农杆菌介导的大豆子叶节非组织培养遗传转化体系优化_李丹丹

13（5）：789-797植物遗传资源学报2012，

JournalofPlantGeneticResources

农杆菌介导的大豆子叶节非组织

培养遗传转化体系优化

李丹丹，张

洁，刘

娜，陈

琰，韩胜芳，王冬梅

（河北农业大学生命科学学院，保定071001）

摘要：本研究以GUS基因在子叶节区的瞬时表达为依据，通过探讨影响农杆菌转化效率的因素，优化了大豆子叶节非组织培养遗传转化体系；利用该体系对冀豆16号进行Bar基因的遗传转化，并使用针刺法对转基因植株进行草铵膦筛选。结果OD600=0.6、77、表明，侵染液中附加3%蔗糖、以脱脂棉作为菌液附着介质同时不添加表面活性剂SilwetL-侵染1次的GUS阳PCR鉴定共获转化率为2.5%。经PCR和RT-性率最高达到62.13%。草铵膦抗性植株经PCR检测获得T0阳性植株10个，得3株T1阳性植株，初步证明目的基因已整合到大豆基因组中。

关键词：大豆；子叶节；非组织培养；遗传转化；草铵膦筛选

OptimizationoftheAgrobacterium-MediatedGeneticTransformation

SystemofSoybeanCotyledonaryNodeWithNonTissue-Culture

LIDan-dan，ZHANGJie，LIUNa，CHENYan，HANSheng-fang，WANGDong-mei

（CollegeofLifeSciences，AgriculturalUniversityofHebei，Baoding071001）

Abstract：ByinvestigatingthefactorsinfluencingthetransformationefficiencyofAgrobacterium，agenetictransformationsystemofsoybeancotyledonarynodewithnontissue-culturewasoptimizedusingthetransientexpres-sionofGUSintheregionofcotyledonarynode．GeneBarwastransformedintosoybeanJidou16，andthetransgenicplantswerescreenedbyglufosinateinjectedonleaves．Theresultsindicatedthatinfectionmediumcontains3%sug-ar，OD600=0.6，noneSilwetL-77withtheabsorbentcottonasattachedmediaandthehighestpercentageofGUSpositivewas62.13%byonetime．Weobtained10positiveplantsinT0generationafterdetectedthetransgenicplantsresistanttoglufosinatebyPCR．Thetransformationefficiencywas2.5%．ThreepositiveplantsofT1genera-tionwereobtainedbyPCRandRT-PCR，whichdemonstratedthatthetargetgenewasintegratedintothesoybeangenome．

Keywords：Soybean；Cotyledonarynode；Nontissue-culture；Genetictransformation；Glufosinatescreening大豆是全球重要的经济作物，是食用油和蛋白［1-2］

。利用分子育种的方法可以提的主要作物来源

高大豆的产量及品质。目前，在大豆的遗传转化中

［3］［4］

常用的方法主要有农杆菌介导法和基因枪法，

［5］

而农杆菌介导法中又以子叶节法最为常用。子

外植体获得不受季节叶节转化体系具有操作简便、

叶节遗传转化体系仍存在着组织培养过程中茎伸长

因此尝试建立一个非组织培养的和生根难的问题，

子叶节遗传转化体系是解决上述问题的有效途径。王全伟等

以大豆幼苗的顶端生长点和叶腋生长

——注射点为靶点，通过农杆菌介导的整体转化法—

［7］

限制、操作周期较短等特点

10-10收稿日期：2011-

［6］

。但农杆菌介导的子

最终获法进行转录因子DREBIC基因的遗传转化，

得1株阳性植株。该方法克服了大豆组织培养再生

12-09修回日期：2011-

1）；转基因生物新品种培育重大专项子课题（2008ZX08004-002-1-5；2009ZX08004-001B；基金项目：河北省科技攻关计划项目（042401116D-2011ZX08004-002-002）

mail：lidandan.123．xue@163．com作者简介：李丹丹，硕士研究生，研究方向为植物抗逆生理及遗传转化。E-张洁，博士研究生，副教授，并列为第一作者。

mail：dongmeiwang63@126．com通讯作者：王冬梅，博士，教授，博士生导师，主要从事植物逆境分子细胞生物学领域的研究工作。E-

790

植物遗传资源学报13卷

难、转化率低的缺点，是一种高频、简单、快捷的非组织培养遗传转化途径。这种非组织培养的遗传转化、拟南芥白方法在其他作物的转化中如苜蓿、

［11-12］［13］［14］［15］

、萝卜、棉花、小麦等也得到了广泛菜

应用。程云清等

发明了一种以大豆子叶节为受

体不依赖组织培养的大豆遗传转化新方法，该方法是依据农杆菌介导的子叶节法建立起来的。本试验以河北省推广的优良大豆品种为材料，试图通过对来优化农杆菌影响转化效率的多种因素进行研究，

介导的大豆子叶节非组织培养遗传转化体系，为大豆分子育种研究打下良好的基础。

随着转基因生物安全越来越多的被人们关注，

［17］

除草剂草铵膦已成为大豆转化中常用的筛选剂，但在实际应用过程中一直存在着草铵膦筛选假阳性率高的问题。本试验通过比较叶片针刺法和涂抹法两种方法的筛选效率，以确立大豆子叶节非组织培

为今后大豆转化养遗传转化体系的有效筛选方法，植株的筛选奠定基础。

［16］

［8］

［9-10］

1.2.3

农杆菌介导的大豆子叶节转化生长在沙

A），土中的大豆苗萌发5d后（图1，用手术刀片切去

1片子叶，留取另1片子叶连同下胚轴，小心去除腋

B中箭头所并沿下胚轴方向轻划5～6刀（图1，芽，

示）。用镊子夹取适量脱脂棉放入配制好的农杆菌

菌液中润湿至饱和，将脱脂棉放置于伤口处进行侵染，然后将侵染的大豆苗用黑色塑料袋套好保湿（图1，C），25℃黑暗条件下共培养3d。1.2.4

农杆菌介导的大豆子叶节非组织培养转化

体系优化研究多种因素对转化效率的影响试验在1.2.2和1.2.3的基础上对影响转化效率的多种因素进行研究，分别设置以下5个试验，所有试验均进行3次重复，每次重复每个处理外植体数≥30。77：以冀豆16蔗糖浓度和表面活性剂SilwetL-号为材料，侵染液分为不添加和添加0.01%～77两种，0.03%的SilwetL-同时二者分别又设置3%、5%和10%3个不同浓度的蔗糖处理，用此侵染液进行子叶节的转化，重复侵染3次，每天1次。

侵染方式：以冀豆16号为材料，设计3种侵染方式，见表1，重复侵染3次，每天1次。侵染次数：以冀豆16号为材料，侵染时分别设1、2和3次重复处理。

侵染液浓度OD600：以冀豆16号为材料，共设计4个侵染液浓度即OD600=0.2、0.4、0.6和0.8，分别用这4个浓度的侵染液进行侵染。

大豆基因型：以冀豆7号、冀豆16号和五星1号为材料。

表1

不同侵染方式的侵染液组成及操作方法

Compositionofinfectionmediumandoperationmethodfordifferentwaysofinfection

侵染方式WaysofinfectionABC

侵染液组成及操作方法Compositionofinfectionmediumand

operationmethod

77，侵染液附加3%蔗糖，不添加SilwetL-以脱脂棉作为菌液附着介质

77，侵染液附加3%蔗糖，同时添加SilwetL-滴加菌液至伤口处

77，侵染液附加3%蔗糖，同时添加SilwetL-滴加此菌液至伤口处，待菌液完全渗入再以脱脂棉作为菌液附着介质，使只附加3%蔗糖不添加Sil-wetL-77的菌液附着于伤口

1

1.1

材料与方法

试验材料植物材料

1.1.1

供试大豆［Glycinemax（L．）

Merr．］为河北省优良大豆品种：高蛋白品种冀豆7号和冀豆16号，脂肪氧化酶缺失品种五星1号。上述3个大豆品种的土培萌发率较高，可以提供较多的可用外植体，由河北省农林科学院粮油作物研究所提供。

1.1.2

农杆菌菌株和质粒农杆菌菌株为EHA105，质粒为pCAMBIA3301，该质粒带有GUS报

告基因和抗除草剂草铵膦Bar基因。1.2试验方法1.2.1

大豆种子的萌发选取成熟饱满、无病斑的播种于塑料花盆中，温室（光照强度大豆种子，

Table1

10000lx，14h光照/10h黑暗）25℃萌发5d后，待子

叶变绿并稍稍展开时用于子叶节的转化。1.2.2

农杆菌菌液的制备从含有50mg/L利福

平和50mg/L卡那霉素的YEB平板上挑取已转入质

粒pCAMBIA3301的农杆菌EHA105单菌落，接种于50ml含有50mg/L利福平和50mg/L卡那霉素的YEB液体培养基中，28℃，180r/min震荡培养过夜。将培养好的菌液（OD600=0.6）3000r/min离心10min收集菌体，1/2MS；3%蔗弃上清，用侵染液［糖；1.67mg/LBA；200μmol/L乙酰丁香酮（As）；8.8mmol/L半胱氨酸（L-Cys）；1.0mmol/L二硫苏糖醇（DTT）；pH5.4］重悬菌体至OD600=0.6。

GUS基因在子叶节区瞬时表达的检测GUS

瞬时表达分析可以作为外源基因进入受体细胞的指

［18］示，因此以共培养3d后GUS在子叶节区的瞬时

5期李丹丹等：农杆菌介导的大豆子叶节非组织培养遗传转化体系优化791

+

表达为依据，通过计算GUS阳性（GUS）率来研究不同因素对农杆菌转化效率的影响。共培养结束

化率=（Bar阳性中GUSPCR阳性数/转化植株

。数）×100%］1.2.7

T1转基因植株的RT-PCR检测对

T1PCR检测呈阳性的转基因植株进行RT-PCR检

测。利用TaKaRa公司的RNAisoPlus试剂提取大

切取带有一部分子叶和一部分下胚轴的子叶节区后，

以非转基因的外植体作外植体进行GUS染色检测，

为阴性对照。先将切取的外植体用蒸馏水清洗3遍

以去除农杆菌，用滤纸吸干水分后将外植体浸泡在X-gluc染液［50mmol/LPBSpH7.0（50mmol/LNaH2PO4；50mmol/LNa2HPO4），10mmol/LNa2EDTA，0.1%（v/v）TritonX-100，0.5mmol/L铁氰化钾，0.5mmol/L亚铁氰化钾，20%（v/v）甲醇，1g/LX-gluc］中，于37℃染色24h，去除染色液，依次用70%、80%、90%和100%的乙醇梯度脱色，实体显微镜（O-LYMPUSSZX16）下观察并拍照。记录GUS在子叶节

GUS阳性区表达的外植体数并计算GUS阳性率［

率=（GUS在子叶节区表达的阳性外植体数/染色总

。外植体数）×100%］1.2.5

转化芽的诱导和植株再生共培养结束后D），用浓度为3.34mg/L的BA将塑料袋揭去（图1，

豆叶片总RNA，然后以TaKaRa公司的反转录试剂

盒进行反转录得到双链cDNA，以cDNA为模板进PCR检测。分别用Bar1、Bar2和GUS1、行RT-GUS2（GUS1：5'-CGACGGCCTGTGGGCATTCA-3'；GUS2：5'-TGGTCGTGCACCATCAGCAC-3'）引物进行PCR，反应体系及反应条件同1.2.6。GUS1、GUS2引物退火温度为65.2℃，72℃延伸1min15s，扩增产物长度为900bp。1.2.8

叶片针刺法和涂抹法草铵膦适宜筛选浓度的摸索以非转基因大豆为试验材料，进行两种方法适宜筛选浓度的摸索。共设计6个草铵膦50、100、150、200、250mg/L。待分别为0、浓度，

大豆植株第2片3出复叶完全展开且第3片3出此时叶片较嫩，分别用以上6复叶还未展开时，

7d后观察叶片及植株的个浓度进行针刺和涂抹，

生长情况。每个浓度处理12株植株，每个处理

重复3次。

针刺法：用1.0ml的微量注射器吸取一定量配

缓慢推动注射器柄当针头处水制好的草铵膦溶液，

滴将要自然滴下时（约0.02ml），在叶片偏上部主叶

脉两侧分别进行针刺，使水滴覆盖在针刺后叶片留下的小孔上方。7d后观察叶片及整个枝条的变化。

涂抹法：用棉签蘸取配制好的草铵膦溶液，在叶片的中心区域进行均匀涂抹。7d后观察叶片及整个枝条的变化。1.2.9

叶片针刺法和涂抹法对转基因再生植株进

行草铵膦筛选转化再生芽生长约两周后，在每个

水溶液浸润脱脂棉后置于子叶节部位，再套白色透

E），置于光照下25℃诱导培明塑料袋保湿（图1，

养。诱导7～9d后待子叶节部位长出丛生芽（图1，

F中箭头所示），揭去白色塑料袋和脱脂棉进行正常培养。10d后丛生芽即可伸长并长成枝条（图1，G），3～4个月即可获得转基因后代（图1，H）。1.2.6

T0/T1转基因植株的PCR检测

采用

CTAB法提取大豆叶片基因组DNA［19］，用GUS基因引物和Bar基因引物进行PCR鉴定。引物序列分

CATCGCAGCGTAATGCTCTA-3'；别为GUSF1：5'-GUSR1：5'-AACGTATCCACGCCGTATTC-3'，Bar1：5'-ACGCTCTTGAAGCCCTGT-3'；

Bar2：

5'-GCAC-CATCGTCAACCACT-3'。PCR反应体系为20μl，其dNTP1μl，中10×TaqReactionBuffer2μl，引物各

0.5μl，TaqDNAPolymerase0.3μl，大豆基因组DNA1μl，去离子水14.7μl。PCR反应条件：94℃预变性8min；94℃变性1min，复性45s（GUS引物Bar引物退火温度为62.2℃），退火温度为63℃、

72℃延伸（GUS引物为1min15s、Bar引物为50s），35个循环；72℃延伸10min。GUS引物的扩增产

Bar引物的扩增产物长度为物长度为1019bp、

300bp。PCR产物采用1.5%的琼脂糖凝胶电泳进PCR阳行检测。最后对T0转基因植株的再生率、

性率和转化率进行计算［再生率=（再生植株数/转化植株数）×100%；PCR阳性率=（Bar阳性中GUSPCR阳性数/草铵膦抗性植株数）×100%；转

枝条上任意选取1片3出复叶进行草铵膦的针刺和涂抹。7d后观察叶片及枝条的生长情况，保留抗性枝条并去除阴性枝条。对草铵膦抗性植株取样进行Bar基因的PCR检测，计算筛选效率［筛选效率=（Bar基因PCR阳性植株数/草铵膦抗性植株

。数）×100%］

2

2.1

结果与分析

农杆菌介导的大豆子叶节非组织培养遗传转化体系的优化

2.1.1

77对转化蔗糖浓度和表面活性剂SilwetL-效率的影响GUS阳性率统计结果见表2和表3，

792

植物遗传资源学报13卷

子叶节区的GUS染色结果见图2，其中在子叶节区出现蓝色的为阳性外植体，表明GUS基因在子叶节A、B、C和D）。图2E为非区进行了瞬时表达（图2，转基因的阴性对照。

77由表2可以看出，侵染液中不添加SilwetL-

且蔗糖浓度为3%时GUS阳性率达到44.05%，显

著高于其他处理。对丛生芽得率的统计结果与GUS染色的统计结果一致（表3），即侵染液中不添

77、同时附加3%的蔗糖时其丛生芽得率加SilwetL-最高，达到了60.40%

。

图1农杆菌介导的大豆子叶节非组织培养遗传转化体系的操作及获得的转基因植株Fig.1

OperationandthetransgenicplantsoftheAgrobacterium-mediated

genetictransformationsystemofsoybeancotyledonarynodewithnontissue-culture

A：大豆种子土培萌发5d；B：切取子叶节外植体，圆圈和箭头分别表示子叶节区和刀痕；C：套黑塑料袋共培养3d；D：共培养结束后外植体状态；E：套白塑料袋保湿进行芽诱导；F：诱导10d后丛生芽的状态，箭头表示丛生芽；

G：丛生芽生长10d后的状态；H：转化后3～4个月获得的转基因T0植株

A：Soybeanseedsgerminatedinsandysoilfor5days；B：Cotyledonarynodeexplant．Thecircleandarrowindicatetheregionofacotyledonarynodeandthewoundbyascalpel，respectively；C：Co-cultivationfor3daysbycoveringtheblackplasticbag；

D：Explantsafterco-cultivation；E：Multipleshootsinducedwithcoveringthewhiteplasticbagtokeepmoisture；

F：Multipleshootsinducedfor10days；G：Multipleshootselongatedfor10days；

H：T0transgenicplantsaftertransformationfor3-4

months

图2

Fig.2

GUS基因在子叶节区的瞬时表达

TransientexpressionofGUSgeneintheregionofcotyledonarynode

A-D：GUS染色阳性外植体；E：阴性对照（16×）A-D：GUSstainingpositiveexplants；E：negativecontrol（16×）

5期表2

李丹丹等：农杆菌介导的大豆子叶节非组织培养遗传转化体系优化793

77对GUS阳性不同蔗糖浓度和表面活性剂SilwetL-率的影响

EffectofdifferentconcentrationsofsugarandsurfactantSilwetL-77onthepercentageofGUSpositive

蔗糖浓度（%）Concentrationsofsugar3510

外植体总数Totalofexplants1099792102102103

GUS阳性率（%）PercentageofGUSpositive44.05±1.66a28.74±2.44b11.94±1.73c10.74±0.93c11.67±1.44c9.66±0.76c

性率降低的情况。不同侵染方式试验表明（表3），

使用A组侵染液及操作方式时获得最高的丛生芽GUS阳性率为43.53%；使用B组得率达61.66%，

侵染液及操作方式时获得最高的GUS阳性率为61.94%，但其丛生芽得率较低仅为26.77%；使用C组侵染液及操作方式时GUS阳性率和丛生芽得率均为最低。以上结果表明选择A组侵染液及操作方式既能保证一定的GUS阳性率，也能获得较高的丛生芽得率。2.1.3

重复侵染次数对转化效率的影响侵染方

式A的GUS阳性率较低只有43.53%，可能是由于重复侵染3次对伤口处细胞的伤害太大造成的。因

Table2

处理Treatment不添加SilwetL-77

添加SilwetL-77

3510

表中数据均来自3次重复试验，小写字母代表5%的差异显著水平，多重比较采用LSD法。下同

Thedatainthetableweredevivedfromthreerepeatedexperiments．Smalllettermeanssignificantdifferenceat5%levelbyLSD．Thesameasbelow

2和3次不此为了确定最适侵染次数，分别进行1、

同次数的侵染，试验表明，在只进行1次侵染的条件下分别获得了最高的GUS阳性率（62.13%）和丛生芽得率（73.14%），均显著高于2次和3次侵染时的GUS阳性率和丛生芽得率（表3）。

2.1.4不同侵染液浓度对转化效率的影响

表3

表3不同因素对丛生芽得率和GUS阳性率的影响

EffectofdifferentfactorsontheregenerationrateofmultipleshootsandthepercentageofGUSpos-itive

Table3

显示，当侵染液浓度为OD600=0.6时，获得最高的GUS阳性率61.00%且显著高于其他处理。同时GUS染色结果表明，GUS随着侵染液浓度的增加，在子叶节区的着色面积逐渐增大。当OD600=0.8

GUS染色面积最大，时，但其GUS阳性率却低于OD600=0.6时的比率。所以，最终确定侵染液浓度为OD600=0.6时适于本转化体系。2.1.5

不同大豆基因型对转化效率的影响利用

上述已优化了的转化体系对3种基因型大豆进行转

因素Factors蔗糖浓度（%）Concentrationsofsugar侵染方式Waysofinfection侵染次数Timesofinfection侵染液浓度（OD600）Concentrationsofinfectionmedium大豆基因型Soybeangenotypes

处理Treatments

3510ABC1230.20.40.60.8J-16J-7WX-1

丛生芽得率（%）Regenerationrateofmultipleshoots60.40±2.83a50.45±1.75b46.82±1.06b61.66±3.96a26.77±3.49b15.21±1.71c73.14±2.30a67.36±1.20b61.31±1.34c

———————

GUS阳性率（%）PercentageofGUS

positive———43.53±1.76b61.94±1.73a18.26±1.41c62.13±2.59a53.01±1.34b43.24±3.10c27.58±1.58d40.82±2.62c61.00±2.30a54.85±1.69b61.79±1.56a18.67±1.77b13.37±1.17c

化。从表3中可以看出，冀豆16号的GUS阳性率为61.79%，显著高于冀豆7号和五星1号。不同基因型之间GUS阳性率的差异如此之大，也许与不同基因型所要求的转化条件不同有关，但根本原因可能还是由于冀豆16号为易感大豆基因型所致。2.2冀豆16号T0转基因植株的PCR检测采用已优化了的子叶节非组织培养转化体系对冀豆16号进行遗传转化，获得的再生植株经过除草剂草铵膦筛选后，提取抗性T0转基因大豆叶片的基因组DNA，用GUS引物和Bar引物分别进行PCR扩增。以pCAMBIA3301质粒作为阳性对照，非转

PCR结果显示，化大豆植株作为阴性对照，分别扩A）和Bar（图3，B）基因相应的增得到了GUS（图3，

大小分别为1019bp和300bp，同一植株上均条带，

扩增出两条条带的为阳性植株。在所有筛选得到的除草剂抗性植株中，两对引物的PCR扩增结果均呈T0PCR阳性率为8.3%。阳性的共有10株，

2.1.2

不同侵染方式对转化效率的影响表面活

性剂有较强的渗透能力，在侵染液中添加SilwetL-

77等物质往往可以代替抽真空操作［20］。但是用脱

77的渗脂棉作为菌液附着介质可能会降低SilwetL-透能力，且这种操作方式因菌液与伤口的作用时间

较长而对伤口处的细胞伤害较大，最终出现GUS阳

794

植物遗传资源学报13

卷

图3

Fig.3

冀豆16号T0转基因植株的PCR检测

DetectionofT0transgenicplantsofJidou16byPCR

M：200bpDNAladder；P：pCAMBIA3301质粒（阳性对照）；CK：非转基因植株（阴性对照）

A：用GUS引物对GUS基因片段进行PCR扩增。2、4、6-9为GUS阳性转基因植株，1、3和5为GUS阴性转基因植株B：用Bar引物对Bar基因片段进行PCR扩增。1、3-10为Bar阳性转基因植株，2和11为Bar阴性转基因植株M：200bpDNAladder；P：pCAMBIA3301plasmid（positivecontrol）；CK：non-transformedplant（negativecontrol）

A：GUSgenesegmentamplifiedusingGUSprimer.2，4，6-9：GUS-positivetransgenicplants；1，3，5：GUS-negativetransgenicplants3-10：Bar-positivetransgenicplants；2，11：Bar-negativetransgenicplantsB：BargenesegmentamplifiedusingBarprimer.1，

2.3

PCR冀豆16号T1转基因植株的PCR及RT-检测性植株。3株PCR阳性植株经草铵膦筛选后均表现

抗性，表明目的基因已在大豆基因组中得到稳定

收获上述10株T0PCR阳性植株的种子27粒，遗传。

播种后即T1转基因植株。提取其叶片基因组DNA提取上述3株T1转基因植株的总RNA，进行转

PCR结果如图4，3株转基后同样用GUS引物和Bar引物分别对GUS基因片段录水平的分子检测。RT-和Bar基因片段进行PCR扩增。结果显示，只有3

株用两对引物均能扩增得到对应的GUS和Bar基因片段，为阳性植株；其他植株均没有扩增出条带，为阴

因植株中都分别扩增得到了Bar基因片段（300bp）

和GUS基因片段（900bp），表明目的基因已在转录水平进行了表达

。

图4

Fig.4

PCR检测冀豆16号T1转基因植株的RT-

DetectionofT1transgenicplantsofJidou16byRT-PCR

M：200bpDNAladder；P：pCAMBIA3301质粒（阳性对照）；CK：非转基因植株（阴性对照）；

1-3：T1阳性转基因植株（左：Bar引物扩增；右：GUS引物扩增）

M：200bpDNAladder；P：pCAMBIA3301plasmid（positivecontrol）；CK：non-transformedplant（negativecontrol）；

1-3：T1positivetransgenicplants．Left：amplifiedwithBarprimer；Right：amplifiedwithGUSprimer

5期李丹丹等：农杆菌介导的大豆子叶节非组织培养遗传转化体系优化795

2.42.4.1

转基因植株对草铵膦的抗性检测

叶片针刺法和涂抹法草铵膦适宜筛选浓度使用两种方法对非转基因大豆进行草铵膦

B），最后直至整个叶片死亡脱落，严重时出现植株

C）。使用针刺法草铵膦茎尖枯焦死亡的现象（图5，

涂抹法草铵膦浓度为200mg/L浓度为150mg/L、

时，均出现叶片全部枯焦脱落、植株茎尖枯焦死亡的现象，从而确定150mg/L和200mg/L分别为针刺法和涂抹法的最适筛选初浓度

。

的确定

处理时都出现随着天数增加施用草铵膦的叶片逐渐

但7d后随着草铵膦浓度的增褪绿甚至枯焦的现象，

A和加，叶片的枯焦面积和程度也越来越大（图5，

图5

Fig.5

叶片针刺和涂抹草铵膦筛选的适宜浓度试验

Testoftheappropriateconcentrationsofglufosinatetoscreenplantswithglufosinateinjectedandpaintedonleaves

A：不同浓度草铵膦针刺法筛选7d后的叶片情况；B：不同浓度草铵膦涂抹法筛选7d后的叶片情况；

C：针刺法和涂抹法筛选7d后植株茎尖死亡的情况

A：Leafsympromsfor7dafterinjectingdifferentconcentrationofglufosinate；B：Leafsympromsfor7dafterpaintingdifferent

concentrationofglufosinate；C：Deathofstemtipafter7dinjectingandpaintingglufosinate

2.4.2叶片针刺法和涂抹法筛选效率的比较分

别用这两种方法在最适筛选浓度下对转化再生植株

进行筛选（图6）。针刺法获得Bar基因PCR植株

筛选效率为27.2%；涂抹法获得Bar基因为49株，

PCR植株为12株，筛选效率仅为9.1%，从而确定针刺法是适合此转化体系的有效筛选方法

。

图6

Fig.6

针刺法和涂抹法对转化再生植株的筛选

Thetransformedregeneratedplantsscreenedbyglufosinateinjectedandpaintedonleaves

A：针刺法筛选转化再生植株阴性叶片；B：针刺法筛选转化再生植株阳性叶片；C：涂抹法筛选转化再生植株阴性叶片；

D：涂抹法筛选转化再生植株阳性叶片；E：针刺法和涂抹法筛选转化再生植株茎尖对比（左：阳性；右：阴性）A：Leafsympromofnegativetransformedplantsscreenedbyinjectingglufosinate；B：Leafsympromofpossitivetransformedplantsscreenedbyinjectingglufosinate；C：Leafsympromofnegativetransformedplantsscreenedbypaintingglufosinate；

D：Leafsympromofpossitivetransformedplantsscreenedbypaintingglufosinate；E：Comparisonofthestemtipof

transformedplantsafterinjectingandpaintingglufosinationonleaves（left：positive；right：negative）

796

植物遗传资源学报

［29］

13卷

3讨论

［20，30］［27，31］

，这已在拟南芥和油菜的

转化中得以证明。而本研究结果表明1次侵染比多

转化的几率

在大豆的遗传转化中，农杆菌介导的子叶节转

［21-23］

，但该方法在芽伸长和化是最常用的一种方法

生根方面存在着效率低和费时的难题。程云清等

发明了一种以大豆子叶节为受体不依赖组织

培养的大豆遗传转化新方法，该方法有效地解决了芽伸长和生根难的问题。本研究以传统子叶节原理为基础，探讨了蔗糖、表面活性剂、侵染方式、侵染次侵染液浓度及大豆基因型对转化效率的影响，优数、

化了农杆菌介导的大豆子叶节非组织培养遗传转化体系，并利用该体系对河北省优良大豆品种冀豆16号进行了Bar基因的遗传转化，植株再生率达71.2%，转化率为2.5%。

77是一种有机硅化合物，表面活性剂SilwetL-能够减少表面张力使菌体更容易进入植物的伤［24］［20］［25-26］［13］

、小麦萝卜和油口。在拟南芥、

77能的遗传转化研究中发现，使用SilwetL-［24］

首次证够提高农杆菌介导的转化效率。Liu等菜

77能够促进农杆菌明在共培养基中添加SilwetL-介导的大豆子叶节转化。而本研究的结果恰恰相77提高了转化效反，但B侵染方式使用SilwetL-率却与其相吻合。这可能是由于在结果2.1.1SilwetL-77的渗透作用被脱脂棉减弱，中，菌液更

多地被吸附在脱脂棉中而不能进入植株的伤口，使转化率降低；而在结果2.1.2中B侵染方式有

77发挥渗透作用，使转化率提高。利于SilwetL-77存在一定的毒性，另一方面由于SilwetL-其接

触的伤口处细胞因伤害太大而导致死亡，所以在结果2.1.1和2.1.2中出现了因添加SilwetL－77使转化效率和丛生芽得率降低的现象。

高渗培养基可以减少伤口处的细胞伤流液，使细胞内或液泡变小并发生一定程度的质壁分离，使农杆

［28］菌易于接触伤口周围的细胞，从而提高转化效率。本研究探讨了不同蔗糖浓度对转化效率的影响，结果［27］［16］

次侵染更利于农杆菌的转化，这可能是由于侵染次

数过多会使菌体存留太多、侵染时间太长，对细胞的伤害加重而导致死亡，从而使GUS阳性率和丛生芽得率都降低。

DNA的转移有极强的效侵染液浓度对T-［32］

应。本研究结果表明侵染液浓度为OD600=0.6时GUS阳性率最高，有利于农杆菌的转化。但随着

GUS在子叶节区的着色面积是侵染液浓度的增加，

逐渐增大的。这可能是由于侵染液浓度越大，农杆

DNA转其侵染子叶节区时有效的T-菌的密度越大，

移则越多，所以GUS在子叶节区的着色面积越大；

但是侵染液浓度过大，则导致子叶节区细胞的死亡，GUS所以能进行GUS瞬时表达的外植体数量减少，阳性率降低。

为了解决草铵膦筛选假阳性率高的问题，本研究首次使用针刺法对转化植株进行草铵膦筛选，并与叶片涂抹法进行筛选效率的比较，发现针刺法明显优于涂抹法。使用针刺法筛选时能够对草铵膦进行定量实施，而涂抹法在涂抹时不容易掌握草铵膦的量，涂抹面积和涂抹量不能准确把握；另一方面由于草铵膦是内吸式除草剂，它的有效成分经叶脉渗

［33］

入参与代谢，针刺法筛选时草铵膦更容易进入叶而涂抹法筛选时草铵膦进入叶脉易受气孔脉传输，

开度即蒸腾作用的影响。因此针刺法比涂抹法更准确，筛选效率更高。但是这种方法与涂抹法一样，受

［34］

叶龄的影响较大，使用该方法筛选时要掌握叶片叶龄的选择。

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表明3%的蔗糖浓度最适合此体系进行农杆菌转化。这一结果与一般的大豆子叶节转化法使用的蔗糖浓

［21-23］

。高浓度的蔗糖不利于转化可能是由于度一致

蔗糖浓度过高，渗透压过大会导致伤口处细胞脱水，

发生严重的质壁分离而导致细胞死亡，从而降低转化同时也不利于丛生芽的再生。效率，

农杆菌的转化是一个反复发生的过程，存活在植株体内的农杆菌的转化活力会随时间的推移而下降，反复浸染可以增加具转化活性的农杆菌数目及

［6］［7］［4］

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5期

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