CRISPR - Cas9基因组编辑 - 省略 - 物基因功能研究及植物改良中的应用 - 曾秀英

植物生理学报 Plant Physiology Journal 2015, 51 (9): 1351~1358　　doi: 10.13592/j.cnki.ppj.2015.01761351

综　述 ReviewsCRISPR/Cas9基因组编辑技术在植物基因功能研究及植物改良中的应用

曾秀英1, 侯学文1,2,*

华南农业大学生命科学学院1植物逆境生物学研究中心; 2广东省植物功能基因组与生物技术重点实验室, 广州510642摘要: CRISPR/Cas是发现于细菌和古细菌基因组中的特殊结构, 参与细菌和古细菌破坏噬菌体和外源质粒的免疫保护。科学家将II型CRISPR/Cas改造成为一个组装简便、高效和精准的基因组编辑工具, 并迅速在动物、植物和微生物基因功能研究和遗传改造中获得广泛应用。本文介绍CRISPR/Cas9技术出现近两年来, 在水稻、小麦、高粱、拟南芥、烟草、甜橙等植物中的研究情况, 在此基础上对该技术的优点和需要进一步改进的地方提出了看法。

关键词: 成簇的、规律间隔的短回文重复序列; 成簇的、规律间隔的短回文重复序列相关核酸酶9; 基因组编辑技术; 植物基因功能; 植物改良

Application of CRISPR/Cas9 Genome Editing Technology in Functional Ge-nomics and Improvement of Plants

ZENG Xiu-Ying1, HOU Xue-Wen1,2,*1

Research Center of Plant Stress Biology, 2Key Laboratory of Plant Functional Genomics and Biotechnology, Education Depart-ment of Guangdong Province, College of Life Sciences, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China

Abstract: CRISPR/Cas is a speci? c gene structure found in the genome of bacteria and archaea, and is the im-mune system of bacteria and archaea involved in destroying phage and exogenous plasmids. CRISPR/Cas9, a convenient, precise and ef? cient genome editing technology, was developed according to the mechanism of type II CRISPR/Cas recently. From then on this technology has been broadly utilized to study gene functions and genetic modi? cation of animal, plant and microorganism. The recent developments of CRISPR/Cas9 ge-nome editing technology in rice, wheat, sorghum, Arabidopsis, tobacco and sweet orange, etc, were analyzed in detail in this paper. The advantages and further improvement aspects of this technology were also discussed at the end of this paper.

Key words: CRISPR; CAS9; genome editing technology; plant gene function; plant improvement

自从1956年Crick提出中心法则以来, 基因组DNA是遗传信息携带者的观念就已经确立。此后人们也开发了许多调控基因表达的技术, 如超表达技术(Prelich 2012) 、T-DNA插入(Krysan等1999)、转座子技术(Zhang等2005)、反义技术(Bourque 1995)、RNAi技术(Kusaba 2004)和miRNA技术(Gupta 2015)等等, 虽然这些技术都能调控相关基因的表达, 但它们均不能对目标基因进行准确的直接修饰, 因而还不能称为基因组编辑技术。开发出精准、简便和高效的基因组编辑技术一直是分子生物学家的梦想。经过多年的努力, 目前已经拥有锌指核酸酶(zinc finger nucleases, ZFNs) (Urnov等2010)、转录因子样效应物核酸酶(tran-scription activator-like effector nucleases, TALENs)

(Bedell等2012)和成簇的、规律间隔的短回文重复序列相关核酸酶9系统(clustered regularly inter-spaced short palindromic repeats/CRISPR-associated 9, CAS9) (Mali等2013)这3类基因组编辑技术。ZFNs出现于上世纪90年代, TALENs出现于2011年, CAS9出现于2013年初, 它们均能对植物、动物和微生物进行基因组编辑, 这3类技术共同的特点是均由DNA序列识别元件和非特异核酸酶两部分构成, 不同点是它们实现DNA序列识别的方式(Gaj等2013) 。ZFNs和TALENs技术的原理和应用已经有

收稿 2015-03-27　　修定 2015-08-19资助 国家自然科学基金(30971709)。

* 通讯作者(E-mail: hxw1969@scau.edu.cn; Tel: 020-85287961)。

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很多文章介绍(de Pater等2009; Wood等2011; Li等2012; 李奇和安海龙2013)。CRISPR/CAS9的技术原理、发现历程等也在多篇文章中有详细介绍(Horvath和Barrangou 2010; Jinek等2012), 本文将对近期CRISPR/Cas9在植物基因功能研究及改良中的应用进行梳理, 探讨其优缺点并展望其应用前景, 以便促进该技术在植物研究领域中的应用。1 CRISPR/Cas9系统在单子叶植物中的应用1.1 水稻

水稻不仅是单子叶模式植物, 同时也是具有全球意义的重要粮食作物, 因此对水稻的研究具有明显的双重意义。Shan等(2013)报道用针对相应靶基因的sgRNA和含核定位信号且用水稻偏好密码子优化的CAS9共同转化水稻原生质体, 结果表明针对OsPDS的突变率在14.5%至20%之间, 针对OsBAHD2、Os02g23823和OsMPK2的插入/缺失比例在26.5%至38%之间; 他们用CAS9、sgRNA和靶位点同源的单链DNA共同侵染水稻原生质体, 在29个克隆中找到了2个同源修复(homology di-rected repair, HDR)。随后他们用基因枪法转化水稻胚性愈伤组织, 针对OsPDS-SP1打靶, 在获得的96条独立的转基因水稻株系中, 发现了9条突变株系(9.4%), 其中3株双等位基因突变的株系具有矮化和白化的特征表型; 针对OsBAHD2打靶, 在98条独立的转基因水稻株系中, 发现了7条突变株系(7.1%)。为了进一步提高转化效率, Feng等(2013)将由OsU6-2启动子驱动的sgRNA和35S启动子驱动的含核定位信号并优化的hSpCAS9亚克隆到同一个表达载体中, 选取了水稻ROC5、SPP和YSA三个易于观察表型的基因进行研究, 在获得的T1代转基因株系中突变效率除SPP仅为5%外, 其余两个基因高达26%~84%, 且大约10%的T1代YSA是纯合突变株系。Miao等(2013)采用玉米UBI启动子驱动带有NLS信号且水稻编码优化的CAS9和U3启动子驱动sgRNA的表达载体, 为了有助于CAS9的结合和R环的形成, 他们采用含活动间隔子、延长的发夹区和长的3'末端的sgRNA。针对CHLORO-PHYLL OXYGENASE I (CAOI)获得的30株转基因株系, 其中25株(83.3%)在PAM上游有3~4个碱基的插入或缺失, 其中4个株系(13.3%)是纯合子; 针对LAZY1获得的12株转基因株系中有11株(91.6%)在PAM上游存在碱基的插入或缺失, 其中6个株系

(50%)是纯合子。Zhang等(2014)针对OsPDS、Os-PMS3、OsEPSPS、OsDERF1、OsMSH1、Os-MYB5、OsMYB1、OsROC5、OsSPP和OsYSA基因分别设计sgRNA, 获得的T0代转基因株系中平均44.4%产生了突变, 其中7.7%的突变株系是纯合突变。对于T0代是纯合的突变株系, T1代能够稳定遗传下去; 对于T0代2个等位基因发生不同突变的突变株系, T1代按照经典的孟德尔遗传规律进行分离, 上述两种情况均没有发生新的突变和回复突变。采用全基因组深度测序, 在这些转基因株系中没有发现大规模的脱靶现象, 只是在一个与靶位点仅相差1 bp的地方发现了低频率的脱靶现象(9.7%), 说明可以通过精心选择靶位点来降低或消除脱靶现象。我们分别针对OsRUS1与OsRUS2设计了sg-RNA, 通过农杆菌介导的胚性愈伤侵染, 在获得的独立的T0代转基因苗中, 测序分析表明, 有部分转基因苗出现插入或缺失突变(未发表资料)。

CRISPR/Cas9技术不仅能在基因功能的研究中发挥作用, 而且还可用来创造出有用的育种材料。水稻苯达松敏感致死基因BEL的功能缺失将使水稻失去对苯达松和磺酰脲类除草剂的抗性, 如果将敏感突变体bel用于两系法杂交水稻生产, 就可避免因不育系的自交而产生的杂交制种的污染。Xu等(2014)将2个35S启动子驱动植物密码子优化的pSpCAS9和拟南芥U6-26启动子驱动的以水稻BEL为靶标的sgRNA整合于一个表达载体中, 通过农杆菌侵染转化水稻胚性愈伤, 在获得的90条独立的转基因株系中, 发现了14条株系发生插入、缺失突变, 其中有部分是纯合突变株, 并表现出对除草剂苯达松敏感的表型, 为拓宽杂交水稻的亲本材料和杂交制种的安全性提供了新的途径。他们的研究还发现CAS9的表达水平、靶位点的核酸组成(GC含量)以及靶区域的表观遗传等对基因突变的效率均有影响。这些研究报告充分表明, CRISPR/Cas9基因编辑技术可以成功地对水稻基因进行编辑, 不仅在阐明基因的功能方面, 而且在水稻品种改良方面具有良好的应用前景。1.2 小麦

小麦是重要的粮食作物之一, 获得对小麦基因组的编辑能力对小麦基因功能研究和作物改良具有重要意义。面包小麦是异源六倍体, 大部分基因具有3个相似但不完全相同的拷贝, 再加上基

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因组巨大(17 000 Mb)和高达80%~90%的重复序列,

使得对其基因组的改造难度较大。Shan等(2013)采用如前所述的编辑水稻基因组的载体构建策略, 针对小麦TaMLO基因, 以小麦原生质体为材料, 结果表明小麦原生质体突变效率在30%左右。Wang等(2014)设计了针对TaMLO-A1的sgMLO-A1, 在72条T0代转基因株系中找到4条独立的突变株系(5.6%), 与用TALEN技术获得的突变率相当, 他们正在大量的突变株系中筛选3个TaMLO基因均发生突变的株系, 因为3个TaMLO基因同时突变可以赋予小麦对白粉病的抗性。由于CRISPR/Cas9能够同时对几个靶基因进行编辑, 使得该技术在小麦等异源多倍体植物的基因功能研究和遗传改良方面, 相比其它技术更有优势。1.3 玉米

玉米不仅是研究植物遗传和基因功能的重要模式植物, 而且还是粮食、饲料、发酵及生物质能源的重要原料。虽然植酸中的磷大约占玉米种子总磷的75%, 但植酸是抗营养因子, 不能被单胃动物消化, 排泄到环境中造成污染, 因此降低玉米中的植酸含量具有非常重要的意义。Liang等(2014)针对玉米中植酸合成的关键酶基因ZmIPK构建了2个不同位点的CRISPR/Cas9载体, 靶位点1含SacI酶切位点, 靶位点2含BamHI酶切位点, 采用PEG介导的方法转化玉米原生质体, 在暗中培育48 h后提取基因组DNA进行PCR-RE (PCR-限制性酶切)分析, 靶位点1和2的突变频率分别为16.4%和19.1%, 测序分析表明发生了不同程度的插入与缺失。这一研究说明CRISPR/Cas9在改良玉米品质方面可能起到重要作用。1.4 高粱

高粱是禾本科中重要的粮食和经济作物, 提高其产量和品质也是作物基因工程重要的研究内容。Jiang等(2013)构建了Y158农杆菌双元表达载体, 在T-DNA中含有4个独立基因: 玉米泛素I启动子驱动的错码的红色荧光蛋白基因DsRED2; 水稻ACTIN I启动子驱动的适合单子叶植物表达的CAS9; 水稻U6启动子驱动的sgRNA (针对DsRED2编码起始区); 以及CaMV 35S启动子驱动的GFP-NPTII融合基因, 起抗性筛选及观察作用。用农杆菌介导法转化高粱未成熟胚, 2周后筛选到了具GFP荧光的稳定转化细胞, 18个具GFP荧光的稳

定转化的细胞株中有5个具有DsRED2红色荧光, 考虑到仅有三分之一的可能性将错码的基因校正为具正确读码的DsRED2, 说明该Cas9系统在高粱胚中的编辑效率还是很高的。

2 CRISPR/Cas9系统在双子叶植物中的应用2.1 拟南芥

拟南芥是最重要的双子叶模式植物, 对它的研究推动了植物科学的快速发展。Li等(2013)将密码子优化适合在植物中表达的pcoCAS9置于35SPPDK杂合组成型启动子驱动, 针对拟南芥AtPDS基因的sgRNA由拟南芥U6启动子驱动, 将此两个质粒1:1转化拟南芥原生质体, 获得大约5.6%的突变频率; 同样将针对AtFLS2的sgRNA与pco-CAS9按1:1共转化拟南芥原生质体, 获得大约1.1%的突变频率。为了验证该技术在整体植株中是否同样有效, 他们将针对AtPDS3的sgRNA和pcoCAS9亚克隆于同一个植物表达载体中, 用农杆菌注射法侵染拟南芥叶片, 测序分析表明突变频率为 2.7%。为了检测该技术的专一性, 从AtRACK1b和AtRACK1c选择一段相同序列作为靶点, 而与At-RACK1a仅有2个核苷酸不同, 实验结果表明, At-RACK1b和AtRACK1c分别获得2.5%与2.7%的突变频率, 但AtRACK1a却未发现任何突变。针对At-PDS3设计了2个靶点的sgRNA与pcoCAS9共转化, 发现这两个靶点的突变频率达7.7%, 说明该技术可以对多个位点进行编辑。这些研究表明, CRIS-PR/Cas9技术对拟南芥原生质体及叶片细胞中的靶基因可以相当特异地进行编辑。

CRISPR/Cas9在编辑拟南芥植株中靶基因的能力又如何呢？Feng等(2013)针对BRI1设计了3个不同位点的sgRNA, 针对JAZ1设计了1个sgRNA, 针对GAI设计了1个sgRNA, 分别将它们与带核定位信号的CAS9亚克隆于植物表达载体中, 通过浸花法转化拟南芥。针对BRI1的T1代50%以上表现出生长延迟及卷叶的bri1突变体的表型; 针对GAI的T1代25%以上表现出矮化的表型。虽然在针对JAZ1的T1代没有发现突变体的表型, 通过靶位点RE-PCR (限制性酶切-PCR)分析, 发现在T1代中有30%至84%的突变频率。而且还在多数的T1代转基因株系中发现2种以上的突变类型, 说明在植株的生长发育过程中, CAS9可能在持续发挥作用。Mao等(2013)将分别针对镁离子螯合酶亚基I的

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CHLI1和CHLI2的sgRNA与CAS9同时亚克隆到一个植物表达载体中, 通过农杆菌介导法转化拟南芥, 在60个T1代转化子中, 有23株因为严重的白化表型不能形成真叶而死亡, 其余株系生长缓慢, 并且多数株系的叶片具有嵌合色。选择3株具嵌合色叶片的转基因株系进行测序分析, 发现3个株系的2个基因均发生突变。另外针对TT4基因的2个靶位点, 这两个位点之间间隔230 bp, 在58株T1代转基因株系中, 89%的株系在第一个位点有突变, 84%的株系在第二个位点有突变, 74%的T1代植株在2个位点均存在突变, 其中26%的株系在2个位点之间出现了大片段的缺失, 表明该技术不仅可以对2个以上基因进行编辑, 而且可以进行大片段的基因缺失。这些研究报告表明, CRISPR/Cas9能在拟南芥基因组的编辑上发挥高效作用, 对基因功能的研究将起到十分积极的作用。2.2 大豆

大豆富含油脂和蛋白, 是重要的油料作物和植物蛋白的来源。Sun等(2015)分别用来自拟南芥的AtU6启动子和大豆的GmU6启动子, 构建了针对大豆Gm06g14180、Gm08g02290和Gm12g37050的CRISPR/Cas9载体, 利用PEG介导的方法转化大豆原生质体, 培养48 h后提取转化原生质体的DNA, 采用RE-PCR分析法表明靶位点发生了突变, 测序分析进一步表明Gm06g14180和Gm12g37050的靶位点发生了碱基的替换, Gm08g02290的靶位点发生了碱基的替换和缺失。他们进一步采用含上述CRISPR/Cas9载体的毛根农杆菌K599侵染大豆下胚轴获得毛状根, 提取DNA后采用PCR-RE分析表明, 单等位基因和双等位基因的突变均存在; 测序分析表明, 不同基因的突变形式也有所不同, 多数Gm06g14180的突变是单碱基的插入, Gm08g02290和Gm12g37050的突变大都是多个碱基的缺失。使用大豆GmU6启动子的打靶效率明显高于使用拟南芥AtU6启动子的打靶效率; 在原生质体和毛状根转化体系中均发现了一定的脱靶现象。Jacobs等(2015)构建了针对GFP的5'和3'的两个CRISPR/Cas9载体, 采用毛根农杆菌K599介导侵染大豆Jack-GFP子叶获得毛状根, 在针对GFP 5'的靶位点获得的17个毛状根中15个失去了GFP荧光, 而针对GFP 3'的靶位点获得的22个毛状根中仅4个失去了GFP荧光, 可见针对5'的效率远高于3'的。接着他

们构建了针对9个大豆内源基因的CRISPR/Cas9载体, 分别用毛根农杆菌介导获得毛状根和基因枪法转化体细胞胚, 在毛状根转化事件中有7个基因的平均插入-缺失频率达到70%以上, 这比用TALEN技术获得的3%~7%突变频率高了10多倍; 采用体细胞胚的转化事件, 发现突变频率随着培养时间的延长而增加, 说明CAS9可持续对野生型靶位点发挥作用。在其中两个基因的CRISPR/Cas9载体的转化事件中发现了脱靶现象, 但脱靶事件发生频率远低于靶位点的突变频率, 如针对靶位点Gm11g07220的突变频率高达95%~100%, 发生在Gm01g38150的脱靶频率2%~13%。这些研究表明CRISPR/Cas9技术在编辑、改良大豆基因方面能起到重要作用。2.3 烟草

烟草是重要的双子叶模式植物之一, 同时也是重要的经济作物。Nekrasov等(2013)将拟南芥U6启动子驱动针对烟草PDS基因的sgRNA和CAS9-GFP质粒的工程农杆菌注射烟草叶片, 2 d后提取注射区域组织的DNA。因为靶位点含有MlyI酶切位点, 采用RE-PCR方法分析表明突变率为1.8%~2.4%。将此片段克隆, 挑选20个不同的克隆测序, 发现其中17个具有插入/缺失, 分属于9种类型。他们进一步将注射上述工程农杆菌的叶片在抗性培养基上筛选, 用再生植株的叶片提取DNA分析, 在30株再生植株中发现2株发生了突变。其中一株含1种突变和野生型DNA, 说明可能是杂合体或嵌合体; 另外一株存在4种突变和野生型DNA, 表明是嵌合体。Li等(2013)采用与前述拟南芥中相同的sgRNA:pcoCAS9构建策略, 针对烟草中的PDS设计了2个靶位点, 在烟草原生质体中位点1的突变率为37.7% (43/114), 位点2的突变率为38.5% (25/65), 并且主要出现多碱基的缺失或插入, 而极少出现拟南芥那样单碱基的插入缺失或替换, 目前尚不清楚这种现象与植物种类抑或与其生理状态有关。为了研究HDR同源修复效率, 在针对烟草PDS位点1突变时, 除sgRNA:pcoCAS9外, 还提供一个含AvrII酶切位点的547 bp的同源序列供体, 该片段PCR的AvrII酶切分析表明, HDR替换率为10.7%; 测序表明HDR替换率为9.0%。这一技术为定点、高效及简便地插入基因片段提供了方便的技术手段。

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2.4 甜橙

柑橘是世界范围广泛种植的水果, 采用分子育种技术对其品质进行改良是今后育种的方向。

Jia和Wang (2014)将针对CsPDS基因的sgRNA与CAS9共同亚克隆于植物表达载体pCambia1380中, 采用柑橘黄单胞菌Xcc促进的农杆菌注射法将构建的载体导入甜橙叶片中, 处理4 d后从处理区域的叶片提取基因组DNA, 因靶位点含有MfeI酶切位点, 采用RE-PCR方法表明突变频率在3.2%~ 3.9%之间, 与在拟南芥和烟草叶片中的突变频率相当。进一步将处理组的片段克隆后挑选28个克隆去测序, 发现其中24个发生了11种类型的插入、缺失及碱基替换突变。他们还检测了脱靶的可能性, 在甜橙基因组中存在可能的46个脱靶位点, 其中14个含有MfeI酶切位点, 有8个位点成功扩增到了PCR产物, 但如果先用MfeI酶切处理基因组DNA,则不能扩增出PCR产物, 初步表明没有检测到脱靶效应。本实验成功表明, CRISPR/Cas9技术也能在甜橙中应用, 为今后利用该技术进行柑橘的品种改良奠定了基础。3 其他植物

目前, 大部分关于CRISPR/Cas9在植物中的应用的报道是以被子植物为研究对象, 在进化上处于较为低端的植物是否也能利用此技术进行基因组编辑呢？地钱(Marchantia polymorpha)作为研究陆生植物进化的模式植物, 对其研究可以解开陆生植物的进化奥秘。Sugano等(2014)以地钱U6-1的启动子驱动针对生长素正调控因子ARF1基因的sgRNA, 以及35S或MpEFpro启动子驱动的含核定位信号的CAS9, 通过农杆菌转化系统共转化地钱壳孢子, 经NAA抗性和潮霉素抗性筛选后在T1代中共获得了5棵(11.1%)突变植株, 经检测在PAM的3 bp上游区域发生了3、6和30 bp的缺失以及39 bp插入与569 bp缺失等突变。而且这些突变能够以胞芽无性生殖的方式稳定遗传给后代。4 CRISPR/Cas9引入突变的遗传特性

前面的实验大多以植物原生质体或叶片农杆菌注射的方法, 表明Cas9技术能够对植物基因组进行有效编辑, 但是这些编辑的遗传稳定性如何, 遵循什么样的规律进行遗传, 脱靶情况如何等问题却较少涉及, 而这些问题对于分子育种却十分重要。Feng等(2014)以拟南芥为材料, 针对这些问

题进行了研究, 他们对拟南芥GAI、BRI1等7个基因的12个位点采用CRISPR/Cas9技术进行编辑, 在T1代中均发现了突变, 但在T1代转基因植株中只检测到了嵌合型和野生型, 而没有纯合子、杂合子或双等位基因的突变存在。以GAI的T2代转基因株系为例, 发现了野生型、纯合子、杂合子、等位基因的不同突变和嵌合体五种类型, T2代纯合子株系其T3仍为纯合子, T2代为等位基因的不同突变的T3代则按经典的孟德尔遗传定律(1:2:1)进行分离, 且不管CAS9是否存在都不会产生新的突变类型。对于CAS9仍然存在的其他3种T2代类型, 由于CAS9能够持续对野生型基因进行编辑, 会产生比较复杂的分离类型, 但也遵循孟德尔遗传定律。采用对突变株进行深度全测序、与靶位点相似序列的手动比对以及可能的脱靶位点的PCR扩增测序等手段, 均未发现脱靶, 再结合上述即使CAS9存在, 突变的纯合子及等位基因突变能够忠实地往下遗传而不被进一步编辑的事实, 表明在植物中该技术具有很高的特异性, 这与人类细胞中报告的高脱靶率不同。Jiang等(2014)利用读码框发生偏移的无功能的GFP为研究对象, 在T1代拟南芥中研究表明有37%~95%在靶位点发生了突变, 其中大约三分之一具有正常的GFP荧光, 在T2、T3代能稳定遗传, 本研究再次表明CRISPR/Cas9引起的突变与其它技术产生的突变一样, 是稳定且符合孟德尔遗传定律的。这些工作表明Cas9技术在改良作物方面具有明确的应用前景。5 展望

从目前的研究来看, CRISPR/Cas9基因组编辑技术是目前科学家掌握的对基因组精确编辑的最佳技术。主要体现在以下几个方面: (1)靶位点选择的广泛性: CRISPR/Cas9技术选择靶位点的要求是具有NGG的PAM序列, 而这一序列在基因组中广泛存在, 可以在任意基因中都能找到数个靶位点, 并对它们进行编辑, 如以5'-AN(n)-GG-3'搜索, 如果n为20, 则可以在水稻基因组中找到大约3 183 497个靶位点, 在cDNA中找到大约566 367个靶位点, 平均每个基因有9个靶位点; 如果将n放宽到19、20、21, 则水稻基因组中靶位点增加到大约11 572 498个, 在cDNA中靶位点增加到大约566 367个, 平均每个基因有32个靶位点; 同样在小麦A、D基因组中每个基因大约可以找到21个潜在

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