1RNA-seq质量控制

RNA-seq 质量控制

1 建库流程

1.1 Total RNA样品检测

1.1.1 琼脂糖凝胶电泳分析RNA降解程度以及是否有污染

一句话总结：琼脂检测主要观察28s和18s。判断RNA好坏的标准是２8s，18s是否清晰，尤其是28S亮度比18s亮度大

28s，主要是剪切前的前体RNA，主要包括不均一核RNA（未剪切成熟的mRNA前体）和主要是28s，18s,5s的前体转录子。前体存在于细胞核（然后加工剪切成28s，18s，5s和成熟的小片段的mRNA。这些成熟的RNA进入到胞浆。有功能的mRNA是存在于胞浆中的成熟的mRNA，前体mRNA是没有翻译功能的（蛋白质翻译机器，核单倍体是位于胞浆中的）。真正成熟的mRNA，主要集中在28s和18s之间的荧光背景（一般每条基因mRNA量很少，所以，整体一般看不到明显带）.如果28s只是比18s稍高，或者亮度差不多，即使条带清晰，也已经提示部分降解了。大片段开始降解，从28s降解到18s最后降解到5s。这样降解过程中，28s减少，18s增多，28s：18s比例就会下降。如果最容易降解的28s都没有降解，（从比例推断），那么更难降解的mRNA，就推理出肯定是完好的了。 泳道：

1 2 3 4 5 6 7 8 9

这张图片就是一个离心柱子提取RNA的不同降解情况的典型例子。

泳道1,5,6,7,8,9 部分降解了，所以28s是首先降解，28s条带变淡，而部分降解首先是降解成较小的18s左右的片段，所以18s条带明显变粗，造成28s：18s的比例竟然小于1了。然后在不该看到条带或者应该是很弱的5s位置，出现了较明显的5s大小的降解带。

3,4是完全降解了，28s，18s已经基本降解光了。两条带都看不见了。最后降解成的小片段正好和5s大小一致，所以在5s位置看到了大量的一条浓浓的降解小片段，和5s一样大小。

2就是完全正常提取的RNA，大家可以看到28s:18s比例大约是2:1,5s位置也基本见不到带。这就说明完全正常，无降解。

(2) Nanodrop检测RNA的纯度（OD260/280比值）

一句话总结：260/280 大约在 2.0 而260/230 ration 在 2.0-2.2.

OD260代表核酸的吸光度，OD280代表蛋白质的吸光度。280、320、230、260nm下的吸光度分别代表了核酸、背景（溶液浑浊度）、盐浓度和蛋白等有机物的值。A230 测定其它碳源物质，如酚，糖类等；A260 是核酸的吸收峰测 RNA 和 DNA，引物等的浓度用的；A280 是蛋白质的吸收峰。

一般的，我们只看 OD260/OD280（Ratio，R）——1.8~2.0时，我们认为 RNA中蛋白或者时其他有机物的污染是可以容忍的，不过要注意，当用 Tris 作为缓冲液检测吸光度时，R 值可能会大于 2（一般应

该是<2.2的）。当 R<1.8时，溶液中蛋白或者其他有机物的污染比较明显，你可以根据自己的需要决定这份RNA 的命运。当 R>2.2时，说明 RNA 已经水解成单核酸了。 纯RNA 的A260/A280的比值为 2.0。 OD260/OD230的比值还表明 RNA 的纯度——其值 <2.0 表明裂解液中有亚硫氰胍和β-巰基乙醇残留，其值 >2.4，需用乙酸盐，乙醇沉淀 RNA。

(3) Qubit对RNA浓度进行精确定量

一句话总结：RNA-seq测序需要至少300 ng 总RNA

(4) Agilent 2100精确检测RNA的完整性

一句话总结：2100 RIN值高好，样品间RIN值相差1-1.5最好。

Agilent 2100对文库的insert size进行检测，RIN值反应的是样品的降解。RIN=RNA integrity number，即 RNA 分子完整数，从 0-10，直接反应了 RNA 质量的好坏，此数值越大表明 RNA 质量越好越完整。

1.2 建库流程

1.2.1 ssRNA-seq 建库（针对长非编码RNA分析）

RNA检测合格后，通过epicentre Ribo-ZeroTM试剂盒去除rRNA（可以拿到非polyA的转录本）随后加入fragmentation buffer将RNA打断成150-200bp短片段150-200bp，以短片段RNA为模板，用六碱基随机引物（random hexamers）合成一链cDNA，然后加入缓冲液、dNTPs（dUTP、dATP、dGTP和dCTP）和DNA polymerase I合成二链cDNA，随后利用AMPure XP beads纯化双链cDNA。纯化的双链cDNA再进行末端修复、加A尾并连接测序接头，然后用AMPure XP beads进行片段大小选择。之后用USER酶降解含有U的cDNA第二链，最后进行PCR富集得到链特异性cDNA文库。

图：lncRNA建库 1.2.2 小RNA建库

样品检测合格后，使用 Small RNA Sample Pre Kit 构建文库，利用 Small RNA 的 3’ 及 5’ 端特殊结构（ 5’ 端有完整的磷酸基团， 3’ 端有羟基），以 total RNA 为起始样品，直接将 Small RNA 两端加上接头，然后反转录合成 cDNA 。随后经过 PCR 扩增， PAGE 胶电泳分离目标 DNA 片段，切胶回收得到的即为 cDNA 文库。

1.2.3 普通转录组建库

样品检测合格后，用带有Oligo（dT）的磁珠富集真核生物mRNA（若为原核生物，则通过试剂盒去除rRNA来富集mRNA）。随后加入fragmentation buffer将mRNA打断成短片段，以mRNA为模板，用六碱基随机引物（random hexamers）合成一链cDNA，然后加入缓冲液、dNTPs和DNA polymerase

I合成二链cDNA，随后利用AMPure XP beads纯化双链cDNA。纯化的双链cDNA再进行末端修复、加A尾并连接测序接头，然后用AMPure XP beads进行片段大小选择，最后进行PCR富集得到最终的cDNA文库。构建原理图如下：

图RNA-seq建库 1.2.4 Chip-seq建库流程

染色体免疫共沉淀（ChIP）是一种用于研究蛋白质与 DNA 的体内相互作用的经典实验技术。采用特异性抗体将目的蛋白进行免疫沉淀，由此可以把目的蛋白所结合的基因组 DNA 片段也富集下来。 方法1 ：Cross-liking Chromatin Immunoprecipitation (X-ChIP)

甲醛处理细胞，使 DNA-protein 的相互结合作用被交联固定， 裂解细胞，得到全细胞裂解液。超声处理，将基因组 DNA 打断至 100-500 bp。抗体免疫沉淀：在细胞裂解液中加入一抗和 beads，并进行孵育。采用合适的实验条件进行洗脱，并解交联。通过 qPCR 对 ChIP 结果进行验证。准备好的 ChIP 后的 DNA 样品可以用于 ChIP Sequencing 建库。 方法2：Native Chromatin Immunoprecipitation

通过非变性的方式得到核裂解液。微球菌核酸酶（Micrococcal nuclease）消化染色质，得到单核小体或核小体寡聚体。抗体免疫沉淀：在细胞裂解液中前后加入一抗和 beads，并进行孵育。DNA 分离。通过 qPCR 对 ChIP 结果进行验证。 6. 准备好的 ChIP 后的 DNA 样品可以用于 ChIP Sequencing 建库。最后DNA 片段末端修复,3’端加 A 碱基，连接测序接头公司 Paired-End DNA Sample Prep kit）。 PCR 扩增及 DNA 产物的片段大小选择一般为 100-300 bp，包括接头序列在内合格的文库用于上机测序。

2质量控制相关的变量 2.1 reads quality issue

2.1.1 测序错误率Base Quality

Base quality indicates the confidence in the base call q = ?10*log 10 (0.01) = 20

测序错误率特征(1)测序错误率会随着测序序列(Sequenced Reads)长度的增加而升高，这是由于测序过程中化学试剂的消耗而导致的。(2)前6个碱基的位置也会发生较高的测序错误率，而这个长度也正好等于在RNA-seq建库过程中反转录所需要的随机引物的长度。所以推测前6个碱基测序错误率较高的原因为随机引物和RNA模版的不完全结合

图 前6碱基错误率高，125bp测序错误率高

2.1.2 CG含量

正常情况下四种碱基的出现频率应该是接近的，而且没有位置差异。因此好的样本中四条线应该平行且接近。当部分位置碱基的比例出现bias时，即四条线在某些位置纷乱交织，往往提示我们有overrepresented sequence的污染。当所有位置的GC含量一致的表现出bias时，往往代表文库有bias (建库过程或本身特点)，或者是测序中的系统误差。前几个不稳定due to the random hexamer priming during PCR amplification，属于正常的现象

红线是实际情况，蓝线是理论分布（正态分布，均值不一定在50%，而是由平均GC含量推断的）。 曲线形状的偏差往往是由于文库的污染或是部分reads构成的子集有偏差（overrepresented reads）。形状接近正态但偏离理论分布的情况提示我们可能有系统偏差

图：重复序列检测

2.1.3 重复序列

理论上出现重复序列的概率是很低的。如果出现重复的序列，很多是人工的artificiallyPCR 扩增。下图是横坐标是duplication的次数，纵坐标是duplicated reads的数目，以unique reads的总数作为100%。 fastqc中用fq数据的前200,000条reads统计其在全部数据中的重复情况。重复数目大于等于10的reads被合并统计

如果某k个bp的短序列在reads中大量出现，其频率高于统计期望的话，fastqc将其记为

over-represented k-mer。出现频率总体上3倍于期望或是在某位置上5倍于期望的k-mer被认为是over-represented。K-mer可以用于检测是否有接头存在。

2.1.4 比对统计：检测对reference的比对情况

检测mapping ratio, 看比对上的总数，还可以同污染源的基因组进行比对。

2.1.5rRNA/tRNA 的污染

组成RNA的污染，如rRNA和tRNA, 最高时可以占整个转录组的60-90%。 建库时对这类RNA进行降解。有2种方法，一种是使用磁珠进行吸附选择有poly-a的转录本。第二种是对核糖体RNA进行消化。即使这样，仍然会有大量的核糖体rRNA污染存在。

2.1.6 Saturation Test of Sequencing Depth

测序深度不同，对低丰度的基因使用FPKM定量也并不稳定，此外做可变剪切，lncRNA需要更高的深度才能检测。一般认为100*-150*可以饱和。

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2.1.7生物学重复

RNA-seq通常要求至少2个生物学重复，注意区别生物学重复和技术重复，生物学重复一般建议皮尔逊相关系数0.92以上。可以通过聚类，计算相关系数,PCA样品研究样品之间的关系。

2.1.8覆盖整齐度 Coverage Uniformity

RNA-seq测序的结果，理论上每个位点被测序到的机会是相等的，但是由于poly-A选择，3’端往往会具有更高的coverage.此外大多数reads应该位于基因注释区。

2.1.9 链特异性Strand Specificity

转录本可以从正义链和反义链进行转录，大多数基因位于正义链，但仍有部分能从反义链上转录出来，比如天然反义转录本NAT，普通的转录组数据可以通过剪切位点GT/AG 区分方向，但是无法定量反义转录本的表达量。

2.2 FastQ的数据格式

1.原始序列数据

高通量测序(如 Illumina HiSeqTM2000/MiseqTM)得到的原始图像数据文件经 CASAVA碱基识别(Base Calling)分析转化为原始测序序列（Sequenced Reads），我们称之为 Raw Data或 Raw Reads，结果以 FASTQ (简称为 fq)文件格式存储，其中包含测序序列（reads）的序列信息以及其对应的测序质量信息。

FASTQ 格式文件中每个 read 由四行描述，如下：

@HWI-ST1276:71:C1162ACXX:1:1101:1208:2458 1:N:0:CGATGT NAAGAACACGTTCGGTCACCTCAGCACACTTGTGAATGTCATGGGATCCAT +

#55???BBBBB?BA@DEEFFCFFHHFFCFFHHHHHHHFAE0ECFFD/AEHH

其中第一行以“@”开头，随后为 Illumina 测序标识别符(Sequence Identifiers)和描述文 字(选择性部分)； 第二行是碱基序列；

第三行以“+”开头，随后为 Illumina 测序标识别符(选择性部分)；

第四行是对应碱基的测序质量，该行中每个字符对应的 ASCII 值减去 33，即为对应第二 行碱基的测序质量值。

Perl代码： ord$base -33 3软件使用

3.1 常用的软件的名称

FastQC: PRINSEQ 做质量检测并可视化

Trimmomatic, Cutadapt, and FastX,Fastx-toolkits 3.2 软件的命令和参数

3.2.1 对文件进行 fastqc reads.fastq.gz 3.2.2 Fliter and Trim

java -jar trimmomatic-0.32.jar PE -phred64 reads1.fastq.gz reads2.fastq.gz paired1.fq.gz unpaired1.fq.gz paired2.fq.gz unpaired2.fq.gz AVGQUAL:20

prinseq-lite.pl -fastq reads1.fastq -fastq2 reads2.fastq -phred64 -min_qual_mean 20 -out_good qual_filtered -out_bad null –no_qual_header –log –verbose

java -jar trimmomatic-0.32.jar PE -phred64 reads1.fastq.gz reads2.fastq.gz paired1.fq.gz unpaired1.fq.gz paired2.fq.gz unpaired2.fq.gz TRAILING:20 MINLEN:50

1.2去掉含有5‘ adapter污染的序列的command：

/WPS/RNA/pub/software/fastx_toolkit/bin/fastx_clipper -i test.fltqual.fastq -o test.fltqual.f5.fastq -a \1.3含有3’ adapter的序列保留，且trim掉3‘adapter的command：

/WPS/RNA/pub/software/fastx_toolkit/bin/fastx_clipper -i test.fltqual.f5.fastq -o test.fltqual.f5.t3.fastq -a \

整理zhaot

2015-5-9 参考：http://blog.sina.com.cn/s/blog_6a15f8d90100y5aw.html

https://www.huck.psu.edu/content/instrumentation-facilities/genomics-core-facility/samples/rna-seq-samples

本文来源：https://www.bwwdw.com/article/tlvt.html