黎晓新年龄相关性黄斑变性的发病机制及其干预策略的研究 - 图文

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项目名称: 年龄相关性黄斑变性的发病机制及其干

起止年限:依托部门:预策略的研究

黎晓新 北京大学 2010.9至2015.9 教育部

首席科学家:

二、预期目标

本项目的总体目标:

在本项目组已有的前期工作成果和基础之上,针对AMD发病多种机制,探讨AMD易感基因、衰老、免疫及新生血管形成机制,推进对AMD发病机制的认识,形成新的AMD复合致病机制理论;通过自体单层片状RPE移植、骨髓间充质干细胞移植和视网膜神经节细胞的基因改造的研究,解决AMD新型干预方法中的关键基础问题,使我国AMD的基础研究和干预策略形成自己的特色,领先于国际水平。同时解决AMD的治疗这一国家重大需求,减少患者和国家的经济损失,促进社会和谐。

五年预期目标:

1. 系统分析并验证前期工作中新发现的AMD(包括PCV)易感基因、特征性SNP在中国人群AMD患者中的遗传易感性,并对其参与致病的机制进行深入研究。 2. 根据上述研究构建新型AMD动物模型,并深入研究基因与环境的相互作用。 3. 系统探讨氧化应激在AMD发病机制中所起的作用,探索调控氧化应激相关因子对早期AMD和干性AMD的治疗作用。

4. 探讨衰老相关基因、氧化蛋白质和蛋白酶体在AMD发病机制中所起的作用,探索新的AMD抗衰老治疗策略。

5. 探索AMD发病进程中重要的生物标记,为AMD的诊断、分类以及预后提供有重要参考价值的生物学方法。

6. 系统分析参与AMD发生的细胞因子种类,绘制AMD相关细胞因子的关联图谱及功能连锁图,为认识AMD的发生发展规律开辟新的思路,建立免疫抗体阻断和基因治疗的新方法。

7. 阐明感染因素、自身抗体是否及如何参与AMD的发生,揭示参与AMD免疫反应的相关免疫细胞与细胞因子的作用路径,深入认识非特异性免疫与特异性免疫在AMD发生中的作用方式。

8. 深入探讨单核巨噬细胞在CNV发病过程中的作用和机制,DDRs与整合素-FAK信号通路对CNV的协同调控作用,EphrinB2/EphB4在CNV发生中的接触信号机制,从而揭示CNV发病机制。

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9. 系统研究抑制多靶点(VEGF-A,-B,-C和PlGF)药物KH902抗CNV的机制及效能,同时进一步构建并筛选能抑制多靶点的新型蛋白分子,寻找更好的靶向药物。

10. 利用药物基因组学探索与抗VEGF药物治疗效果和不良反应等预测或预后相关基因,用于指导临床治疗。

11. 系统探讨PCV的发病机制,找出刺激PCV发生的特异性因子,为临床干预提供实验基础。

12. 探讨自体单层片状RPE植入后对感光细胞的拯救作用及其机制,以及对局部免疫状态的影响。

13. 研究胚胎干细胞向类RPE细胞的诱导分化以及植入视网膜下后对感光细胞的保护及其机制,以及对局部免疫状态的影响,为其临床应用提供理论依据。 14. 研究灵长类动物中表达光通道蛋白的神经节细胞的视觉功能,为临床应用奠定理论基础。

15. 研究成果预期在国内外眼科学等专业期刊上发表高水平论文50-100篇,其中Web of Science 数据库(SCI)收录30-50篇。 16. 申请6-15项国家和/或国际发明专利。

17. 人才培养:计划培养学术水平高、创新能力强的中青年学术骨干6-12名,博士后6-12名,博士和硕士研究生20-40名,为AMD发病机制及干预的基础和临床研究组建一支具有国际影响力的高水平研究队伍。

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三、研究方案

总体思路:

AMD是一种复杂性状疾病,多种关键性因素在AMD发病多种机制中发挥重要作用,因此,必须从AMD发病的各机制进行深入系统的研究,才能使其得到充分认识。对AMD易感基因等AMD发病的遗传学机制研究(课题1)对于阐明AMD的遗传特性和基因早期诊断干预策略研究具有重要意义。衰老和氧化应激(课题2)是AMD发病的早期阶段,对该致病机制深入研究并寻找新的特异性衰老和氧化关键因子是解释AMD发病机制的根本途径,同时也为抗氧化抗衰老治疗AMD提供了重要线索。免疫因素(课题3)是连接衰老、氧化应激与血管生成等机制的重要桥梁,它引导视网膜由生理性老化走向不可逆性病理性损伤,深入探讨其关键因子及作用机制,是AMD发病机制与干预研究必不可少的组成部分。新生血管生成(课题4)作为上游各机制诱发CNV的直接致病机制,在湿性AMD发病过程中具有极其重要的作用,是发病机制上游环节致病作用的验证,也为新的抗血管形成干预策略提供最直接的证据。以上机制及干预策略主要为全身和眼内药物治疗,而单层片状RPE移植和干细胞移植(课题5)则为眼外科治疗AMD提供了重要实验依据。对以上诸方式均未能控制的终末期AMD病例,神经节细胞基因改造(课题6)成为最终挽救视力的方式,它直接使视网膜内层的神经节细胞感光从而避开了AMD发病的视网膜外层,保证了AMD的整个治疗流程覆盖了早期、干性、湿性、终末期,使得所有患者均有恢复视力的可能。总之,我们将充分把握本团队的创新性和突破性,对AMD发病机制和干预新策略进行深入系统研究。 以下是总体研究思路图解:

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总体研究思路遗传易感性环境因素:始动阶段:病变进展衰老氧化应激免疫血管生成发病机制地图样萎缩(干性AMD)脉络膜新生血管(湿性AMD)抗衰老抗氧化调节免疫抗新生血管干细胞移植节细胞基因改造终末期病变RPE/干预策略

早期病变中晚期病变

创新点与特色:

1. 提出了新的科学问题:本项目围绕AMD发病的遗传因素,衰老、氧化

应激、免疫及新生血管形成等发病和干预的关键环节进行研究,并进一步探讨RPE移植、干细胞移植和视网膜节细胞基因改造等治疗方式,研究方向具有创新性和突破性研究,对AMD新的分子机制、关键因子、干预治疗的探索具有重要意义。

2. 原创性研究基础上的新层面的进一步研究:六个课题均在团队大量前期

研究基础上进行,是针对团队前期新发现的中国人特有的AMD(包括PCV)易感基因和调控分子的作用及致病机制的系统研究,具有很强的原创性,能够创造一系列具有自主知识产权的新型临床早期诊断和干预方法,具有重大的理论和临床应用价值。

3. 高起点的新的实验平台:本项目利用我们先进的基因研究方式、完备的

抗衰老和免疫应激研究方法、成熟的免疫学研究平台、具有独立知识产权的国家Ⅰ类新药KH902和多种VEGF受体-免疫球蛋白Fc片断融合蛋白、雄厚的RPE移

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验对照。观察时间3个月,观察内容包括眼底照相、频域OCT、FFA和ICG等形态学观察,以及进一步的组织学观察,包括光镜、电镜检查观察移植的RPE细胞与神经视网膜的形态和存活情况,观察移植的RPE细胞与感光细胞外节的嵌合关系,与植床Bruch膜的结构关系,及其极性和吞噬功能表现;TUNEL检测,观察RPE植入后RPE细胞和感光细胞的调亡;b. CRALBP,RHAMM和ZO-1免疫组化,观察植入RPE的功能状态。CRALBP (cellular retinaldehyde bingding protein)为胞内视黄醛结合蛋白,其功能是参与RPE细胞中视黄醛的合成与代谢;RPE细胞表面的RHAMM (receptor for hyaluranon mediated motility)可作为跨膜膜蛋白(如PDGF)的共同受体与ECM中的透明质酸(Hyaluranon, HA)相互作用, 从而激活细胞内的信号级联系统,它可与细胞内的许多激酶、钙调蛋白和细胞骨架微管蛋白结合,可能对细胞骨架的装配和维持光感受器细胞外基质(interphotoreceptor matrix, IPM)微环境的稳定具有重要作用。ZO-1是RPE形成紧密连接的咬合蛋白,它可反映移植的RPE细胞的连接情况;免疫组化检测Rhodopsin的表达, 评价移植的RPE细胞对感光细胞的保护作用。共焦显微镜检测CD73,观察损伤的感光细胞再生修复情况。有研究证实,CD73是视网膜光感受器前体细胞膜表面的标志性抗原,它的大量表达是感光细胞发育和再生的特征;RPE移植后是否出现增殖性改变,是否出现成纤维细胞的瘢痕修复以及植片对新生血管是否有抑制作用,都是需要关注的问题。因此,本实验将用免疫组化观察Ki-67(胞核内细胞增殖相关抗原), bFGF和 VEGF的表达情况。

3)胚胎干细胞诱导发育类RPE细胞移植的基础研究:体外培养大鼠胚胎干细胞,利用体外条件培养基将胚胎干细胞诱导分化为类RPE细胞,应用免疫组化、Western Blot 和RT-PCR的方法检测诱导后的胚胎干细胞Mertk基因、RPE-65、CRALBP和CK3的表达;检测被诱导胚胎干细胞的特异性及非特异性吞噬功能,前者观察其吞噬经FITC标记的光感受器外节(retina outer segments, ROS);后者观察其吞噬乳胶微球的表现;单层的类RPE细胞培养,Live/dead荧光探针检测细胞活性状态;应用光镜、共焦显微镜、电镜技术和免疫组化的方法检测单层细胞的组织结构和细胞间连接(ZO-1、JAM、Occludin)的表达。

4)动物实验:用腺病毒转染绿色荧光蛋白标记自体MSCs诱导的类RPE细胞和未经诱导分化的MSCs,将以上两种细胞接种在消化后的羊膜上,将BN大鼠

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随机分成三组。实验组:将标记的自体MSCs诱导的类RPE细胞移植到视网膜下腔;实验对照组:将标记的自体未诱导的MSCs细胞移植到体视网膜下腔;空白对照组:将消化后的羊膜移植到视网膜下腔。观察时间3个月进行形态学和组织学观察包,使用免疫组化检测感光细胞Rhodopsin的表达,以确定移植的类RPE对感光细胞的保护作用;研究LKB1是否在鼠的RPE极性调控中发挥作用。

5)干细胞疗法靶向治疗脉络膜新生血管:通过观察各种干细胞参与CNV生成情况,明确参与CNV生成的干细胞类型,检测细胞表面趋化因子受体表达情况和对趋化因子反应能力,并实时监测干细胞在体内移行过程,探讨参与CNV生成的干细胞的移行过程和机制并挑选趋化特异性强、效率高的干细胞载体;转导后干细胞移植,监测干细胞在体内移行和目的蛋白表达,观察CNV抑制效果和视网膜结构功能保护效果,评价该疗法的疗效和安全性。

经费比例:10%

承担单位:北京大学、中国人民解放军第四军医大学 课题负责人:马志中

学术骨干:宋书娟、胡运韬、侯慧媛、沈丽

课题6、基因修复晚期AMD的视功能研究 预期目标:

采用新型的生物治疗方法,使视网膜神经节细胞(RGC)能够抵御新血管增生和直接感光,进而通过RGC在改善新血管增生的同时通过其轴突把视觉信息直接传递到各视觉中枢而达到拯救AMD患者视觉功能的目的。

研究内容:

本研究定位于AMD晚期,在本阶段尽管视网膜神经通路无序重组已导致视觉信息无法抵达RGC,但是大量RGC仍然存在。在本课题中我们将采用药物使视觉感受器凋亡,然后使RGC表达光通道蛋白。将研究自身感光的RGC是否可以将视觉信息传递到各视觉中枢并评估动物视觉功能是否得以改进。本课题主要研究腺相关病毒在眼内免疫原性、提高光通道蛋白基因转染效率、时效性与安全剂量、转染后神经节细胞的对光反应特征研究、视觉中枢对视觉刺激的编码研究,利用光通道蛋白使非感光的神经节细胞具有感光能力。

1)视觉心理物理学训练和电生理学记录V1神经元反应特性:年青恒河猴(2-4岁大)将作为实验动物,在动物的颅骨上嵌入不锈钢固定柱并安置电生理

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学记录腔,训练动物完成注视显示屏上的注视目标和通过快速眼动追踪一个快速变位的光点,在V1内特定皮层区域,采用微电流刺激某局部神经元,通过奖惩学习机制训练动物通过识别黑白大写英文字母〝E〞缺口的方向(共四个不同方向),并进一步训练其学会识别不同颜色、亮度和大小视标,以及识别不同简单几何图形(三角形、正方形、多边形、圆等)。用上述方法我们可以客观评估动物视觉敏感度、视觉敏锐度、光谱敏感度和图形识别能力。

2)采用shRNA干扰技术抑制RGC上GPR91受体表达:利用慢病毒(Lentivirus)包装sh.RNA GPR91,LV.GFP,和LV.shRNA.Scrambled然后将病毒载体注入眼玻璃体内,使其作用于RGC上的GPR91受体。

3)视感受器损伤实验:动物静脉内注射碘乙酸(IAA),七天后采用行为学和电生理学检测手段,确定视网膜视觉感受器损伤状态。

4)对视网膜RGC进行基因治疗:在RGC上表达对光敏感通道蛋白(ChR2),采用我们已报道的方法使用AAV2运载表达ChR2,的基因。首先从腺联合病毒基因组切取带N-末端(Met1-Lys315)的DNA片段,将其克隆到质粒载体pBluescript中,载体pBluescript含有多聚腺苷酸化信号的鼠(鱼)精蛋白1基因最后一个外显子。将GFP的 cDNA插入到Chop2的3’末端以构建一个Chop2-GFP融合蛋白。在转染了质粒的HEK293细胞中检验Chop2-GFP的功能。rAAV2-

CAG-Chop2-GFP-WPRE病毒表达质粒是通过将Chop2-GFP片段亚克隆到一个腺苷酸偶联的(serotype-2)病毒表达盒中。这个病毒表达盒含有杂化的CMV增强子,鸡β-actin起动子(CAG),旱獭转录后调控元件(WPRE),以及小牛生长激素(BGH) 多聚腺苷酸化序列。最后对病毒载体进行包装和亲和纯化。用注射器将准备好的携带有ChR2 基因的病毒载体AAV2注入玻璃体内。

5)采用行为学方法评估动物的视觉功能恢复状态:眼球内注射AAV2一个月后,在不同的时间间隔评估动物的视觉功能,确定接受治疗的眼睛是否存在光感,如果光感明显,确定对何种波长的光最敏感;如果不明显,和未经治疗的对照眼相比是否存在差异。随着时间的推移这种差异是否会发生变化;确定动物是否能够使用接受治疗的眼睛识别周围的环境,如果可以,确定最佳照明光强度和波长;随着动物视力的逐渐恢复,开始评估动物是否能够正确完成快速眼动追踪目标,评估动物视敏度,采用神经电生理学方法评估动物的视觉功能恢复状态。

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经费比例:11.5% 承担单位:北京大学 课题负责人:濮鸣亮

学术骨干:陆晖、高洁、王凯

各课题间相互关系

本项目拟从AMD各发病机制的关键问题出发,以本研究团队的大量前期工作为基础,结合国内外最新研究进展设置课题,紧密围绕视网膜色素上皮复合体损伤与修复这个关键科学问题,在AMD发生的遗传背景、衰老、氧化应激、免疫、新生血管形成机制以及RPE移植、干细胞移植、视网膜神经节细胞改造等临床干预方法等多方面,展开系统的研究工作,基础与临床有机结合,全面地阐述AMD发病机制,为AMD干预提供创新性靶向,使我国在AMD研究领域的工作从总体上达到国际前沿,在AMD的基础研究向临床转化、创新性理论等方面达到国际一流水平。

为此,本项目拟设置六个课题:课题一、中国人AMD的遗传特征和环境因素研究;课题二、早期AMD和干性AMD的衰老和氧化机制研究;课题三、湿性AMD的免疫机制研究;课题四、湿性AMD的新生血管生成机制和干预研究;课题五、自体单层片状RPE移植和干细胞移植治疗湿性AMD的相关基础研究;课题六、神经节细胞基因改造修复AMD视功能的研究。 本项目的六个课题均是围绕AMD发病机制中遗传背景、衰老、氧化应激、免疫、新生血管形成机制以及干预策略的关键问题进行设置,各课题既有明确的研究方向,又有课题间的密切联系。而且,课题组成员已在上述各领域进行了长期的研究,不少成员间有多年的合作研究基础和成果。

课题一、二、三、四针对AMD不同阶段与类型的发病机制进行深入研究。其中课题一研究AMD易感基因及环境因素与AMD发病的关系,探讨中国人特异的基因表现、基因型与表型在AMD发病过程中的关系,是AMD发病的启动阶段;课题二研究衰老和氧化应激机制,这是针对AMD发病的早期阶段;课题三是探讨免疫机制,它是联接AMD早期阶段与不可逆炎症阶段的关键桥梁;课题四是研究新生血管形成机制,这是AMD严重影响视力的关键病变,标志着病变发展到了中晚期。以上四个课题针对了AMD发病的各个序贯阶段,深入系统地研究了AMD的发病机制。值得注意的是在AMD实际发病过程中,这几个致病机制并非简单叠加,

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而是互相协同,共同导致了病变的发生。因此,以上四个课题之间又有内在的协同关系。对于治疗策略,课题一主要针对AMD启动阶段及预防措施;课题二的目标是早期AMD病变;课题三探讨了联系早期与中晚期的关键桥梁;课题四针对病变的中晚期阶段;课题五是以上方法均无效时的补救方式;课题六针对终末期AMD,整个视网膜外层均已被破坏,探讨通过视网膜神经节细胞基因改造,使得神经节细胞可以感光,从而通过内层视网膜感光而恢复视功能。课题一至六涵盖了从预防到早、中、晚、终末期AMD的治疗策略。整个课题设置顺序,既按照不同发病机制的先后缓急,又按照被干预AMD病变的严重程度,对整个AMD疾病发病机制与干预策略进行了系统、深入研究,构成了完整的AMD研究体系。(见下图)

与项目总体目标和五年目标的关系

本项目将紧紧围绕“视网膜色素上皮复合体损伤与修复”这一关键环节和科学问题进行研究,从在AMD发生的遗传背景、衰老、氧化应激、免疫、新生血管形成机制以及RPE移植、干细胞移植、视网膜神经节细胞改造等临床干预方法等多方面,展开系统的研究工作。本项目拟设置六个课题:课题一、中国人AMD的遗传特征和环境因素研究;课题二、早期AMD和干性AMD的衰老和氧化机

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本文来源:https://www.bwwdw.com/article/tlfv.html

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