生物化学实验

生物化学实验指导 实验一 蛋白质性质实验

【实验目的】

加深对蛋白质胶体分子稳定因素的认识，了解蛋白质的沉淀反应、变性作用的原理及其相互关系。 【实验原理】

1.蛋白质的沉淀反应

蛋白质分子由于形成水化层和双电层而成为稳定的胶体颗粒。但是，蛋白质胶体颗粒的稳定性是有条件的、相对的。在一定的物理化学因素影响下，蛋白质颗粒失去电荷、脱水，甚至变性而丧失稳定因素，即以固态形式从溶液中析出，这种作用称为蛋白质的沉淀反应。该反应可分为以下两种类型：

（1）可逆沉淀反应

在发生沉淀反应时，蛋白质虽已沉淀析出，但其分子内部结构并未发生显著变化，基本

上保持原有的性质。沉淀因素除去后，蛋白质沉淀可再溶于原来的溶剂中。这种沉淀

反应

为可逆沉淀反应。属于此类反应的有盐析作用；在低温下，乙醇或丙酮对蛋白质的短时间作

用以及等电点沉淀等。

用大量中性盐使蛋白质从溶液中析出的过程称为蛋白质的盐析作用。蛋白质是亲水胶体，在高浓度的中性盐影响下，蛋白质分子被盐脱去水化层，同时，蛋白质分子所带的电荷被中和，蛋白质的胶体稳定性遭到破坏而沉淀析出。沉淀出的蛋白质仍保持其天然蛋白质的性质，若减低盐的浓度时，还能溶解。

（2）不可逆的沉淀反应

在发生沉淀反应时，蛋白质的分子内部结构，空间构象遭到破坏，失去其天然蛋白质的性质，这时蛋白质已发生变性。变性后的蛋白质沉淀不能再溶解于原来的溶液中，这种沉淀反应称为不可逆沉淀反应。重金属盐、生物碱试剂、强酸、强碱、加热、超声波、有机溶剂等都能使蛋白质发生不可逆沉淀反应。

【实验试剂和器材】 （一）试剂 1. 鸡蛋清 2. 95%乙醇 3. 三氯乙酸 4. 饱和硫酸铵 5．固体硫酸铵 （二）器材

试管及试管架，电炉，玻璃漏斗，滤纸，移液管，滴管。 【实验步骤】

1．盐析沉淀：取蛋清约2ml于试管中，加入等体积的饱和硫酸铵溶液，搅拌均匀，观察现象。

若有沉淀析出，则为卵球蛋白，静置数分钟，用滤纸过滤，滤出的沉淀物质重新放入蒸馏水中，观察现象。

将滤液放于试管中，再加入固体硫酸铵使达到饱和，观察现象。

2．有机溶剂沉淀：将盐析所得到的蛋白质重新溶于数毫升水中，摇匀使其溶解。向溶液中加入95%乙醇数滴，强力摇匀，观察结

果。

3．加热沉淀：将盐析所得到的蛋白质重新溶于数毫升水中，摇匀使其溶解。将试管置于沸水浴中加热并观察现象。

4．变性剂沉淀：将盐析所得到的蛋白质重新溶于数毫升水中，摇匀使其溶解。在试管中滴入数滴三氯乙酸，观察现象。 【实验结果】

列表写出各步骤的实验现象及原因

实验二 考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含

量

【实验目的】

蛋白质是细胞中最重要的含氮生物大分子之一，承担着各种生物功能。蛋白质的定量分析是蛋白质构造分析的基础，也是农牧产品品质分析、食品营养价值比较、生化育种、临床诊断等的重要手段。根据蛋白质的理化性质，提出多种蛋白质定量方法。考马斯亮蓝G-250法是比色法与色素法相结合的复合方法，简便快捷，灵敏度高，稳定性好，是一种较好的常用方法。通过本实验学

习考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量的原理，了解分光光度计的结构、原理和在比色法中的应用。 【实验原理】

考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度，是利用蛋白质-染料结合的原理，定量的测定微量蛋白浓度的快速、灵敏的方法。

考马斯亮蓝G-250存在着两种不同的颜色形式，红色和蓝色。考马斯亮蓝G-250在酸性游离状态下呈棕红色，最大

光吸收在465nm，当它与蛋白质结合后变为蓝色，最大光吸收在595nm。在一定的蛋白质浓度范围内，蛋白质-染料复合物在波长为595nm处的光吸收与蛋白质含量成正比，通过测定595nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。

蛋白质和考马斯亮蓝G-250结合，在2min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速，其结合物在室温下1小时内保持稳定。蛋白质-染料复合物具有很高的消光系数，使

得在测定蛋白质浓度时灵敏度很高，可测微克级蛋白质含量。 【实验试剂和器材】 1.仪器

电子天平、试管、试管架、移液管、容量瓶、721型分光光度剂 2.试剂

（1）标准蛋白质溶液：称取10mg牛血清白蛋白，溶于蒸馏水并定容至100mL，制成100μg/mL牛血清白蛋白溶液

（2）考马斯亮蓝G-250蛋白试剂：称取100mg考马斯亮蓝G-250，溶于50mL90%乙醇中，加入85%的磷酸100mL，最后用蒸馏水定容到1000mL。 （3）2g绿豆芽研磨后的提取液定容至50mL 【实验步骤】 1、标准曲线绘制

取6支试管，按下表加入各试剂。 管号 0 1 2 3 4 5 试剂 100μg/mL牛血清0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 白蛋白溶液／mL 蒸馏水／mL 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0 考马斯亮蓝液／5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 mL 蛋白质含量/μg 0 20 40 60 80 100 加入考马斯亮蓝G-250蛋白试剂后，摇匀，放置2min后，在595nm波长下比色测定，记录A595。以各管相应标准蛋白质含量（mg）为横坐标、A595为纵坐标，绘制标准曲线。 2、样品测定

试管中加自制蛋白质样品1.0mL ，再加入5.0mL考马斯亮蓝G-250试剂，摇匀，放置5min后，在595nm波长下比色，记录A595。 根据所测A595从标准曲线上查得蛋白质含量。

【实验结果】

根据所测样品提取液的吸光度，在标准曲线上查得相应的蛋白质含量（μg），按下式计算：

查得的蛋

白质含量（μg）3提取液总体积（mL） 样品蛋白质含量（μg/g鲜重）= 样品鲜重（g）3测定时取用的提取液体积（mL） 【注意事项】

（1）如果测定要求很严格，可以在试剂加入后的5～20min内测定光吸收，因为在这段时间内颜色是最稳定的。比色反应需在1h内完成。 （2）测定中，蛋白-染料复合物会有少部分吸附于比色杯壁上，实验证明此复合物的吸附量是可以忽略的。测定完后可用乙醇将蓝色的比色杯洗干净。

实验三 糖的性质实验及总糖和还原糖含

量测定

【实验目的】

1.加深对单糖、二糖、多糖化学性质的认识，进一步体会糖类化合物的分子结构与其化学性质的关系。

2. 掌握3，5—二硝基水杨酸法测定还原糖的基本原理。

【实验原理】

糖是多羟基醛、多羟基酮或它们的缩合物。单糖及分子中含有半缩醛（酮）羟基的二糖都具有还原性，能将Fehling试剂 还原

HCOHCOHOCOHHCOHHCOH( )nH2COH还原糖（碱）HCOH( )nH2COH烯二醇（碱）加热COOHOH糖酸COOHOHO2NNO2O2NNH23,5-二硝基水杨酸（黄色）3-氨基-5-硝基水杨酸（棕红色）成砖红色的Cu2O 沉淀。蔗糖等不含有半缩

醛（酮）羟基的糖则无还原性。但蔗糖经水解生成了葡萄糖和果糖，因而水解液具有还原性。多糖是由许多单糖缩合而成的高分子化合物，无还原性。但多糖在酸存在下加热水解，可生成单糖，随之具有还原性。淀粉为一多糖，经水解先生成糊精，再水解成麦芽糖，最终水解产物是葡萄糖，因此水解液也具有还原性，能与Fehling试剂发生反应。淀粉遇碘显蓝色，此反应很灵敏，常用于检

验淀粉或碘。

还原糖在碱性条件下，可变成非常活泼的烯二醇。遇氧化剂时，具有还原能力，烯二醇本身则被氧化成糖酸及其他产物。

黄色的3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂与还原糖在碱性条件下共热后，自身被还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。在一定范围内，反应液里棕红色的深浅与还原糖的含量成正比，在波长为540nm处测定溶液的吸光度，查对标准曲线并计算，便可求得样品中还原糖的含量。

对于非还原性的双糖（如蔗糖）以及还原性很小的多糖（如淀粉），应先用酸水解法将它们彻底水解成单糖。再借助于测定还原糖的方法，可推算出总糖的含量。 【实验试剂和器材】 1.材料 面粉 2.仪器

分光光度计 电子天平 沸水浴 3.器材

试管、容 量 瓶、锥 形 瓶、移 液 管、

烧杯、滴管、洗耳球、漏斗、洗瓶、试管夹 4. 3，5—二硝基水杨酸试剂(DNS)：6.3gDNS 和262mL2mol/LNaOH 加入到500mL 含有185g 酒石酸钾钠的热水溶液中，再加入5g 重蒸酚和5g 亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后加水定容至1000mL，贮存于棕色瓶中。 5. 葡萄糖标准溶液(1mg/mL)：准确称取干燥恒重的葡萄糖100mg，加入少量水溶解后再加以蒸馏水定容至100mL。 【实验步骤】

（一）糖的还原性：取5 支大试管，编号后各加入1ml Fehling试剂，再分别加入2%葡萄糖、2%果糖、2%麦芽糖、2%蔗糖和2%淀粉溶液各10滴。振荡后，将试管用橡皮筋捆好放入沸水浴中，加热3～5分钟，观察那几个试管中生成砖红色沉淀。

（二）蔗糖的水解：取2 支大试管，各加入2%蔗糖溶液1ml，然后于一支试管中加入

-1

3mol?LH2SO4 2滴，将此支试管置于沸水浴中加热5～10 分钟，冷却后，用10%Na2CO3 中和，直到没有气泡发生为止。将两支试管

各加入Fehling试剂1ml，再在沸水浴中加热3～5分钟，观察并比较两管的__________结果。

（三）淀粉与碘的作用：取1 支大试管加10 滴2%淀粉溶液和1滴0.1%碘液，观察呈现的颜色。然后将此试管放入沸水浴中加热5～10 分钟，观察有何现象。

（四）淀粉的水解：取1支大试管，加2%淀粉溶液2mL，再加入浓盐酸3 滴，在沸水浴中加热10～15分钟，加热时每隔1～2分钟取出1滴反应液，置于白瓷滴板上，加1滴碘液，

注意观察其颜色的变化过程，直到无蓝色出现为止。取出试管，冷却后，用10%Na2CO3 中和，直到没有气泡发生为止，加入Fehling试剂5～10滴，然后在沸水浴中加热3～5 分钟，观察结果。

（五）样品中还原糖的提取

称取面粉3.0g 放入100mL三角瓶中，先加入少量水调成糊状，再加50mL 左右水摇匀，置于50℃恒温水浴中保温20min，使还原糖浸出，离心或过滤，用20mL蒸馏水

洗残渣，离心或过滤，将两次上清液全部收集在100mL的容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，混匀，作为还原糖待测液。 （六）样品中总糖的提取

(1) 取材：称取1g面粉，准确记录实际质量（W），放入100mL锥形瓶中。

(2) 溶解：先用几滴蒸馏水调成糊状；加入15mL蒸馏水；再加入10mL 6N HCl，搅匀。 (3) 水解：置于沸水浴中水解30分钟。用玻璃棒取一滴水解液于白瓷板中，加1滴碘液，检查淀粉水解程度。如显蓝色，表明未水解完全，应继续水解。如已水解完全，则不显蓝色，可以取出沸水浴中的锥形瓶，冷却。

(4) 中和：加1滴酚酞指示剂，加入10mL 6N NaOH中和至微红色。 (5) 定容：将溶液转移至100mL容量瓶（B1）中，定容。

(6) 过滤：用滤纸过滤。（注意，滤纸不能用蒸馏水湿润。）

(7) 稀释：精确吸取滤液10mL，移入另一个100mL容量瓶（B2）中，定容。（B2）液

作为总糖待测液备用。

（七） 标准曲线制作及样品测定

取8支试管，按下表所示顺序操作。

空标准葡萄糖浓样品 白 度梯度 管号 ⅠⅡ操作 还0 1 2 3 4 5 总原糖 糖 葡萄糖标准0.0.0.0.1.0 液(mL) 2 4 6 8 0 样品待测液2.1. (mL) 0 0 2.1.1.1.1.1.1.蒸馏水(mL) 0 0 8 6 4 2 0 0 DNS试剂各2.0 (mL) 反应 各管混匀，沸水浴5分钟 以0号管为空白参比，测比色 定?=540nm处的吸光度 记录吸光度 （A540） 将各管摇匀，在沸水浴中加热5min，取出后立即冷却至室温，再以蒸馏水定容至25mL，

混匀。在540nm波长下，用0号管调零，分别读取1-5号管的吸光度。由0～5号管的数据，以葡萄糖含量(mg)为横坐标，A540为纵坐标，在坐标纸上绘制标准曲线。 【实验结果】

1.写出（一）—（四）的观察结果。

2.由A540从标准曲线中求样品管中葡萄糖的含量(mg)；

3.计算你所取的生物材料中还原糖和总糖的百分含量。 【思考题】

1.在样品的总糖提取时，为什么要用浓HCl处理？而在其测定前，又为何要用NaOH中和？2.标准葡萄糖浓度梯度和样品含糖量的测定为什么要同步进行？

实验四 氨基酸的分离鉴定－纸层析法

【实验目的】

通过对氨基酸的分离，学习纸层析法的基本原理及操作方法。 【实验原理】

层析法又称色谱法。1903年，发现用挥发油冲洗菊粉柱时，可将叶子的色素分成许多颜色的层圈。此后，把这种利用有色物质在吸附剂上因吸附能力不同而得到分离的方法称为色谱法（Chromatography）。虽然后来将色谱法应用于无色物质分离，但是这个名字一直沿用下来。

层析法除了吸附层析以外，还有离子交换层析和分配层析。一般认为纸层析是分配层析中的一种，但也并存着吸附和离子交换作用。

分配层析是利用不同的物质在两个互不相溶的溶剂中的分配系数不同而得到分离的。通常用α表示分配系数。

α=

?CS?溶质在固定相的浓度?CL?溶质在流动相的浓度

一个物质在某溶剂系统中的分配系数，在

一定的温度下是一个常数。

纸层析是以滤纸作为惰性支持物的分配

层析，滤纸纤维上的OH基具有亲水性，因此能吸附一层水作为固定相，而通常把有机溶剂作为流动相。有机溶剂自上而下流动，称为下行层析；自下而上流动，称为上行层析。流动相流经支持物时与固定相之间连续抽提，使物质在两相之间不断分配而得到分离。

显然两个物质的分配系数差得越大，则越易分开。纸层析的实际操作是在滤纸的一端（通常距纸边缘2厘米），点上样品，干后，在密闭的容器内，待纸饱和了适当的溶剂蒸气后，令溶剂从有样品的一端经过毛细管的作用，流向另一端，使样品中的混合物得到分离。这种操作常称单向层析。为了得到更好的分离，还可以作双向操作或称双向层析。即在滤纸的一角上点样品，先用一种溶系统展层后，使滤纸干燥，将纸调转90°，再用另一个溶剂系统展层

物质分离后，层析点在图谱上的位置，即在纸上的移动速率，用Rf表示。

离Rf=原点到层析点中心的距 原点到溶剂前沿的距离每一物质的Rf值决定于该物质在两相间的分配系数（α）和两相的体积比（AS/AL）。这两种相即是水（固定相）和有机溶剂（流动相）。 两相体积比在同一实验情况下是不变的，所以R f值的主要决定因素是分配系数（α）。对于某一物质在一条件下的α值是固定的。因此R f值为其特征常数。

现将影响R f值的因素概括如下：

1、物质结构的影响：极性物质是易溶于极性溶剂（水）中，非极性物质是易溶于非极性溶剂（有机溶剂）中，所以物质的极性大小决定了物质在水和有机溶剂之间的分配情况。例如酸性和碱性氨基酸极性大于中性氨基酸，所以前者在水（固定相）中分配较多，因此R f低于后者。

—CH2—基是疏水性基团，如果分子中极性基数目不变，则—CH2—基增加，整个分子的极性就降低，因此易溶于有机溶剂（流动相）中，Rf值亦随之增加，例如氨基酸的R f值：甘氨酸＜丙氨酸＜亮氨酸，二羧基氨基酸中，天冬氨基酸＜谷氨酸。

极性基团的位置不同也会引起R f变化，例如在正丁醇-甲酸-水系统中层析时，α-丙氨酸的R f值大于β-丙氨酸。 2、溶剂的影响：同一物质在不同溶剂中R

选择溶剂系统时应使被分离物质在f值不同，

适当Rf值范围内（0.005到0.85之间），并且不同物质的R f至少差别为0.05才能彼此分开。

溶剂的极性大小也影响物质的Rf值。在用与水互溶的脂肪醇作为溶剂时，氨基酸的Rf值随着溶剂碳原子数目增加而降低。

3、pH的影响：溶剂系统的pH会影响物质极性基团的解离形式，例如氨基酸在酸性或碱性溶剂中变化如下：

对于酸性氨基酸则在酸性时所带净电荷比碱性时少。带电荷越少亲水性越小，因此在酸性溶剂中Rf值较碱性中大。而碱性氨基酸则与此相反。借此性质用酸相和碱相溶剂进行双向层析，可使酸碱性不同的氨基酸达到分离的目的。

溶剂的pH还可影响有机溶剂（流动相）含水量，溶剂酸碱度大，则含水量多。对于

极性物质如（氨基酸）来说Rf值增加，非极性物质则减少。若pH不适合，使同种物质有不同解离形式，其Rf也略有不同，则此物质层析呈带状图谱。因此溶剂中的酸或碱的含量必须足够，并且层析缸（或箱）中用酸或碱的气体饱和才可以防止上述现象，使物质得到圆点状图谱。

4、滤纸的影响：层析滤纸必须质地均匀、紧密，有一定机械强度，并且杂质较少，如

2+2+2+

纸中含有Ca、Mg、Cu等金属离子杂质，可与氨基酸形成络合物使层析图谱出现阴

—1—影，可用稀酸（0.01mol2L或0.4mol2L1

HCl）洗涤滤纸除去之。

5、温度的影响：温度不仅影响物质在溶剂中的分配系数，而且影响溶剂相的组成及纤维素的水合作用。温度变化对Rf值影响很大，所以层析最好在恒温室中进行，控制温度相差不超过±0.5℃。 除上述因素影响Rf值外。样品中含有盐份和其他杂质以及点样过多均会影响样品的有效分离。

无色物质的层析图谱可用光谱法（紫外光

照射）或显色法鉴定，氨基酸层析图谱常用茚三酮或吲哚醌作显色剂。

茚三酮显色反应受温度、pH、时间影响较大，如果要使实验结果能很好重复，必须严格控制上述条件。样品中如含有大量盐酸会使氨基酸不易显色，如含有大量盐时显色点上会出现白斑，此外空气中的杂质如氨、硫化氢或酚等都会影响显色结果。

铜离子可以与氨基酸-茚三酮显色物形成络合物，颜色较稳定。用硫酸酮乙醇溶液洗脱层析后的显色斑点，借比色法可定量测定氨基酸含量。

【实验器材及试剂】 1．器材：

①层析缸②毛细管③喷雾器④培养皿⑤层析滤纸 2．试剂：

①扩展剂：4份水饱和的正丁醇和1份醋酸的混合物。将20毫升正丁醇和5毫升冰醋酸放入分液漏斗中，与15毫升水混合，充分振荡，静置后分层，放出下层水层。取漏斗内的扩展剂约5毫升置于小烧杯中做平

衡溶剂，其余的倒入培养皿中备用。

②氨基酸溶液：0.5%的赖氨酸、脯氨酸、缬氨酸、亮氨酸溶液及它们的混合液（各组份浓度均为0.5%）。

③显色剂：0.1%水合茚三酮丙酮溶液。 【操作步骤】

1．将盛有平衡溶剂的小烧杯置于密闭的层析缸中。

2．取层析滤纸（长18—20厘米，宽14厘米）一张。在垂直于纸的纹路一端距边缘2—3厘米处用铅笔划一条直线，在此直线上每间隔2厘米作一记号，作为点样位置，并用铅笔在点样点下端写出所点氨基酸的名称。

3．点样：用毛细管将各氨基酸样品分别点在这五个位置上。电吹风吹干后再点一次，共点三次。每点在纸上扩散的直径最大不超过3毫米。

4．扩展：用线将滤纸缝成筒状，纸的两边不能接触。将盛有约20毫升扩展剂的培养皿迅速置于密闭的层析缸中，并将滤纸直立于培养皿中，点样的一端在下，扩展剂的

液面需低于点样线1厘米。待溶剂上升15厘米左右时即取出滤纸，用铅笔描出溶剂前沿界线，自然干燥或用吹风机热风吹干。 5．显色：用喷雾器均匀喷上0. 1%茚三酮丙酮溶液；然后置烘箱中烘烤5分钟（100℃）或用热风吹干即可显出各层析斑点。 【结果与讨论】

1．计算出各种氨基酸的Rf值，并根据Rf值鉴定出混合氨基酸中的各组分，在层析图谱上标出各氨基酸名称。

2．对氨基酸移动快慢的原因给予简要分析。

实验五 质粒DNA的提取及检测 【实验目的】

1.掌握碱裂解提取质粒DNA的方法。

2.掌握琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法。 【实验原理】

碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，碱变性抽提质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。在pH值高达12.6的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，

双螺旋结构解开而变性。质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离，当以pH4.8的NaAc/KAc高盐缓冲液去调节其pH值至中性时，变性的质粒DNA又恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质－SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。

细菌质粒是一类双链、闭环的DNA，大小范围从1kb至200kb以上不等。各种质粒都是存在于细胞质中、独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份，通常情况下可持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下也会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。

质粒已成为目前最常用的基因克隆的载体分子，重要的条件是可获得大量纯化的质粒DNA分子。目前已有许多方法可用于质粒DNA的提取，本实验采用碱裂解法提取质粒DNA。

【实验材料】

1.含pUC19质粒的大肠杆菌，1.5ml塑料离心管, 离心管架，枪头及盒、卫生纸。 2.微量移液器(20μl,200μl,1000μl)， 台式高速离心机，恒温振荡摇床， 高压蒸汽消毒器(灭菌锅)， 涡旋振荡器，恒温水浴锅，双蒸水器，冰箱，等。 【实验试剂】

1.LB液体培养基：称取蛋白胨(Tryptone)10 g，酵母提取物(Yeast extract) 5g，NaCl 10g，溶于800ml蒸馏水中，用NaOH调pH至7.5，加水至总体积1升，高压下蒸气灭菌15分钟。

2. 氨苄青霉素(Ampicillin, Amp)母液：配成 100mg/ml水溶液，-20℃保存备用。

3. 溶液Ⅰ：50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl(pH 8.0)，10mM EDTA(pH 8.0）。 配制方法：1M Tris-HCl(pH 8.0）12.5ml，0.5M EDTA（pH 8.0）10ml，葡萄糖4.730g，加ddH2O至500ml。在121℃高压灭菌15min ，贮存于4℃。

4. 溶液Ⅱ：0.2M NaOH，1% SDS。

配制方法：2M NaOH 1ml，10%SDS 1ml，加ddH2O至10ml。使用前临时配置。

5. 溶液Ⅲ：醋酸钾（KAc）缓冲液，pH 4.8。 配制方法：5M KAc 300ml，冰醋酸 57.5ml，加ddH2O至500ml。4℃保存备用。 6. 苯酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）。氯仿可使蛋白变性并有助于液相与有机相的分开，异戊醇则可起消除抽提过程中出现的泡沫。酚和氯仿均有很强的腐蚀性，操作时应戴手套。

7. 无水乙醇； 8. 70%乙醇；

9. TE：10mM Tris-HCl(pH 8.0)，1mM EDTA(pH 8.0)。

配制方法：1M Tris-HCl（pH 8.0）1ml，0.5M EDTA（pH 8.0）0.2ml，加ddH2O至100ml。121℃高压湿热灭菌20min，4℃保存备用。 1M Tris Cl（Tris(三羟甲基)氨基甲烷）：800ml H2O中溶解 121g Tris碱，用浓盐酸调pH值，混匀后加水到1L；

0.5M EDTA（乙二胺四乙酸）：700ml H2O中溶解186.1g Na2EDTA.2H2O，用10M

NaOH调 pH8.0(需约50ml)， 补H2O到 1L。 【实验步骤】

1. 挑取LB固体培养基上生长的单菌落，接种于20ml LB（含Amp100ug/ml）液体培养基中，37℃、250rmp振荡培养过夜（约12-14hr）。

2. 取1.5ml培养液倒入1.5ml eppendorf管中，12000rmp离心1-2min。弃上清，将离心管倒置于卫生纸上，使液体尽可能流尽。 3、菌体沉淀重悬浮于100μl溶液Ⅰ中(需剧烈振荡，使菌体分散混匀。),室温下放置5-10 min。

4、加入新配制的溶液Ⅱ200μl，盖紧管口，快速温和颠倒eppendorf管数次，以混匀内容物(千万不要振荡)，冰浴5 min，使细胞膜裂解（溶液Ⅱ为裂解液，故离心管中菌液逐渐变清）。

5、加入150μl预冷的溶液Ⅲ，盖紧管口，将管温和颠倒数次混匀，见白色絮状沉淀，可在冰上放置5min。12000rmp离心10min。溶液Ⅲ为中和溶液，此时质粒DNA复性，染色体和蛋白质不可逆变性，形成不可溶复

合物，同时K+使SDS-蛋白复合物沉淀。 6、上清液移入干净eppendorf管中，加入等体积的酚/氯仿/异戊醇，振荡混匀, 12000rmp离心10min。（450μl的苯酚/氯仿/异戊醇。） 7、小心移出上清于一新微量离心管中，加入2倍体积预冷的无水乙醇，混匀，室温放置 2-5min，离心12000rmp310min。

8、弃上清，将管口敞开倒置于卫生纸上使所有液体流出，加入1ml 70％乙醇洗沉淀一次，12000rmp离心5 min。

9、 吸除上清液，将管倒置于卫生纸上使液体流尽，室温干燥。

10、将沉淀溶于20μl TE缓冲液中。 11、用琼脂糖凝胶电泳检测。 【注意事项】

1.提取过程应尽量保持低温。

2.沉淀DNA通常使用冰乙醇，在低温条件下放置时间稍长可使DNA沉淀完全。沉淀DNA也可用异丙醇(一般使用等体积)，且沉淀完全，速度快，但常把盐沉淀下来，所以多数还是用乙醇。

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