蛋白纯化学习笔记

1. 膜蛋白质可以分为膜周蛋白质和内膜蛋白质。膜周蛋白质松散地同细胞膜相互作用，当它们从生物膜上解离出来后通常是能够溶于水的。对膜周蛋白质的操作通常要比对内膜蛋白质的操作相对容易一些。内膜蛋白质在水溶液中是不溶的。它们一般由一个或多个跨膜片段构成。其中跨膜的成分由单链的及成簇的α螺旋或β折叠结构组成，相应的膜蛋白质则被称为α螺旋膜蛋白质或β折叠膜蛋白质。β折叠膜蛋白质在革兰氏阴性菌及线粒体的外膜中含量较多。

2. 在起始溶解实验中，DDM通常是一种较好的去污剂。

3. 膜蛋白通常是作为蛋白－脂类－去垢剂的复合物来进行纯化的。进行膜蛋白纯化需要在所有溶液中都含有去垢剂。因为蛋白质－去垢剂复合物是动态的，在自由去垢剂分子不存在的情况下，去垢剂分子会立即解离下来。去垢剂分子的浓度应该在其CMC值以上但是可以固定在溶解时所加浓度的10倍以下（通常是在0.1％的浓度范围内）

4. 在整个纯化过程的所有缓冲液中加入5％甘油通常能够提高膜蛋白的溶解度。

5. 批量纯化是指在一个指定时间内将样品与色谱层析介质在一个开放的容器内混合，一般是过夜混合。然后，将这个悬液装入一根柱子内进行漂洗以及洗脱。批量纯化有时能够提高产量，因为样品与介质的吸附时间比柱上分离要长。另一方面，正因为实验过程长，批量纯化会使得蛋白更易于遭受到蛋白酶降解或者导致失活，并且因此降低纯化蛋白的质量。 6. 避免在阴离子交换层析柱使用阴离子去垢剂，在阳离子交换层析柱上使用阳离子去垢剂。 7. 膜蛋白通常不会迁移在SDS-PAGE上预测分子量的位置处。它们一般会迁移得快一些（也 就是看起来较小），这可能是因为折叠得不完全或者每个分子量单位比水溶性蛋白结合 了更多的SDS。

8. 降低生长速度能够帮助表达并因此减少包涵体形成的几率。把生长温度降低到20－30℃之间可以降低细胞生长速率。对于那些在可诱导启动子控制下的蛋白表达，可以通过改变诱导条件来降低表达速度。

? 在低细胞密度下诱导（A600＝0.5） ? 缩短诱导时间

? 使用低浓度诱导剂（如0.1mM IPTG）。 9.

高压匀浆（在20 000 psi下用French press进行 3轮破碎）能够减小细胞碎片，因此在离 心时可以与包涵体立即分离。

细胞破碎后，加入Dnase（如10－20μg/ml）将减少污染DNA，而加入去垢剂（如1％Triton X-100）能够减少与包涵体相连的膜物质。 10.蛋白复性方法比较 复性技术 透析 稀释 分子筛层析 离子交换层析 优点 简单 简单 在一步操作中直接进行自动化复性并纯化 快速并且简单直接进行自动化 缺点 慢使用大量缓冲液 慢蛋白稀释到很低浓度（10-50ug/ml） 样品体积受限 应该避免使用与离子交换带相反电荷的添加剂 11.

避免使用磁性转子以免损伤介质。

如果不能产生推荐流速，请使用泵能够提供的最大流速。 不能超过介质或者柱子所能承受的最大压力。 在纯化期间不能以超过75％的装柱流速运行。 12. 1 MPa = 10 bar = 145 psi

1.离子交换：利用各种分子的可离解性、离子的净电荷、表面电荷的差异而进行选择分离。 2.蛋白洗脱的顺序并不能完全确定的预测出来，因为滴定曲线（通过电泳的迁移率而得出）反应的是整个蛋白的净电荷，而离子交换色谱层析反应的是蛋白表面的净电荷。 3.填料的强和弱是指功能基团的离子化状态随着pH的改变而改变的程度，而不是功能基团同蛋白分子结合能力的强弱。

4.大多数蛋白质等电点在5.5-7.5之间。

5.理想情况下，样品应与起始缓冲液具有相同的条件。

6.蛋白通常在偏离等电点0.5个pH单位，离子强度在0.1M附近时开始从离子交换填料上开始解离。

7.对于带点性质未知的样品： 阴离子交换：（Q、DEAE、ANX） 起始缓冲液：pH 8.0

洗脱缓冲液：起始缓冲液加1M Nacl, pH 8.0

阴离子交换：（S、SP、CM） 起始缓冲液：pH 6.0

洗脱缓冲液：起始缓冲液加1M Nacl, pH 6.0

8.使用弱离子交换剂的时，在下面pH的使用范围使用能够将效果的浮动减至最小 DEAE：pH 2-9； ANX ：pH 2-9 ； CM ：pH 6-10

9.使用足够维持缓冲能力及恒定pH的缓冲液浓度，典型为20-50mM，对于尺寸在90um以上的颗粒，用1um膜过滤溶液，34um的，用0.45um膜，15um之下的，使用0.22um的膜过滤。 10.准备缓冲液的温度应与使用时的温度相同；温度＜10℃时可以最小化样品之间的疏水性相互作用；在低温下纯化可以代替加入去污剂来增大溶解性的方法。 11.放大原则：

a.在小规模进行分离条件优化

b.维持柱床高度，样品浓度，样品体积及填料体积的恒定 c.通过增加分离柱的横截面积（直径）来增加分离柱的体积

d.使用小分离柱一样的线性梯度，以及相同的梯度体积与柱床体积的比值 12.色谱聚焦：根据蛋白质等电点的不同将他们分离纯化的技术。

13.色谱聚焦可分离等电点差异小至0.02pH单位的分子；色谱聚焦用于高分辨率，分析性的分离纯化；

14.样品稳定性测试：

a.在pH 2-9之间，每隔1个pH单位测定蛋白的稳定性

b.每隔0.5M浓度，测试在0-2M Nacl及0-2M （NH4）2SO4之间的盐离子稳定性 c.每隔10%浓度，测试对于0-50%乙腈和甲醇的稳定性 d.每隔+10℃，测试蛋白在4℃-40℃的温度稳定性

e.将一份样品放置过夜，测试其稳定性及蛋白酶切的发生与否。对每个样品离心，测定上清活力及280nm的紫外吸收

15.在细胞培养中，酚红常作为pH指示剂，。尽管不会直接纯化过程，但酚红可能会同某些纯化填料相结合。现已知可同pH在7以上的阴离子交换填料相结合。 16. PH就是氢离子浓度的负对数。

酸度系数，又名酸离解常数，代号Ka值，在化学及生物化学中，是指一个特定的平衡常数，以代表一种酸离解氢离子的能力。

对于弱碱性药物，有PH=PKa+lg[ B ]/[BH+] 对于弱酸性药物，有PH=PKa+lg[A-]/[HA] pKa越小，酸性越强，反之pka越大，酸性越小 17.柱填充注意事项：

a.如果推荐流速不能获得，使用泵所能提供的最大流速 b.不能超过填料或分离柱的最大运行压力 c.任何纯化步骤的流速不能超过装柱流速的75%

d.对称因子应尽可能接近1，对称因子的可接受范围是0.8-1.8

e.样品峰前端延伸较长表明调料装填太紧；而拖尾现象表明填料填充的太松

1.疏水层析：疏水相互作用层析根据蛋白表面疏水性的不同，利用蛋白和疏水层析介质疏水表面可逆的相互作用来分离蛋白。

2.钠、钾或铵的硫酸盐具有相对高的沉淀作用，并且对蛋白的结构具有一定的稳定作用。 3.结合到介质上的蛋白量几乎和盐的浓度在某个浓度下呈线性相关，在更高浓度下，几乎呈指数增长，如果蛋白不稳定或稳定性未知，最好在线性区间进行蛋白和填料的结合。 4.使用高浓度的储液来调节盐浓度，避免加入固体颗粒盐时局部盐浓度过高而沉淀。 5.直接调节样品PH,疏水相互作用对pH不敏感，不需要完全的缓冲液交换。 6.

a.在给定的浓度下，和其它的盐相比，硫酸铵能够给出最好的分辨率，它可以使用的最高 浓度是2M。

b.3M的盐浓度通常需要使用氯化钠。

c.硫酸钠是一种非常好的盐析试剂，但是在高浓度下，蛋白稳定性的问题可能会阻碍它的 应用。

d.硫酸铵在pH高于8.0的情况下不推荐使用。

7. 对于疏水相互作用，选择缓冲液离子并不致关重要。最经常使用磷酸缓冲液，pH5-8.5对于最终的选择性和分辨率的影响都非常小. 。pH的增加减弱疏水相互作用，在pH高于8.5或低于5的时候，蛋白的存留会更加显著的改变。通常使用20-50mM 的缓冲液浓度，这些足够在样品上样或盐浓度改变时稳定缓冲能力。 8. 对于疏水性未知的样品，尝试以下配方： 起始缓冲液：1.5M 硫酸铵，50mM 磷酸钠, pH7.0 洗脱缓冲液：50mM 磷酸钠， pH7.0

9. 大多数条件下，增高温度会增强疏水相互作用，所以在更低的温度工作（通常低于10 度）能够使由于疏水相互作用而导致的样品组分间的聚集最小化。降低温度可以作为通 过加入去垢剂来提高可溶性的替代方案。

确保样品，柱子，起始和洗脱缓冲液都在同样的温度。注意，温度也会影响样品和缓冲液 的黏度。

1.反相层析介质的表面通常比疏水层析介质更加疏水。这导致更强的相互作用，以至于为了成功的洗脱，需要用非极性的有机溶剂比如乙腈或甲醇。通过在更极性的，变性能力更弱的环境下工作。

2.蛋白在280或254nm检测，寡核苷酸在260nm检测，肽在215nm检测。 3. 离子对试剂

增加带电组分的疏水性，提高其与填料的结合，并因此改变滞留时间的通常方法是向洗脱液中添加离子对试剂。这些试剂通过离子相互作用和带电基团结合，因此抑制它们对整体疏水性的影响。由于大多数蛋白和肽具有轻微的碱性，离子对试剂通常是酸，比如三氟乙酸

1.组分离：30%总柱体积；精细分离：2%-5%总柱体积 2.样品通常不要超过70mg/ml。

3.缓冲液中使用150 mM Nacl ，防止样品与柱料的非特异性吸附。

4.当目的蛋白的分子量未知的时候，从superdex 200开始使用。分离肽段，寡核苷酸和分子量低于10000的小蛋白时，从superdex peptide或superdex 30制备级开始使用

1.亲和色谱分离蛋白是以一个蛋白（或一组蛋白）与特异性配体配对到色谱基质上，并且蛋白与配体之间可逆的相互作用为纯化基础的。 2.典型的生物间相互作用： 酶-底物类似物，抑制剂，辅助因子 抗体-抗原，病毒，细胞

凝集素-多糖类，糖蛋白，细胞表面受体，细胞

核酸-互补碱基序列，组蛋白，核酸聚合酶，核酸结合蛋白 激素，维生素-受体，载体蛋白

谷胱甘肽-谷胱甘肽-S-转移酶或GST融合蛋白

金属离子-聚His*6融合蛋白。天然蛋白具体组氨酸，蛋白有半胱氨酸和色氨酸残基 3.洗脱方式：

pH值洗脱，离子强度洗脱，竞争性洗脱，降低洗脱液的极性，促溶洗脱

4.重组蛋白A通过基因工程生产，包括一个C-端半胱氨酸，可以通过单点耦合到Sepharose上。单点耦合增强了结合容量

5.蛋白质G来自G链球菌组的细胞表面蛋白，是III Fc受体型蛋白。

6.蛋白质A来自金黄色葡萄球菌属，包含有5个区域，可以用来结合IgG的Fc区域。 7.硫酸钾（0.5M）能够被用于替代硫酸铵。

8.为了提高IgY的回收率或某一特定IgY抗体的回收率，可以用0.6-0.8M硫酸钠代替0.5M硫酸钾 9.

Cu能够提供很强的结合，并且一些蛋白质只能结合Cu，加载溶液60%

Zn能够提供较弱的结合，并且在许多情况下，它可以被用于获得选择性的洗脱蛋白质混合物，加载溶液85%

Ni经常用于纯化带多聚His的融合蛋白，加载溶液50% Co 和Ca也可以选择

1.Protein G:20mg h IgG/ml凝胶 2mg G蛋白/ml 凝胶 2.Protein A:30mg h IgG/ml凝胶 6mg A蛋白/ml 凝胶 3.rProtein A:50mg h IgG/ml凝胶 6mg A蛋白/ml 凝胶 4.Mabselect 30mg h IgG/ml凝胶 5.Mabselect Xtra 40mg h IgG/ml凝胶 6.Mabselect SuRe 30mg h IgG/ml凝胶

7.HiTrap IgY Purification HP 20mg纯的IgY/ ml凝胶 8.HiTrap IgM Purification HP 5mg h IgM/ ml凝胶 9.储存纯化后蛋白的一般条件

a.在高浓度的硫酸铵溶液里以沉淀的形式保存，如在4M硫酸铵里保存 b.冻存在50%的甘油中，这种特别适用于酶类

c.如果样品要用于生物活性检测或者用于体内实验，都不能加入保存试剂，此时应把样品小量分管冻存

d.尽量避免反复冻融和干燥溶解操作，因为这样会降低其中的生物活性

10.某一些蛋白质，如M IgG3的某些亚类型。不能保存在4℃中，因为蛋白在此温度下会沉淀（冷沉淀蛋白），这种蛋白应保存在含有保存液的室温环境中

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