶联免疫吸附试验、对流免疫电泳等免疫学方法从血清或体液中直接检测弓形虫CAg是早期确诊弓形虫
感染的可靠方法。
万方数据
1 2抗体
.
弓形虫侵入机体后,随着感染时间的推移机体能产生相应抗体、免疫细胞和免疫分子以杀灭、清
除弓形虫,人体感染弓形虫后可以检测到IgM、IgG、
IgA、IgE等抗体。其中IgM是机体最早出现的抗体,IgM阳性提示机体有近期或急性弓形虫感染。IgG阳性提示机体感染或曾经感染过弓形虫,一般
为慢性感染。IgA阳性提示机体有急、慢性感染。
IgE和IgG同时出现,有助于近期感染的诊断。弓形虫的免疫学抗体检测技术可分为两大类:一是检测患者血清中的抗虫体表膜抗体,主要有免疫酶联
吸附凝集试验、直接凝集试验、间接荧光抗体试验
等。二是用虫体裂解后的提取物为抗体,主要检测针对虫体抗原成分的抗体,主要有酶联免疫吸附试验、间接血凝试验等。但在一些应用免疫抑制剂、艾滋病、肿瘤患者及弓形虫病早期抗体水平很低时,血清抗体不易检测。
2
弓形虫病常用的免疫学诊断技术
免疫诊断是目前进行弓形虫感染调查、临床弓形虫病诊断的常用方法。急性期以检出弓形虫特
异性IgM抗体或弓形虫循环抗原为可靠指标,也可观察特异性IgG抗体的动态变化;慢性期则以检测弓形虫IgG抗体为主。
7
2.1染色试验(dyetest,DT,)
染色试验是弓形虫血清学检测的特有方法,是
采用活滋养体在有辅助因子(补体)的参与下,与待
测血清中特异性抗体作用使虫体细胞变性而不为亚甲蓝着色。目前仍然是弓形虫抗体检测的金指标¨o。其优点是特异性强、敏感性好和重复性好,
但由于本试验需要活虫,含辅助因子的正常血清须
经筛选获得、活虫保存和制备较困难而使应用受到
一定限制,此法现已少用。
2.2
间接荧光免疫试验(indirectfluorescence
an.
tibody
test,IFAT)
IFAT诊断弓形虫病是根据患者血清中抗虫体
表膜的抗体与抗原相结合的原理,用完整的速殖子做抗原,荧光素标记第二抗体,在荧光显微镜下快速检测样本中特异性IgM抗体或IgG抗体的技术。IFAT法可检测血清中和组织内的抗体。Miller等¨J
采用IFAT法检测经免疫组化和病原学分离的28例阳性和46例阴性者的血清,发现其敏感性达
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万方数据
96.4%、特异性为67.3%。Garcia等一1应用IFAT、
ELISA法对弓形虫感染在第6天开始检测猪的血清
样品,发现IFAT法检测抗体水平在感染后35d达
高峰,ELISA法检测42d达高峰,两者的诊断符合率达73.3%,敏感性达94.3%。认为IFAT法具有特异、敏感、快速、简便、重复性强等优点,对弓形虫病具有早期诊断价值。但IFAT需要用荧光素标记
第二抗体,结果判断需用荧光显微镜,仪器设备要
求较高,在一些偏远地区无法推广;如果血清中有类风湿因子或抗核抗体时也可出现假阳性反应,使
用上受到一定限制。
2.3
间接血凝实验(indirecthemagglutinationtest,IHA)
IHA是目前在寄生虫病免疫诊断中最常用的方
法之一,具有操作简便、微量、快速、特异、廉价等特点,可以快速筛选出大量的阴性样品,且商品试剂易得,适合隐性感染辅助诊断和大规模血清流行病学调查。研究者先后建立了以弓形虫滋养体(速殖子)抗原和代谢分泌抗原致敏绵羊红细胞的IHA方法,前者能检测出抗体的时间为感染后7d,检出率
为100%,后者能提前2d检测出血清中的抗体,检
出率100%;改良凝集试验(MAT)被认为是特异敏感的检测方法,但存在着检测费时、费用高等缺点oto]。邓茂刚H叫用IHA方法与DT试验同时检测49份猪血清样品,结果认为IHA法的特异性和符合率都比较高,但对弓形虫急性感染敏感性较低。该
法的的缺点是致敏红细胞不稳定,不能提供检测抗
体的亚型类别,易发生异常的非特异凝集,敏感性相对较低、重复性差,抗原保存期短等,另外抗原的标准化和操作规范化也有待解决。
2.4
酶联免疫吸附试验(enzyme
linkedimmu-
nosorbent
assay,ELISA)
ELISA是目前应用最广的酶免疫测定技术。用ELISA辅助诊断弓形虫病是用虫体裂解后的提取物为抗原,主要检测针对虫体抗原成分的抗体,它利
用酶的催化作用和底物放大反应原理,提高特异性
抗原一抗体反应检测灵敏度。ELISA可检测抗弓形虫的IgM、IgG、IgE、IgA抗体及CAg。此法操作易自动化和标准化,具有高度的敏感性和特异性,重复性好,简单经济,可用于定性和定量检测及流行病
学调查。李雪秋等¨21应用ELISA检测30份弓形虫
感染小鼠的血清,检出率为100%,认为该方法敏感
度高、重复性好、特异性强。Lynch等¨纠蘑用ELISA
对弓形虫眼病患者泪液中的抗弓形虫分泌型IgA进
行检测,发现ELISA法能准确地检测和鉴别弓形虫
感染。陈代雄等¨41用双抗夹心法对广州市201只猫、狗所采集的唾液进行弓形虫IgG抗体的检测,结果为:猫唾液样本114份,阳性27份,阳性率为
23.7%;狗唾液样本87份,阳性18份,阳性率为
20.7%。上述研究结果显示:通过对感染弓形虫的人或动物体液中的特异性抗体或循环抗原进行ELISA检测,可以敏感、快速、简便地对弓形虫感染进行免疫诊断,且取材方便,适用于弓形虫病大规模流行病学调查。但ELISA检测弓形虫抗体在免疫缺陷的患者敏感性不高,检出率低,仍需进一步探讨和完善。
2.5斑点酶联免疫吸附试验(dotenzyme
linked
immunosorbent
assay,Dot—ELISA)
Dot.ELISA是ELISA法的发展和改进,是将虫
体抗原或抗体滴加吸附于硝酸纤维薄膜表面,通过与相应的抗体或抗原和酶标记抗体的一系列免疫反应,形成酶标记抗原抗体复合物,再加入底物反应后形成有色沉淀物使薄膜着色,然后目测或用光
密度扫描仪定量。Rilling等015]将肤速免疫诊断试
剂和传统血清分析方法联合研制成功的试剂盒诊
断新生儿的先天性弓形虫病的阳性率达94%。研究者以Dot—ELISA、IHA及SPA—EuSA诊断猪弓形
虫病,证明Dot—ELISA优于其它两法,且有较高的特
异性u6|。该法操作简单快捷,肉眼即可判断检测结果,不需要特殊的实验设备,可同时检测大量样本,
适合于基层临床诊断和大规模流行病学调查。
2.6亲和素-生物素-酶联免腋吸附试验(avidin-
,
biotin-enzymelinkedimmunosorbentassay,ABC-
ELISA)
ABC.ELISA是在酶联免疫吸附试验基础上利
用亲和素一生物素系统的多级放大结合特性发展起来的免疫学技术,大大提高了ELISA检测的灵敏度。实验研究表明亲和素.生物素一酶联免疫吸附试验可检测弓形虫抗原最低浓度是0.075斗∥ml,而单.多抗夹心ELISA检测弓形虫抗原最低浓度为0.600斗∥Mlll7]。本法显色清晰、灵敏度高、假阳性率低。研究者用ABC—ELISA和常规ELISA实验比
较,结果前者比后者灵敏2.75倍,认为ABC.ELISA
是检测弓形虫的特异而又灵敏的方法¨6|。为弓形
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虫微量抗原/抗体的检测开辟了一条新道路。
2.7
免疫金标记技术(immunogold
labellingte.
chique,ILA)
ILA是以胶体金作为示踪标记,应用于抗原抗体反应中的一种免疫标记技术。目前胶体金标记技术诊断弓形虫病的方法有斑点免疫金渗滤法(dot
immunogoldfiltration
assay,DIGFA)、免疫金银染色
法(immunogoldsilver
staining,IGSS)、胶体金免疫
层析法(gold
immunoromatography
assay,GICA)等。
黄陵等H副用DIGFA与IHA法对260名正常体检者血清和232名肿瘤患者血清进行检测,总符合率为99.39%。DIGFA适合于间接法检测抗体或捕获法检测IgM。研究者以弓形虫虫体作抗原,用IGSS法检测弓形虫抗体,结果与IFAT高度一致,反应仅需
2h[19I。李克生等㈣1以纯化弓形虫分泌抗原做胶体
金标记,装制成弓形虫抗体金标检测卡检测弓形虫抗体阴性和阳性质控品的符合率为100%,在临床检测恶性肿瘤患者、孕产妇和健康体检者,结果弓形虫抗体金标检测卡检测与ELISA试剂盒检测结果的符合率达到96%。李昕等旧u用GICA与ELISA法比较检测105份小鼠血清中循环抗原,两
者符合率为95%,认为GICA检测血清中的循环抗
原具有高度的灵敏性和特异性。Huang等。221用胶体金标记弓形虫谷胱甘肽S一转移酶(GST)融合蛋白(G.rSAG2t)抗原,用夹心法建立金标试纸条检测弓形虫病,其敏感性达100%。免疫胶体金技术不需使用放射性同位素或有潜在致癌性的酶显色底物,且快速、准确、简便,具有高度的特异性和敏感性,结果直观可靠,试剂和样品用量极少,操作过程简单,适合基层和现场使用,是目前发展最快的复合
型免疫技术之一。2.8其他免疫技术
除了上述方法外,还有一些其他免疫学方法应用于弓形虫病诊断。免疫印记(immunoblotting)又称蛋白质印记(Westernblotting)可用于检测弓形虫感染宿主后针对某抗原的抗体,是一项高灵敏和高
特异的诊断方法,对诊断先天性弓形虫病也较为敏
感。Rilling等¨副用蛋白印记试剂检测175例婴儿血清,其敏感性和特异性分别为67%和96%。
PCR—ELISA(polymerasechainreaction—enzyme—linked
immunosorbent
assay)是在PCR基础上与ELISA结
合的一种检测方法,此检测综合PCR的灵敏性、核
万方数据
酸杂交的特异性以及ELISA的酶联放大作用,故而是一种快速、特异、敏感、稳定的检测方法。李健
等口副用生物素标记的PCR产物与地高辛标记的特异性探针杂交建立了PCR—ELISA方法,通过酶免显色反应测吸光度值,其检测阈值为20%弓形虫
DNA,灵敏度为电泳法的10倍。由于该法采用酶标
板进行吸光度值的测定,因此可以同时检测大量标本,降低了成本,适用于流行病学调查。此外,将
DNA探针技术及PCR用于临床弓形虫感染的检测,也取得较好的效果。
3总结
近年来,随着免疫学理论和技术的不断进步,弓形虫病的免疫诊断研究取得了较大的发展。目
前,IHA、ELISA法由于其简便、快速、特异、敏感等优点仍是临床诊断中最常用的方法。但存在着抗原抗体的纯度不够高,假阳性、假阴性等因素影响诊断结果,因此,该病的免疫学诊断的发展方向主要是寻找特异性抗原和改进诊断方法,使其更特异、敏感、简便、快速和准确。目前有应用多种免疫学方法相结合的检测技术来提高诊断的敏感性和特异性汹]。相信在研究者的不断努力下,在研发新技术的同时让传统的诊断方法与新技术相互融合补充,为弓形虫病的诊断提供更多可供选择的方法,弓形虫病的诊断技术将会日趋完善。
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