化学药物刺激性、过敏性和溶血性试验研究的内容及其目的和意义

引言

化学药物刺激性、过敏性和溶血性研究必须执行《药物非临床研究 质量管理规范》。试验设计应遵循随机、对照、重复的原则。化学药物刺激性、过敏性和溶血性研究试验设计应结合毒性的发生机制、影响因素、临床意义和药物临床应用的适应症和给药方法等来考虑。

动物种属的选择应依据拟采用的试验模型和观察的指标。动物的性别、年龄和生理状态应符合拟采用试验方法的要求。试验用药物应与用于人体的制剂一致。给药方式（包括剂量、途径和方案）应根据所采用的试验模型和拟定临床应用的情况来决定。观察部位应选择给药部位，同时考虑选择周围组织或可能暴露于受试药物的部位。如果其他非临床安全性研究（如长期毒性）的受试物与拟进行临床研究的制剂相同或具有可比性，其研究结果可反映化学药物刺激性、过敏性和溶血性中的某一毒性，则可不进行相应的毒性研究。

进行化学药物刺激性、过敏性和溶血性研究时应尽可能明确受试物的成分（包括主药、辅料和杂质等的名称和量）。有相同给药途径上市制剂刺激性和/或过敏性和/或溶血性研究提示有一定毒性时，应与已上市制剂进行比较性研究，毒性应相当或更小。比较性研究的样本例数的确定应遵循统计学的基本原理。由于动物试验存在一定的局限性，因此进行化学药物刺激性、过敏性和溶血性评价时，应结合药学、药理、毒理及临床应用进行综合评价，明确药物是否能进行临床应用及临床应用时应关注的问题等。 1化学药物刺激性

刺激性是指非口服药物制剂给药后对给药部位产生的可逆性炎症改变，若给药部位产生了不可逆性的组织损伤则称为腐蚀性。 1.1化学药物(外用)刺激性试验的内容 1.1.1试验动物

首选家兔，动物数 4-8 只，雌、雄各半。应设赋形剂对照，采用同体左右侧自身对比法。试验前24 h对给药区（通常在背部）进行脱毛处理（可剪、剃或用适宜的脱毛剂）。去毛范围左、右各 3cm×3cm。给药前应检查去毛皮肤是否因去毛而受损伤，有损伤的皮肤不宜进行试验。但若需考察破损皮肤的刺激性，则可在用药部位用砂纸磨或划“井”字并以渗血为度。

1

1.1.2受试物的给予

取受试物0.5 ml直接涂布于一侧已去毛的皮肤上，然后用二层纱布（2.5 cm×2.5cm）和一层玻璃纸或类似物覆盖，再用无刺激性胶布和绷带加以固定；另一侧涂布赋型剂做对照。贴敷时间至少4h。贴敷结束后，除去受试物并用温水或无刺激性溶剂清洁给药部位。多次给药皮肤刺激性试验应连续在同一部位给药，每次给药时间相同，贴敷期限一般不超过4w。 1.1.3动物观察

在自然光线或全光谱灯光下观察皮肤反应。参照表1给出的评分标准对皮肤红斑和水肿进行评分。

表1皮肤刺激反应评分标准

刺激反应 红斑 无红斑

轻度红斑（勉强可见） 中度红斑（明显可见） 重度红斑

紫红色红斑到轻度焦痂形成 水肿 无水肿

轻度水肿（勉强可见） 中度水肿（明显隆起）

重度水肿（皮肤隆起 1mm，轮廓清楚） 严重水肿（皮肤隆起 1mm 以上并有扩大） 最高总分值

表2皮肤刺激强度评价标准

分值 0 1 2 3 4 0 1 2 3 4 8

分值 0-0.49 0.5-2.99 3.0-5.99

评价 无刺激性 轻度刺激性 中度刺激性 2

6.0-8.0 强刺激性

单次给药皮肤刺激性试验，在去除药物后 30-60min，24、48 和72 h肉眼观察并记录涂敷部位有无红斑和水肿等情况。如存在持久性损伤，有必要延长观察期限以评价上述变化的恢复情况和时间。但延长期一般不超过 14d。对出现中度及以上皮肤刺激性的动物应在观察期结束时对给药局部进行病理组织学检查。

多次给药皮肤刺激性试验，在每次去除药物后 1h以及再次贴敷前观察及记录红斑及水肿、涂敷部位是否有色素沉着、出血点、皮肤粗糙或皮肤菲薄情况及其发生时间及消退时间，并对红斑及水肿进行评分。末次贴敷后，在去除药物后 30-60 min，24、48和72 h肉眼观察并记录涂敷部位有无红斑和水肿等情况。如存在持久性损伤，有必要延长观察期限以评价上述变化的恢复情况和时间。但延长期一般不超过14d。对出现中度及以上皮肤刺激性的动物应在观察期结束时对给药局部进行病理组织学检查。 1.1.4结果评价

单次给药皮肤刺激性试验，计算每一观察时间点各组受试物及赋形剂皮肤反应积分的平均分值。将受试物皮肤反应积分的平均分值减去赋形剂皮肤反应积分的平均分值得到原发性刺激指数，按表2进行刺激强度评价。多次给药皮肤刺激性试验，首先计算每一观察时间点各组原发性刺激积分均值，然后计算观察期限内每天每只动物刺激积分均值即累积刺激指数，按表2进行刺激强度评价。 1.1.5试验意义

观察动物皮肤接触受试物后所产生的刺激反应，提示药物临床应用后皮肤可能出现的炎症、组织变性和坏死等不良反应。该试验系统比人皮肤刺激反应敏感，刺激反应阴性大多可确定为无刺激性，阳性反应要排除假阳性。除非受试物有大范围或长时间的使用，否则轻度刺激性可不予重视。 1.2注射用化学药物刺激性试验的内容 1.2.1试验动物

首选家兔，动物数每组不少于 3 只。应设生理盐水对照，可采用同体左右侧自身对比法。用药部位根据药物的给药途径确定，可选用耳缘静脉，耳中心动

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脉（其它动物可选用前、后肢静脉及股动脉等），股和背部肌肉，侧胸壁皮下组织，静脉旁组织等。 1.2.2给药方法

按临床使用情况给予受试物，给药容积和速率应根据动物情况进行相应的调整。给药期限应根据药物拟用于临床的情况来决定，多次给药一般不超过 7 d。 1.2.3动物观察

单次给药刺激性试验，在给药后48-96 h对动物和注射部位进行肉眼观察；多次给药刺激性试验，每天给药前以及最后一次给药后 48-96 h对动物和注射部位进行肉眼观察。观察期结束时应对部分动物进行给药部位组织病理学检查。留下的动物根据受试物的特点和刺激性反应情况，继续观察14-21d再进行病理组织学检查，以了解刺激性反应的可逆程度。 1.2.4试验意义

根据肉眼观察和病理检查的结果，对受试物使用的安全性进行评价。观察动物注射受试物后所产生的刺激性反应，提示药物临床应用后注射部位可能出现的炎症、组织变性和坏死等不良反应。 1.3化学药物的眼刺激性试验内容 1.3.1试验动物

首选家兔，动物数每组不少于3只。应设置生理盐水对照组，可采用同体左右侧自身对比法。试验前 24h内对每只动物的双眼进行检查（包括使用荧光素钠检查）。有眼睛刺激症状、角膜缺陷和结膜损伤的动物不能用于试验。 1.3.2给药方法

每只眼睛滴入 0.1ml 或涂敷 0.1g 受试物，然后轻合眼睑约 10s。一般不需冲洗眼睛。用药周期应根据药物拟用于临床的情况来决定，多次给药一般不超过4w。

1.3.3眼部观察

单次给药眼刺激试验，在给药后 1、24、48 和 72h对眼部进行检查；多次给药眼刺激试验，每天给药前以及最后一次给药后 1、24、48 和 72 h对眼部进行检查。如果在 72 h未见任何刺激症状，试验则可结束。如存在持久性损伤，

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有必要延长观察期限，但一般不超过 21d。可使用放大镜、裂隙灯、生物显微镜和其他合适的器械进行眼刺激反应检查。在记录了 24h 的观察后，可进一步用荧光素染色检查。每次检查，都应记录眼部反应的分值（见表 3）。除了观察结膜、角膜和虹膜外，其他所观察到的损伤也应记录和报告。 1.3.4结果评价

按表3的要求，将每一个观察时间每一动物的眼角膜、虹膜和结膜的刺激反应分值相加得总积分，将一组的积分总和除以动物数，即得最后分值。按表4判断其刺激程度。该试验系统比人眼睛刺激反应敏感，刺激反应阴性大多可确定为无刺激，阳性反应要排除假阳性。除非受试物有大范围或长时间的使用，否则轻度刺激性可不予重视。 1.3.5试验意义

观察动物经眼给予受试物后所产生的刺激性反应，提示药物临床应用后眼可能出现的炎症、组织变性和坏死等不良反应。

表3眼刺激反应分值标准

眼刺激反应 角膜 无混浊

散在或弥漫性混浊，虹膜清晰可见 半透明区易分辨，虹膜模糊不清

出现灰白色半透明区，虹膜细节不清，瞳孔大小勉强可见 角膜不透明，虹膜无法辨认 虹膜 正常

皱褶明显加深、充血、肿胀，角膜周围轻度充血，瞳孔对光仍有反应 出血/肉眼可见坏死/对光无反应（或其中一种） 结膜

充血（指睑结膜和球结膜） 血管正常 血管充血呈鲜红色

分值

0 1 2 3 4 0 1 2 0 1

5

血管充血呈深红色，血管不易分辨 弥漫性充血呈紫红色 水肿 无水肿

轻微水肿（含眼睑） 明显水肿伴部分眼睑外翻 水肿至眼睑近半闭合 水肿至眼睑超过半闭合 分泌物 无分泌物 少量分泌物

分泌物使眼睑和睫毛潮湿或粘着 分泌物使整个眼区潮湿或粘着 最大总积分

2 3 0 1 2 3 4 1 2 3 4 16

表4眼刺激性评价标准

分值 0-3 4-8 9-12 13-16

1.4刺激性试验的目的及意义

观察动物局部接触受试物后所产生的刺激反应，提示药物临床应用后给药部位可能出现的炎症反应、组织的变性和坏死等不良反应。药物的活性成分及其代谢物、辅料、有关物质及理化性质（如pH值、渗透压等）均有可能引起刺激性的发生，而严重的毒性可以影响用药的安全有效性，因此药物在临床应用前应研究其制剂在给药部位使用后引起的局部和/或全身毒性，以提示临床应用时可能出现的毒性反应、毒性靶器官、安全范围、临床研究监测指标并为临床解毒或解救措施提供参考，保障临床用药的安全有效。

评价 无刺激性 轻度刺激性 中度刺激性 强度刺激性

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2化学药物过敏性

过敏性是指变态反应又称超敏反应，指机体受同一抗原再刺激后产生的一种表现为组织损伤或生理功能紊乱的特异性免疫反应，是异常或病理性免疫反应。其分类采用目前普遍接受的分类法：Ⅰ型又称快发或速发过敏型，由IgE介导，主要表现为荨麻疹、过敏性休克、支气管哮喘、变应性鼻炎、胃肠道与皮肤过敏反应等；Ⅱ型又称细胞毒型或溶细胞型，由IgG介导，主要表现为库姆斯试验阳性的溶血性贫血，粒细胞减少和血小板减少性紫癜；Ⅲ型又称免疫复合物型或血管炎型，由IgG、IgM介导，主要表现为局限性肺炎、血管炎、狼疮样反应、肾小球肾炎等；Ⅳ型又称迟发型或结核菌素型，由T淋巴细胞介导，主要表现为接触性皮炎。

光敏性包括光毒性（光刺激性）和光过敏性（光变态反应）两类，光毒性是由光诱导的非免疫性的皮肤对光的反应，药物可通过直接作用或通过血循环间接作用。光过敏性是获得性的免疫性介导的由光激活的皮肤对光的反应，系光感物质经皮吸收或通过循环到达皮肤后与吸收的光线在表皮细胞层发生的反应，为Ⅳ型变态反应的特殊类型。 2.1化学药物过敏性试验内容 2.1.1被动皮肤过敏试验（PCA）内容

试验的基本原理：将致敏动物的血清（内含丰富的IgE抗体）皮内注射于正常动物。IgE与皮肤肥大细胞的Fc3受体结合，使之被动致敏。当致敏抗原激发时，引起局部肥大细胞释放过敏介质，从而使局部血管的通透性增加，注入染料可渗出于皮丘，形成一个蓝斑。根据蓝斑范围或分光光度计法测定，判定过敏反应程度。 2.1.1.1试验动物

PCA 反应常用的动物是大鼠，亦用小鼠，有时根据试验需要用家兔。因这些动物 PCA 反应是由 IgE 介导的。 2.1.1.2试验分组

应设立阴性、阳性对照组和受试物不同剂量组。阴性对照组应给予同体积的溶媒，阳性对照组给予卵白蛋白或天花粉或已知致敏阳性药物。每组动物数至少

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4只。

2.1.1.3致敏途径及方式

应按临床拟给药途径。隔日致敏一次，共5次。末次致敏后10d左右采血，2000r/min离心10min，分离血清，-20℃保存，2w内备用。 2.1.1.4激发

上述各组抗血清一般用生理盐水稀释成 1：2、1：8、1：32。在动物背部预先脱毛 3×4cm2的皮内注射各对应组的抗血清 0.1mL。经24或48h时后，各组静脉注射与致敏剂量相同的激发抗原加等量的0.5-1%伊文思兰染料共 1mL。 2.1.1.5结果评价

30min后麻醉处死各组动物，剪取背部皮肤，测量皮肤内层的斑点大小，直径大于 5mm 者判定为阳性。 2.1.2全身主动过敏试验（ASA）内容

试验的基本原理:对致敏成立的动物体内，静脉注射抗原，观察抗原与 IgE 抗体结合后导致肥大细胞、嗜碱性细胞脱颗粒、释放活性介质而致的全身性过敏反应。

2.1.2.1试验动物

通常选用体重为 300-400 g的 Hartley 种雄性豚鼠。 2.1.2.2剂量组别

应设阴性对照组，阳性对照组，低剂量组和高剂量组。每组动物至少4只。 2.1.2.3致敏

按临床给药途径。隔日一次，共5次。阴性对照组：给予同体积溶解药物的溶媒。阳性对照组：给予 1-5mg/只牛血清白蛋白或卵白蛋白或已知致敏阳性物质。低剂量组：给予临床最大剂量（/kg或m2）。高剂量组：低剂量的数倍量。 2.1.2.4激发

激发途径：通常静脉内给药。激发次数：末次注射后第 10-14 d一次激发。激发剂量：通常为致敏剂量的 2-5 倍量。

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2.1.2.5观察指标

致敏期间：每日观察每只动物的症状。初次，最后一次致敏和激发当日测定每组每只动物的体重。激发：静脉注射后立刻至30 min，按表5症状详细观察每只动物的反应，症状的出现及消失时间。最长应观察3h。以观察受试物经全身给药后对动物引起的过敏性反应。

表5过敏反应症状

0 正常 3 发抖 6 咳嗽 9 排粪 12 罗音 15 跳跃 18 横转

1 不安宁 4 搔鼻 7 呼吸急促 10 流泪 13 紫癜 16 喘息 19 潮式呼吸

表 6 全身致敏性评价标准

2 立毛 5 喷嚏 8 排尿 11 呼吸困难 14 步态不稳 17 痉挛 20 死亡

0 1-4 症状 1-10 症状 1-19 症状 20

- + ++ +++ ++++

过敏反应阴性 过敏反应弱阳性 过敏反应阳性 过敏反应强阳性 过敏反应极强阳性

2.1.3豚鼠最大化试验（GPMT）和 Buehler 试验（BT）内容

豚鼠最大化试验和 Buehler 试验是指试验动物皮内或涂皮给予诱导剂量，经过 10-14d的诱导期，此时免疫反应发生，然后给予激发剂量，以观察是否出现了过敏反应。在诱导期和攻击期的皮肤反应及其程度均应进行对比，并与伪处理组进行比较。 2.1.3.1试验动物及环境

最好选择年轻成年的豚鼠，选择试验室常用的种系。在试验温度为 20±3℃，相对湿度 30-70％的条件下，如为人工照明，应该 12 h白天与 12 h黑夜交替，给予常规的试验室饮食，不限制饮水，豚鼠应该给予足量的 VitC。动物数量和性别取决于所选择的试验方法，两种性别均可使用。如果使用雌性动物，应选择

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未产和未孕的动物。Buehler 试验试验组不少于20只、对照组不少于10只。GPMT 试验试验组不少于10只、对照组不少于5只，如果试验结果不能提示受试物为致敏剂，则应继续进行试验研究，其中试验组不少于20只、对照组不少于10只。

对照动物则每6个月，应用已知的轻-中度的阳性物质检测方法的灵敏性和可靠性，轻-中度的致敏剂在加佐剂的试验中至少30%和不加佐剂试验中至少15%应有反应。推荐的阳性物质有巯基苯并噻唑，苯佐卡因，二硝基氯苯，331 环氧树脂等，也可以使用其它的阳性对照物。为了确保激发反应源于过敏性而非刺激性，应设立只有溶剂的伪处理组，所选择的溶剂应不干扰或改变试验结果的判断。

2.1.3.2试验剂量

在 Buehler 试验中，致敏剂量应当足够高，以产生轻微的刺激性，激发剂量为不产生刺激性的最高剂量。在 GPMT 试验中，致敏剂量应足够高以产生轻-中度的皮肤刺激性且能很好地全身耐受，激发剂量为不产生刺激性的最高剂量。 2.1.3.3动物观察

皮肤反应应分级并在方法学所确定的激发时间进行判定和记录，一般为24和48h。对于异常的反应，应相应地调整时间。记录开始和结束时的动物体重。

Buehler 试验在第 0，6-8和13-15d用封闭片局部给药以诱导，在第27-28d在未给药的肋腹部贴6h以局部激发。去除封闭片24和48 h后读取结果。如果结果难以判定，一周后再次激发，可采用原来的对照组或新的对照组。

GMPT 试验采用皮内注射给药，使用或者不使用佐剂进行诱导，局部诱导5-8d后，第20-22d给予激发剂量24h，在去除激发剂量24和48h后读取结果。同Buehler试验一样，如果结果难以判定，一周后再次激发，如果初试选择的动物数量只有10只而结果难以判断时，应再增加10只试验动物和5只对照动物。 2.1.3.4试验结果

试验组和对照组均采取盲法读取结果。建议采取用水或适当溶剂去除受试物，不应改变已经存在的皮肤反应和表皮的完整性。该试验系统比人皮肤过敏反应敏感，在豚鼠身上强过敏者在人身上引起过敏反应的可能性很大，而在豚鼠身上弱过敏者有可能或不可能在人身上引起过敏反应。

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2.1.4皮肤光毒性试验内容

光毒性反应是指药物吸收的紫外光能量在皮肤中释放导致皮肤损伤的作用，即皮肤或全身接触或应用化学物质后，继而暴露于紫外线照射下所引起的一种皮肤毒性反应。光毒性反应是光敏中最常见的一种副反应。具有剂量依赖性，其临床表现与晒伤相似，表现为红斑、水肿、皮肤瘙痒和色素沉着。严重者可产生局部坏死、溃烂或表皮脱落。一旦发生，反应十分迅速，一般在光照 24h左右或更短时间发生。 2.1.4.1试验动物

健康 300-500g 白化或无毛豚鼠，至少 14 只，雌雄各半。 2.1.4.2试验分组

将豚鼠按体重性别随机分为二组，即对照组 4 只，试验组 10 只，雌雄各半。对照组在给予受试物和阳性对照药后不接受光照，试验组则在给予受试物和阳性对照药后接受光照。 2.1.4.3给药剂量和方法

阳性对照药可选用 8-甲氧基补骨脂素；根据受试物的溶解性、试验所需浓度、理化特性和动物局部、全身的耐受性等确定给药剂量并说明理由。一般选用二种浓度，其中低浓度为临床用药浓度。将背部去毛区划分为四个部位，每个部位按0.025ml（g）/cm2给药。给药情况如表7。

表7给药情况

组别 对照组

1 2 3 4

试验组

1 2 3 4

部位 给药处理 溶剂或赋形剂 受试物浓度 1 受试物浓度 2 阳性对照 溶剂或赋形剂 受试物浓度 1 受试物浓度 2 阳性对照

光照射 否 否 否 否 是 是 是 是

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给药后，立即将动物放到特制的制动器上以限制动物活动。在光照前应尽量保证受试物及对照物有足够的时间穿透皮肤角质层，以与表皮细胞发生作用，一般在 60min 左右为宜。给药后适当时间（一般0.5-4h），用温水或无刺激性的适宜溶剂除去对照组动物受试部位残留的受试物或赋形剂，将动物放回笼子中。试验组动物受试部位残留的受试物或赋形剂在光照后被清除。 2.1.4.4光照方法

应利用对不同受试物敏感的波长段进行试验。应先进行预试验，对照射剂量、光强度和照射时间及照距等进行确定。试验时将动物放在光照台上固定并遮盖头部后，用适宜的光源（如水冷式氙灯）照射适当长的时间。一般认为波长应在 280-450nm 的范围内，照射时间在 0.5-2h之间，照射强度应适当，并在照射前后分别测定光照强度。 2.1.4.5检查项目

至少在试验开始前及结束时称量体重，于24、48h观察皮肤反应情况并以照片记录及表示。按表8记录各时间皮肤反应分值。

表8皮肤反应程度的评分标准

皮肤反应情况

无红斑 轻度红斑 中度红斑

重度红斑（不伴或伴有水肿） 2.1.4.6结果判断及评价

分值 0 1 2 3

与对照组比较，如果对照组动物的分值均小于1，则试验组动物分值大于等于1即为阳性；如果对照组动物分值为1或更大，则试验组动物分值大于对照组最大者为阳性。进一步可计算阳性率。 2.1.5皮肤光过敏性试验内容

光过敏性系药物吸收光能后成激活状态，并以半抗原形式与皮肤中的蛋白结合成为药物-蛋白质结合物（全抗原），经表皮的郎格罕氏细胞传递给免疫活性细胞，引起过敏反应的作用。光过敏性属 IV 型迟发型过敏反应。其发生时间相对较长，且有一定的潜伏期。通常 5-10 d的连续用药和光照射可诱导免疫系统产

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生光过敏反应。再次给药时，药物和日照作用 24-48h之内即会有光过敏性反应发生。

2.1.5.1试验方法

准备：动物皮肤脱毛，形成约 2×4cm2脱毛区，在脱毛区四角各注射弗氏完全佐剂各0.1ml。

致敏：于脱毛区涂 20%十二烷基硫酸钠溶液，再将受试物涂于该部位，一定时间后拭去表面残留药物。阳性对照药可选用溴化水杨酰苯胺。

照射：应利用对不同受试物敏感的波长段进行试验。应先进行预试验，对照射剂量、光强度和照射时间及照距等进行确定。以选定波长紫外线照射涂药部位，以产生显著红斑为准。隔日重复涂抹十二烷基硫酸钠和给受试物，并照射涂药部位的步骤，共5次。

激发：于末次致敏后2w，在准备的皮肤区再次涂药，浓度宜低于致敏浓度，以免刺激和光毒反应。光照前应尽量保证受试物及对照物有足够的时间穿透皮肤角质层，以与表皮细胞发生作用，一般在60min 左右为宜。光照时以不引起红斑反应的亚红斑量（1/2-2/3 最小红斑量）紫外线照射。 2.1.5.2结果观察

照射后 1-72 h内观察皮肤反应并以照片记录表示。凡与受试物多次接触并在紫外线照射后出现皮肤反应甚至全身反应者，均可认为是该受试物引起的光过敏性。

2.2过敏性试验的目的及意义

观察动物接触受试物后所产生的全身或局部过敏反应。药物的活性成分及其代谢物、辅料、有关物质及理化性质（如 pH值、渗透压等）均有可能引起过敏性的发生，而严重的毒性可以影响用药的安全有效性，因此药物在临床应用前应研究其制剂在给药部位使用后引起的局部和/或全身毒性，以提示临床应用时可能出现的毒性反应、毒性靶器官、安全范围、临床研究监测指标并为临床解毒或解救措施提供参考，保障临床用药的安全有效。 3化学药物的溶血性

溶血性是指药物制剂引起的血管外或血管内溶血和红细胞凝聚等反应。溶血

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性反应包括免疫性溶血与非免疫性溶血。免疫性溶血是药物通过免疫反应产生抗体而引起的溶血，为Ⅱ型和Ⅲ型过敏反应；非免疫性溶血包括药物为诱发因素导致的氧化性溶血和药物制剂引起血液稳态的改变而出现的溶血和红细胞凝聚等。 3.1溶血性试验内容

3.1.1常规的体外试管法（肉眼观察法）

观察受试物对红细胞状态是否产生影响。 3.1.1.1试验方法

血细胞悬液的配制：取兔血（或羊血）数毫升（约 20 ml），放入含玻璃珠的三角烧瓶中振摇 10 分钟，或用玻璃棒搅动血液，除去纤维蛋白原，使成脱纤血液。加入 0.9%氯化钠溶液约 10 倍量，摇匀，1000-1500r/min 离心 15 分钟，除去上清液，沉淀的红细胞再用 0.9%氯化钠溶液按上述方法洗涤 2-3 次，至上清液不显红色为止。将所得红细胞用 0.9%氯化钠溶液配成 2％的混悬液，供试验用。

受试物的制备：除另有规定外，临床用于非血管内途径给药的注射剂，以各药品使用说明书规定的临床使用浓度，用 0.9%氯化钠溶液 1∶3 稀释后作为供试品溶液；用于血管内给药的注射剂以各药品使用说明书规定的临床使用浓度作为供试品溶液。

试验方法：取洁净试管 7 只，进行编号，1-5 号管为供试品管，6 号管为阴性对照管，7 号管为阳性对照管。按下表所示依次加入2%红细胞悬液、0.9%氯化钠溶液或蒸馏水，混匀后，立即置 37℃±0.5℃的恒温箱中进行温育，开始每隔 15min观察 1 次，1 h后，每隔 1h观察 1 次，一般观察 3h。按表 9加入各种溶液。

表9加入溶液的顺序

试管编号

2％红细胞悬液(ml) 生理盐水(ml) 蒸馏水（ml） 受试物（ml）

1 2.5 2.0 0.5

2 2.5 2.1 0.4

3 2.5 2.2 0.3

4 2.5 2.3 0.2

5 2.5 2.4 0.1

6 2.5 2.5

7 2.5 2.5

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3.1.1.2结果观察

若试验中的溶液呈澄明红色，管底无细胞残留或有少量红细胞残留，表明有溶血发生；如红细胞全部下沉，上清液体无色澄明，表明无溶血发生。若溶液中有棕红色或红棕色絮状沉淀，振摇后不分散，表明有红细胞凝聚发生。如有红细胞凝聚的现象，可按下法进一步判定是真凝聚还是假凝聚。若凝聚物在试管振荡后又能均匀分散，或将凝聚物放在载玻片上，在盖玻片边缘滴加 2 滴 0.9%氯化钠溶液，置显微镜下观察，凝聚红细胞能被冲散者为假凝聚，若凝聚物不被摇散或在玻片上不被冲散者为真凝聚。 3.1.1.3结果判断

当阴性对照管无溶血和凝聚发生，阳性对照管有溶血发生时，若受试物管中的溶液在 3 小时内不发生溶血和凝聚，则受试物可以注射使用；若受试物管中的溶液在 3 小时内发生溶血和（或）凝聚，则受试物不宜注射使用。 3.1.2改进的体外溶血性试验法（分光光度法）

观察受试物对红细胞状态是否产生影响。 3.1.2.1试验方法

血细胞悬液的配制：取兔血（或羊血）数毫升（约 20 ml），放入含玻璃珠的三角烧瓶中振摇 10 分钟，或用玻璃棒搅动血液，除去纤维蛋白原，使成脱纤血液。加入 0.9%氯化钠溶液约 10 倍量，摇匀，1000-1500r/min 离心 15 分钟，除去上清液，沉淀的红细胞再用 0.9%氯化钠溶液按上述方法洗涤 2-3 次，至上清液不显红色为止。将所得红细胞用 0.9%氯化钠溶液配成 2％的混悬液，供试验用。

受试物的制备：除另有规定外，临床用于非血管内途径给药的注射剂，以各药品使用说明书规定的临床使用浓度，用 0.9%氯化钠溶液 1∶3 稀释后作为供试品溶液；用于血管内给药的注射剂以各药品使用说明书规定的临床使用浓度作为供试品溶液。

试验方法：取洁净试管7只，进行编号，1-5号管为供试品管，6号管为阴性对照管，7号管为阳性对照管。按下表所示依次加入2%红细胞悬液、0.9%氯化钠溶液或蒸馏水，混匀后，立即置 37℃±0.5℃的恒温箱中进行温育，开始每隔 15min观察 1 次，1h后，每隔 1h观察1次，一般观察 3h。参照表9加入

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各种溶液。 3.1.2.2结果观察

将各管的溶液置入干燥离心管中离心，取上清在分光光度计上，545 nm 处，以蒸馏水为空白读取各管 OD 值。 3.1.2.3结果判断

用下式计算各试验管的溶血率％：

溶血率（％）＝（ODt－ODnc）/(ODpc－ODnc) X 100％

式中：ODt：试验管吸光度；ODnc：阴性对照管吸光度；ODpc：阳性对照管吸光度。

溶血率>5％表明出现了溶血，不宜注射使用。 3.2溶血性试验的目的及意义

考察药物是否能够引起血管外或血管内溶血和红细胞凝聚等反应。药物的活性成分及其代谢物、辅料、有关物质及理化性质（如 pH值、渗透压等）均有可能引起溶血性的发生，而严重的毒性可以影响用药的安全有效性，因此药物在临床应用前应研究其制剂在给药部位使用后引起的局部和/或全身毒性，以提示临床应用时可能出现的毒性反应、毒性靶器官、安全范围、临床研究监测指标并为临床解毒或解救措施提供参考，保障临床用药的安全有效。

溶血反应发生机制复杂，目前尚无标准的临床前体内试验方法以全面评价药物制剂的溶血反应，因此推荐未有相同给药途径上市制剂在长期毒性研究中兼顾考察制剂的溶血性。试验时应注意观察溶血反应的有关指标及体征（如网织红细胞、红细胞数、胆红素、尿蛋白、肾炎和脾脏淤血等），如出现溶血时，应进行进一步研究。对于已有相同给药途径上市注射剂常可采用常规体外试管法评价药物的溶血性，若体外试管法试验结果为阳性，建议与相同给药途径上市制剂进行比较性研究，必要时进行动物体内试验，以确保临床用药的安全。

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